小熊貓糞便中纖維素降解菌株的篩選、基因改造及生物合成聚羥基丁酸酯條件的優(yōu)化

劉童童，盧晨曦，原楚妍，陳 怡，吳 弘

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

纖維素是一種廉價(jià)且分布廣泛的多糖物質(zhì)，是世界上最豐富的可再生資源.纖維素分解菌可高效、安全、無污染地將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖、乙醇等產(chǎn)品，既可以解決環(huán)境污染，也可以緩解能源危機(jī)及浪費(fèi)等問題[1].細(xì)菌纖維素分解菌的發(fā)掘及基因組學(xué)研究是高效利用纖維素的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在已研究的眾多菌株篩選來源中，食草動(dòng)物由于食性與纖維素的關(guān)系密切，其消化道和糞便等都成為篩選纖維素降解細(xì)菌的重要菌種來源[2-4].雖然通過不同途徑獲得了一些可以降解纖維素的菌株，但很多菌株的酶活低、環(huán)境適應(yīng)性差，因此，分離和篩選可工業(yè)化生產(chǎn)的菌株仍然是纖維素分解利用的重要研究方向.纖維素降解菌的高值化利用也是纖維素研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)課題，其中，利用纖維素降解菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯（PHB）是新的研究方向.PHB可以在微生物體內(nèi)積累，具有與傳統(tǒng)塑料相似的力學(xué)性質(zhì)，還具有獨(dú)特的生物降解性，有助于解決“白色污染”問題[5].在微生物體內(nèi)，共有3個(gè)酶參與PHB合成：β-酮基硫解酶（PhaA）、依賴I-DPH的乙酰乙酰輔酶A還原酶（PhaB）和PHA合成酶（PhaC）[6].研究人員將羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutropha）中PHB代謝途徑的3個(gè)基因phaA、phaB、phaC克隆出來，將其整合到1個(gè)質(zhì)粒上并提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，構(gòu)建能夠以葡萄糖為底物合成PHB的重組菌[7].葡萄糖價(jià)格偏高，如果發(fā)掘出能夠以纖維素為底物的菌株合成PHB，將有助于提高菌株的高值化開發(fā)，促進(jìn)可降解塑料的推廣.

小熊貓（Ailurus fulgens）以富含纖維素的竹子為食物，體內(nèi)存在有助于消化纖維素的微生物，因此可以作為篩選纖維素降解菌的研究對(duì)象，從其糞便中發(fā)掘產(chǎn)纖維素酶的菌株[8].本研究從小熊貓糞便中篩選出能夠高效分解纖維素的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析方法，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定.以來自羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutropha）的基因?yàn)槟０澹瑢HB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC轉(zhuǎn)入到菌株中，得到重組菌株.以玉米秸稈為碳源進(jìn)行重組菌株合成PHB的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，用響應(yīng)面分析確定重組菌株生物合成PHB的最優(yōu)條件，包括溫度、培養(yǎng)起始pH值、搖床轉(zhuǎn)速等.本研究一方面拓展了已有的可分解纖維素的菌種資源庫(kù)；另一方面，能夠?yàn)槔昧畠r(jià)碳源生物合成PHB提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)樣品來源于天津市動(dòng)物園，對(duì)小熊貓飲食及健康狀況進(jìn)行篩選后，獲得新鮮的小熊貓糞便.

1.2 主要儀器與試劑

儀器：GC-2014C型氣象色譜儀，日本島津公司；Hitachi HF5000型透射電鏡，日本日立公司.

試劑：DNA聚合酶，美國(guó)NEB公司；蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；3HB標(biāo)準(zhǔn)品，北京藍(lán)晶微生物科技有限公司.引物和測(cè)序工作由華大基因完成.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

選取小熊貓糞便樣品的中間部分，稱取10 g，將其放入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，連續(xù)搖動(dòng)20 min，搖晃充分以制備菌懸液，隨后進(jìn)行平板篩選以獲得單一菌落.

1.3.2 菌株篩選

將富集培養(yǎng)的單一菌液涂布在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）初篩培養(yǎng)基上，待菌落生長(zhǎng)至適宜大小后，用1%的剛果紅染色20 min，用濃度為1 mol/L的NaCI溶液徹底沖洗去染料，觀察透明圈是否有變化.選取培養(yǎng)基上較完整的菌落進(jìn)行測(cè)量，記錄透明圈直徑D和菌落直徑d，計(jì)算比值D/d.對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行橫向比較，篩選比值較大的實(shí)驗(yàn)對(duì)象[9].

1.3.3 纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定（DNS法）

菌株接種入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣，留上清液作為粗酶液.以1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作為底物，測(cè)定OD540值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體原理參考文獻(xiàn)[9-10].

1.3.4 濾紙分解實(shí)驗(yàn)

取多條大小相同的濾紙條于錐形瓶中，將菌液滴加到以濾紙條為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中（菌液應(yīng)沒過濾紙條，使之充分分解），空白對(duì)照組為不接種菌株的培養(yǎng)液.搖床連續(xù)培養(yǎng)后記錄，確定濾紙分解情況[10].

1.3.5 菌株的鑒定

細(xì)菌在含有CMC-Na的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間后，觀察并記錄菌落的形狀、大小、透明度、顏色、質(zhì)地等.采用革蘭氏染色法，借助顯微鏡觀察細(xì)菌的大小、結(jié)構(gòu)，記錄其形態(tài)和染色特征.菌株的生理生化性質(zhì)描述參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11].挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)后，以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行基因擴(kuò)增：上游引物16S（F）為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物16S（R）為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.擴(kuò)增后進(jìn)行序列分析[10，12].

1.3.6 PHB合成途徑構(gòu)建及檢測(cè)

以來自羅氏真養(yǎng)菌的基因?yàn)槟０?，將PHB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC構(gòu)建在表達(dá)質(zhì)粒pBBR1-mcs1中，得到重組質(zhì)粒3hb.隨后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到篩選出來的菌株中，合成了一條從碳源到PHB的代謝途徑.

以玉米秸稈為碳源進(jìn)行菌株合成PHB的發(fā)酵實(shí)驗(yàn).在不同發(fā)酵階段取樣，測(cè)定發(fā)酵液的干重和其中PHB的含量.取菌液，離心富集后用去離子水反復(fù)洗滌以得到較干凈的菌體，采用氣相色譜法（GC）分析菌體中的PHB含量.以3HB標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，先將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品一起進(jìn)行酯化，隨后進(jìn)行氣相色譜分析，采用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確計(jì)算出菌體中PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）[13].利用透射電鏡觀察PHB顆粒在菌株中的分布情況.首先在菌液中加入戊二醛固定細(xì)菌，然后進(jìn)行預(yù)處理，制備切片，鍍膜進(jìn)行觀察.

1.3.7 響應(yīng)面曲線分析

基于Box-Behnken Design（BBD）原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，影響細(xì)菌生長(zhǎng)的因素包括培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）和搖床轉(zhuǎn)速（C），將其設(shè)置為高、中、低3個(gè)水平（1，0，-1）.通過Design Expert 8.0進(jìn)行擬合，再利用方差分析和顯著性分析確定優(yōu)化模型在本實(shí)驗(yàn)中的可靠性.比較計(jì)算得出理論最優(yōu)產(chǎn)量，進(jìn)一步驗(yàn)證培養(yǎng)條件優(yōu)化的準(zhǔn)確性[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

利用剛果紅染色法從小熊貓糞便中初篩得到5株菌.首先測(cè)定透明圈直徑，隨后以CMCase酶活為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩.繪制得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.669 5 x+0.020 5（R2=0.999 8），其中x為葡萄糖的質(zhì)量，y為540 nm處的OD值.利用該方法測(cè)定初篩得到的5株菌，其透明圈直徑、CMCase酶活等如表1所示.

表1 篩選菌株的D/d值與CMCase酶活Tab.1 D/d values and CMCase enzyme activity ofscreened strains

由表1可知，N8菌株的D/d值為4.21，測(cè)定的CMCase酶活為16.35 U/mL，遠(yuǎn)大于其他菌株的酶活性，表現(xiàn)出較高的產(chǎn)纖維素酶的能力.

N8菌株的菌落形態(tài)特征如圖1（a）所示，在培養(yǎng)基上，N8菌株的菌落扁平，呈不透明狀，顏色為灰白色無光澤，表面粗糙不光滑，邊緣不規(guī)則，質(zhì)地為蠟狀.對(duì)N8菌株進(jìn)行生理生化檢測(cè)，結(jié)果顯示：革蘭氏染色、芽孢染色、V-P實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；硫化氫、甲基紅、吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；待測(cè)菌株可利用葡萄糖、淀粉和羧甲基纖維素鈉，不能利用蔗糖.對(duì)N8菌株進(jìn)行DNA提取，利用16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到1.5 kb的片段，如圖1（b）所示.對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行測(cè)序后，在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA7.0進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.結(jié)合N8菌株形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA分子鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N8菌株近緣物種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），相似度高達(dá)99%，因此初步認(rèn)定篩選出的是一株芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis-N8.

圖1 N8菌株的剛果紅染色和16S rDNA PCRFig.1 Results of Congo red staining and 16S rDNA of Strain N8

對(duì)初篩得到的5株菌進(jìn)行濾紙條降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，5株菌中N8菌株對(duì)濾紙條的降解效果最好.在實(shí)驗(yàn)開始后的第8天，濾紙條出現(xiàn)結(jié)構(gòu)崩解現(xiàn)象，培養(yǎng)基從澄清狀態(tài)變得稍顯渾濁.在實(shí)驗(yàn)開始后的第12天，培養(yǎng)基中濾紙條邊緣潰爛，濾紙條由一整片分解為3塊面積不等的碎片，結(jié)構(gòu)明顯崩解，培養(yǎng)基中出現(xiàn)濾紙條崩解后的碎屑，培養(yǎng)基渾濁情況加劇.在實(shí)驗(yàn)開始的第15天，濾紙條完全降解為碎屑狀態(tài)，培養(yǎng)基狀態(tài)較濾紙條崩解的初期出現(xiàn)絮狀物質(zhì).實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基顏色變深，渾濁程度繼續(xù)加劇，濾紙條徹底降解完畢，全部為碎屑狀態(tài)，無明顯塊狀.

2.2 構(gòu)建可合成PHB的重組菌株

配制以葡萄糖、大麥秸稈、玉米秸稈等為單一碳源的產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)后通過測(cè)定CMCase酶活來檢測(cè)利用效率，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，以玉米秸稈為單一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力最高，且價(jià)格低廉，可作為N8菌株的最佳碳源.

圖2 不同碳源下N8菌株產(chǎn)纖維素酶的活性Fig.2 CMCase activity produced by strain N8 using different carbon sources

構(gòu)建可合成PHB的重組質(zhì)粒3hb，隨后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到N8菌株中，得到重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb），培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以玉米秸稈為碳源，觀測(cè)菌體內(nèi)PHB的積累情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，重組菌株體內(nèi)開始積累PHB，如圖3所示.

圖3 重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）中PHB的合成Fig.3 Synthesis of PHB in recombination strain Bacillus subtilis-N8（3hb）

2.3 PHB的合成及響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

選取菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）發(fā)酵條件中的溫度、培養(yǎng)起始pH值、搖床轉(zhuǎn)速3個(gè)因素作為響應(yīng)面法的研究對(duì)象，設(shè)計(jì)各因素水平如表2所示.用軟件Design Expert 8.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，以PHB產(chǎn)量作為實(shí)驗(yàn)的衡量指標(biāo)，17組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表3所示.

表2 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.2 BBD experimental design factor level

表3 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 BBD experimental design and experimental results

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用軟件Design Expert 8.0進(jìn)行分析，得出回歸線方程：

PHB產(chǎn)量（g/L）=14.30-1.40A+0.41B-0.21C+0.35AB-0.45AC+0.12BC-4.09A2-2.21B2-0.61C2

2.3.1 方差分析

進(jìn)一步通過方差分析來確定模型擬合度是否顯著以及單一因素和每2個(gè)因素間的相互作用是否顯著，結(jié)果如表4所示.在分析過程中，P<0.05表示相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所得回歸擬合度P值為0.002 9，小于0.05，該模型回歸顯著性好，說明重組菌中PHB的產(chǎn)量與設(shè)置的實(shí)驗(yàn)因素之間存在明顯的回歸關(guān)系.失擬值P值為0.195 7，大于0.05，說明模型的失擬不顯著.此外，該模型的實(shí)驗(yàn)系數(shù)為0.929 2，表明回歸方程求得的PHB產(chǎn)量預(yù)測(cè)值的可信度為92.92%.對(duì)P值的分析表明，溫度因素對(duì)PHB產(chǎn)量影響顯著，培養(yǎng)起始pH值和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PHB產(chǎn)量的影響不顯著.而相互作用分析發(fā)現(xiàn)：AB、AC、BC相互作用不顯著；A2、B2二次項(xiàng)作用顯著，C2二次項(xiàng)作用不顯著.

表4 BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.4 Analysis of BBD experimental results

2.3.2 響應(yīng)面3D圖與平面等高線

利用Design-Expert，以2個(gè)因素間的交互作用繪制出響應(yīng)面圖和等高線圖，響應(yīng)面曲面上凸，說明有最大響應(yīng)值以及最適的變量；等高線為橢圓形，說明2個(gè)因素的交互作用顯著.溫度與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖如圖4所示.從圖4可以看出，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速固定不變，溫度在35.0~37.5℃區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在6~7區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而升高，呈正相關(guān).當(dāng)溫度在37.5~40.0℃區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在7~8區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而降低，呈負(fù)相關(guān).

圖4 溫度與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of the interaction between temperature and initial pH

溫度與搖床轉(zhuǎn)速的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5所示.

圖5 溫度與搖床轉(zhuǎn)速的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the interaction between temperature and shaking speed

從圖5可以看出，當(dāng)培養(yǎng)起始pH值固定不變，溫度在35.0~37.5℃區(qū)間、搖床轉(zhuǎn)速在100~150 r/min區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而升高，呈正相關(guān).當(dāng)溫度在37.5~40.0℃區(qū)間、搖床轉(zhuǎn)速在150~200 r/min區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而降低，呈負(fù)相關(guān).

搖床轉(zhuǎn)速與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖如圖6所示.

圖6 培養(yǎng)起始pH值與搖床轉(zhuǎn)速的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the interaction between the initial pH and shaking speed

從圖6可以看出，當(dāng)溫度固定不變，搖床轉(zhuǎn)速在100~150 r/min區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在6~7區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而升高，呈正相關(guān).當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在150~200 r/min區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在7~8區(qū)間時(shí)，PHB產(chǎn)量隨二者的升高而降低，呈負(fù)相關(guān).

對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行求導(dǎo)分析，結(jié)果顯示，溫度為37.09℃、培養(yǎng)起始pH值為7.08、搖床轉(zhuǎn)速為144.72 r/min的情況下，PHB的產(chǎn)量最高，預(yù)計(jì)達(dá)到14.44 g/L.為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，用得到的最優(yōu)條件對(duì)菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）進(jìn)行液體發(fā)酵驗(yàn)證，最終PHB產(chǎn)量為15.98 g/L，與預(yù)測(cè)值14.44 g/L較為接近，說明此響應(yīng)面模型可信.因此，通過響應(yīng)面法對(duì)重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化是可行的.

3 討論與結(jié)論

本研究采用剛果紅染色法從小熊貓的糞便中篩選出具有纖維素降解能力的菌株，根據(jù)染色形成的透明圈大小初步判斷細(xì)菌降解纖維素的能力，復(fù)篩時(shí)測(cè)定纖維素酶活力并進(jìn)行濾紙分解實(shí)驗(yàn)，最后結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus subtilis相似度高達(dá)99%，因此確認(rèn)菌株為Bacillus subtilis-N8.以來自羅氏真養(yǎng)菌的基因?yàn)槟０?，將PHB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC轉(zhuǎn)入到N8菌株中，得到可以合成聚羥基丁酸酯（PHB）的重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）.有研究證明微生物以半纖維素水解物為碳源可以生產(chǎn)PHB.如Yu等[15]利用蔗渣水解液生產(chǎn)PHB，其產(chǎn)量可占干細(xì)胞質(zhì)量的57%.Dietrich等[16]利用半纖維素水解物和木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物作為碳源進(jìn)行PHB生產(chǎn)，最高產(chǎn)量為5.72 g/L.半纖維素水解物常常會(huì)帶有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，因此需要進(jìn)行脫毒處理或高接種量來克服抑制作用，以維持細(xì)菌生長(zhǎng).本研究篩選出的能夠利用玉米秸稈為碳源生產(chǎn)PHB的菌株，因無需對(duì)纖維素水解液進(jìn)行脫毒處理，可大大降低PHB的合成成本.

為了進(jìn)一步探索重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）的最適發(fā)酵條件，利用響應(yīng)面法，選取溫度、培養(yǎng)起始pH值和搖床轉(zhuǎn)速3個(gè)因素作為研究對(duì)象，優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)果顯示在溫度37.09℃、培養(yǎng)起始pH值為7.08、搖床轉(zhuǎn)速為144.72 r/min的培養(yǎng)條件下，菌株具有最高的PHB產(chǎn)量（15.98 g/L），遠(yuǎn)超過Dietrich等[16]的研究中PHB的產(chǎn)量.本研究發(fā)現(xiàn)的新菌株為纖維素的開發(fā)和利用提供了良好的菌種資源，也為利用纖維素等廉價(jià)碳源合成高附加值的PHB材料提供了新途徑.