對蝦白斑綜合征病毒快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

馬超 楊莉莉 鄭秋月 鄭文杰 曹際娟*

（1.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧 大連 116600；2.天津師范大學(xué)）

1 前言

對蝦白斑病（White Spot Disease，WSD），是由對蝦白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）引發(fā)的一種嚴(yán)重綜合性傳染性疾病[1]。WSSV屬線頭毒科目 （Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），是一種快速復(fù)制、毒性極強(qiáng)的蝦病原體，已在全球出現(xiàn)并成為最普遍和廣泛的病毒之一[2]。由于其具有發(fā)病急、死亡率高、死亡速度快的特點(diǎn)，多年來一直嚴(yán)重威脅著全世界對蝦的養(yǎng)殖安全。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為強(qiáng)制通報(bào)水生動(dòng)物疫病，亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心（NACA）將其列為強(qiáng)制通報(bào)疫病[3]，我國農(nóng)業(yè)部在2008年將其列為一類動(dòng)物疫病。

WSSV的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)迄今為止尚未被完全了解。在顯微鏡下可觀察到，WSSV病毒粒子從桿狀到卵圓形橢圓狀，帶有3層囊膜，在一端有長包膜延伸，粒子尺寸范圍較大（80 nm～120 nm×250 nm～380 nm）。病毒包膜有6～7 nm厚，病毒粒子為桿狀，包含雙鏈DNA[4]。WSSV病毒具有毒力強(qiáng)、發(fā)病急、復(fù)制速度快、傳播力度強(qiáng)、致死率高等特點(diǎn)，患病的蝦從出現(xiàn)癥狀至死亡只有3～5 d的時(shí)間，甚至更短[5]。感染W(wǎng)SSV的蝦在外骨骼、附屬物和表皮內(nèi)會(huì)迅速出現(xiàn)大小不等的白色斑點(diǎn)（直徑約0.5～3.0 mm），因此取名為白斑綜合征。

2 流行現(xiàn)狀

1921年，中國臺(tái)灣首次發(fā)現(xiàn)WSD，之后蔓延至其他亞洲國家。美洲首例確診的WSSV病例于1995年在美國德克薩斯州被發(fā)現(xiàn)[6]。此病的感染率較高，約7 d可使池中70%以上的蝦被感染，甚至死亡。這種流行性病毒性疾病的爆發(fā)，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。此病毒可以通過水域大范圍傳播，傳染性強(qiáng)，一旦水中有病蝦，病蝦的排泄物及其他身體組織會(huì)迅速擴(kuò)散，將此范圍的水域污染，同水域的所有正常對蝦及其他蝦類[8]，如小龍蝦等都有可能受到感染[9]。人工感染實(shí)驗(yàn)證明，通過注射、投食、浸泡3種感染方式均能造成WSSV的感染。可見WSSV的感染性極強(qiáng)，因此對WSD的防治工作勢在必行。

3 WSSV的基因組信息及主要結(jié)構(gòu)蛋白

對WSSV的基因組及蛋白質(zhì)的鑒定，有助于研究人員了解WSSV的裝配形式和入侵機(jī)理。目前在GenBank公布的WSSV的基因組序列已有8株[10]。WSSV病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要包括核衣殼蛋白、囊膜蛋白和被膜蛋白，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白大多是一些催化、調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的酶類和調(diào)控蛋白。目前已經(jīng)鑒定的蛋白主要有核衣殼蛋白VP15[11]，在病毒粒子的囊膜蛋白中占比較高的VP19[12]蛋白，從純化的WSSV中分離鑒定而得到一種結(jié)構(gòu)蛋白VP24[13]。還有作為粘附蛋白的VP26[14]，此蛋白能夠?qū)⒉《菊掣接谒拗骷?xì)胞上，從而幫助病毒感染宿主，且VP26在病毒粒子中與其它結(jié)構(gòu)蛋白相比含量較高。囊膜相關(guān)蛋白VP28[15-16]也是非常重要的，它能夠在脫離病毒狀態(tài)下，單獨(dú)和宿主細(xì)胞發(fā)生結(jié)合。除此之外，還有在WSSV感染宿主時(shí)能夠起到一定中和作用的VP31[17]囊膜蛋白及VP32[18]、VP33[19-20]等WSSV病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。

4 WSSV的檢測技術(shù)

目前，針對對蝦暴發(fā)性流行病的病理學(xué)、病原學(xué)、診斷學(xué)及流行病學(xué)的研究已深入至分子水平。但由于WSSV具有細(xì)胞內(nèi)寄生的特性，是通過水生途徑傳播且尚無有效藥物，因此，到目前為止還不能完全控制WSSV的疫情。當(dāng)前最主要的措施是及早發(fā)現(xiàn)和消滅傳染源，果斷切斷傳播途徑，在對蝦養(yǎng)殖過程中實(shí)施早期診斷和提前預(yù)防的策略，以建立完善準(zhǔn)確、高效、靈敏、快捷、方便的檢測方法。常用的檢測技術(shù)主要包括組織病理學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。

4.1 組織病理學(xué)診斷技術(shù)

組織病理學(xué)診斷是比較傳統(tǒng)的檢測方法，主要以染色組織病理學(xué)檢測法為主，通過電子顯微鏡觀察細(xì)胞核是否腫大和核內(nèi)嗜酸兩性著色病變來進(jìn)行判斷，比較直觀。但該方法操作較為繁瑣、靈敏度較低，且易受時(shí)間、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和人員的限制，還可能出現(xiàn)漏檢的情況，實(shí)用性較差，不宜應(yīng)用于現(xiàn)場檢測[21]。

4.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

4.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是利用抗體分子能夠與抗原分子特異性共價(jià)結(jié)合的特點(diǎn)，將游離的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白相結(jié)合，并利用特殊的標(biāo)記物對其定性或定量分析的一種檢測方法。該技術(shù)建立在抗原抗體反應(yīng)上，能夠應(yīng)用于大批量檢測，在發(fā)病前20余天就可以做出預(yù)測，對儀器的要求較低，在實(shí)際應(yīng)用中具有廣闊的前景。但是制備多克隆抗體或單克隆抗體的過程較為繁瑣、歷時(shí)較長，且容易被污染而產(chǎn)生假陽性[22]。

XIE X等[23]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了WSSV的58種結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)現(xiàn)其中至少7種囊膜蛋白與病毒的侵染過程相關(guān)。

鄭曉聰?shù)萚24]用純化的表達(dá)蛋白VP28制備了單克隆抗體與多克隆抗體，成功建立了檢測WSSV的雙抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化后的ELISA法與早期檢測技術(shù)相比，能夠更大程度地保證檢測的準(zhǔn)確性。

Tang Xiaoqian等[25]對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）定量檢測WSSV進(jìn)行優(yōu)化。此研究中建立了WSSV對數(shù)濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出在120～7 680 ng/mL范圍內(nèi)兩者呈線性關(guān)系，定量測定了人工感染W(wǎng)SSV后螯蝦不同組織中的病毒蛋白，可檢測感染小龍蝦從感染初期至死亡階段的WSSV傳播情況，為WSSV的診斷提供了參考。

4.2.2 膠體金試紙法

膠體金試紙法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。自1971年FAULK和TAYTOR將膠體金引入免疫化學(xué)，此方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，具有很好的特異性，且陰陽性顯色更明顯，肉眼更容易判斷[26]。

張玲等[27]通過復(fù)蘇WSSV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2，利用辛酸-硫酸銨法純化腹水單抗。選擇單抗2E6作為金標(biāo)抗體，以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，通過膠體金標(biāo)記單抗2E6制備金標(biāo)抗體，整個(gè)過程僅需要10 min，且無需專業(yè)儀器設(shè)備，通過肉眼即可觀察檢測結(jié)果，對養(yǎng)殖現(xiàn)場的蝦類、蟹類等甲殼類生物WSSV的半定量快速檢測適用性較好，但對因操作不當(dāng)?shù)犬a(chǎn)生的假陽性問題還需進(jìn)一步優(yōu)化。

4.3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

應(yīng)用核酸探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法[28]和原位雜交法[29]對WSSV進(jìn)行檢測是早期在分子生物學(xué)領(lǐng)域較為常用的方法，但這類方法耗時(shí)長、操作繁瑣，且可能存在非特異性標(biāo)記，不適宜在基層使用。之后通過不斷優(yōu)化，該技術(shù)更加成熟，常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要有套式PCR、熒光PCR、LAMP和RPA等。

4.3.1 套式PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制[30]。1985年美國科學(xué)家穆利斯發(fā)明了PCR技術(shù)，并于1993年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。目前我國的國家標(biāo)準(zhǔn)是采用套式PCR檢測技術(shù)[31]，套式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)，使用2對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，以第1步PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，將第2對引物結(jié)合在第1步PCR產(chǎn)物的內(nèi)部。該方法與一步PCR相比，靈敏性、特異性更高，但存在著操作繁瑣、易交叉污染等問題。

李文杰等[32]根據(jù)GenBank中已發(fā)表的3株WSSV的VP28基因序列，建立了檢測克氏原螯蝦WSSV的套式PCR方法。該方法第1輪擴(kuò)增的敏感性是36 ng，第2輪擴(kuò)增的敏感性是36 pg，其靈敏度比一步PCR提高了1 000倍，具有更高的檢測靈敏度和應(yīng)用前景。但該方法也容易出現(xiàn)假陽性，常雯等[33]對套式PCR方法出現(xiàn)假陽性的原因進(jìn)行分析并提出控制措施。

4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是指在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，保證PCR反應(yīng)時(shí)熒光信號(hào)的增加和PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的同步性，由于其在每輪循環(huán)時(shí)，都能檢測1次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，因此能夠在實(shí)現(xiàn)監(jiān)測熒光信號(hào)累積的同時(shí)，對PCR全程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。

Xian-Hong Meng等[34]采用TaqMan實(shí)時(shí)PCR法，對不同生長季節(jié)的南美白對蝦的WSSV感染情況進(jìn)行調(diào)查，初步發(fā)現(xiàn)，在蝦群中病毒載量為103copies/ng時(shí)，會(huì)引發(fā)WSSV的爆發(fā)。

陳蒙蒙[35]針對凡納濱對蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridescent Virus，SHIV）病原建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其靈敏度能夠達(dá)到4 copies SHIV/μL DNA，可以應(yīng)用于臨床采集對蝦樣品和人工感染對蝦樣品的檢測。該方法檢測靈敏度很高，對研究建立檢測WSSV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有借鑒和指導(dǎo)作用。

4.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是指在等溫（60℃～65℃）條件下，短時(shí)間（通常是1 h內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，和常規(guī)PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，是一種具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場、基層快速檢測等特點(diǎn)的全新的核酸擴(kuò)增方法[36]。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方面能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，且檢測成本低于熒光定量PCR。

KONO等[37]于2004年首次應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測WSSV，采用2組引物擴(kuò)增WSSV基因組的235 bp靶標(biāo)片段，檢測靈敏度能夠達(dá)到10 fg。

李紅梅等[38]選取WSSV的囊膜蛋白VP28基因?yàn)榘袠?biāo)，利用ESE-Quant tube scanner檢測平臺(tái)建立了一套基于LAMP的實(shí)時(shí)熒光檢測方法。結(jié)果顯示，對于傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌O1和O139等5種病原DNA，該方法具有很好的WSSV檢測特異性。與瓊脂糖凝膠電泳檢測法以及ZHU F等[39]建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR等檢測方法相比，具有相同的靈敏度，結(jié)果表明，在1.365×104～1.129×109copies/μL濃度范圍內(nèi)，可檢測到WSSV拷貝數(shù)，105稀釋組（1.524×105copies/μL）死亡率為60%。但在樣品模板不純的情況下，該方法可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增曲線傾斜向上等假性結(jié)果現(xiàn)象。

張娜等[40]針對WSSV和IHHNV病毒建立了雙重LAMP檢測方法，采用熒光目測觀察和電泳分析2種方法對結(jié)果進(jìn)行判定，靈敏度結(jié)果顯示，該方法的最低檢測限為100 fg，熒光顯色目測判定方法的最低檢測限為1 pg，優(yōu)于周國勤等[32]建立的套式PCR方法（36 pg）。但該方法無法將2種感染病毒加以區(qū)分，且熒光目測觀察極易出現(xiàn)假陽性。

吳麗云等[41]利用鈣黃綠素作為檢測指示劑，建立了可視化LAMP快速檢測WSSV的方法，最低檢測限可達(dá)到0.225～2.250 copies/μL，此方法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需求，但是該方法的靈敏度是基于純化的陽性質(zhì)粒，而實(shí)際感染病毒樣本的核酸存在著諸多抑制因子，可能會(huì)影響實(shí)際檢測結(jié)果。

4.3.4 重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測技術(shù)（RPA）

重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被 稱 為 是 可 以 替 代PCR的核酸檢測方法，其最大優(yōu)勢是可以在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR相比，RPA引物堿基數(shù)更多，引物解鏈溫度對擴(kuò)增性能影響很小[42]。

夏小明等[43]選定Vp28作為WSSV檢測重組質(zhì)粒的靶標(biāo)序列，利用RPA技術(shù)建立的檢測方法的最低檢測限約為2.250～0.225 copies/μL，具有較高特異性且無交叉反應(yīng)，適用于養(yǎng)殖對蝦的現(xiàn)場監(jiān)測，但是該方法的穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

Thawatchai等[44]將CRISPR-Cas12a熒光檢測技術(shù)與快速核酸擴(kuò)增相結(jié)合，對WSSV的Vp28質(zhì)粒進(jìn)行檢測，研究中構(gòu)建的RPA-Cas檢測方法的最低檢測限為200拷貝數(shù)/反應(yīng)，且特異性較好，無交叉反應(yīng)出現(xiàn)。該方法在恒溫條件下即可進(jìn)行，無需專用儀器，可通過便攜式熒光分光光度計(jì)或暴露在紫外線下實(shí)現(xiàn)可視化，適用于現(xiàn)場監(jiān)測。

5 結(jié)論

人類對甲殼類病毒的研究歷史不長，目前約60年，特別是對養(yǎng)殖蝦類的病毒病害研究歷史更短。本文通過分析WSD的流行現(xiàn)狀，主要介紹了WSSV檢測技術(shù)的研究進(jìn)展及其特點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有方法仍然會(huì)有因操作不當(dāng)?shù)纫蛩爻霈F(xiàn)特異性、靈敏度、易污染等問題，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需要建立更多檢測方法以相互對比驗(yàn)證。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，需要更適合現(xiàn)場操作、可視化的快速檢測技術(shù)。今后對WSSV檢測技術(shù)的研究依然是以分子生物學(xué)水平為主，借助多方快檢技術(shù)相互驗(yàn)證、核酸提取與擴(kuò)增一體化的微流控芯片檢測技術(shù)、CRISPRCas12a基因編輯技術(shù)與核酸擴(kuò)增相結(jié)合等技術(shù)或?qū)⒊蔀檫m用于現(xiàn)場快速檢測WSSV技術(shù)的重點(diǎn)發(fā)展方向。