梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王超

濟(jì)寧市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272000

梅毒約在19 世紀(jì)傳入我國，曾在建國初期消失，但20 世紀(jì)70 年代在我國重新出現(xiàn)且發(fā)病率快速上升。梅毒是由梅毒螺旋體感染人體引起的一種性傳播疾病，主要通過性接觸、母嬰以及血液傳播，人體遭受梅毒螺旋體感染后約有1～2 周的潛伏期，之后梅毒螺旋體侵入部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，再經(jīng)過6～8 周，所有的組織及器官均會(huì)被梅毒螺旋體感染，此時(shí)為二期梅毒?；颊呷舨患皶r(shí)治療，可引發(fā)梅毒性腦膜炎、腦膜塑膠樣腫等癥狀，盡早檢查阻斷梅毒傳播途徑，盡早治療改善患者的預(yù)后。而梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果是診斷梅毒最直接的證據(jù)，本研究對(duì)近年來梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展以及臨床應(yīng)用情況進(jìn)行了回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

從臨床上看，如患者伴有紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病，甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)可出現(xiàn)假陽性的情況。有研究指出，在沒有報(bào)道梅毒感染史的正常人群中應(yīng)用甲苯胺紅不加熱等試驗(yàn)約有0.1%的假陽性率[1]。因此，這一種檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)階段已經(jīng)較少應(yīng)用于實(shí)踐中，更多的是采用靈敏度及特異性更高的梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。

因?yàn)槊范韭菪w培養(yǎng)周期較長且培養(yǎng)難度大，所以梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)被廣泛地應(yīng)用于國內(nèi)基層實(shí)驗(yàn)室中，是國內(nèi)篩查與診斷梅毒最常用的檢測(cè)技術(shù)，目前國內(nèi)常用的梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有以下幾種。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)經(jīng)過十余年的發(fā)展，目前大多采用基因工程的方法，提高了試劑的特異性以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。從時(shí)間來看，國內(nèi)許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)采用雙抗夾心法檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體，利用酶放大效應(yīng)可以更好地檢出梅毒各期感染情況，而且這種檢測(cè)方法檢查費(fèi)用低，自動(dòng)化操作也可以減少人為因素對(duì)結(jié)果的影響[2]。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中用于檢測(cè)梅毒螺旋體的IgG 與IgM 抗體與梅毒特異性抗體有較強(qiáng)的相關(guān)性，因此是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)梅毒血清學(xué)診斷最常用的技術(shù)。然而，在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中也會(huì)受標(biāo)本中部分類過氧化物酶物質(zhì)的影響出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，而且許多梅毒患者在治愈后會(huì)終身攜帶梅毒IgG 抗體，因此這一血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)陽性結(jié)果只能反映受檢者正在被感染或者是曾經(jīng)感染過梅毒螺旋體[3]。近年來一種基于TpN17 和TpN47 抗原表位序列融合成的人工基因片段的新型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法被研制出來并被應(yīng)用于臨床中，發(fā)現(xiàn)這一種新型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法與梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)有相似的檢出率，為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及梅毒診斷中的應(yīng)用提供了新的方向[4]。

1.2 梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)

這一種血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是以梅毒螺旋體作為抗原的間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)，再通過致敏紅細(xì)胞與人血清的梅毒螺旋體抗體結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)進(jìn)行診斷的一種技術(shù)，是一種特異性的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高與操作簡便等特點(diǎn)。梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)除早期梅毒外對(duì)其他梅毒患者的靈敏度與梅毒診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”—熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)類似，而且因?yàn)槠淙菀撞僮鞯奶攸c(diǎn)已經(jīng)成為國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室常用的梅毒螺旋體確證試驗(yàn)方法[5]。然而，梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)?zāi)壳吧形磳?shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，而且也因?yàn)榧t細(xì)胞具有生物活性，所以在檢測(cè)過程中可能產(chǎn)生自凝現(xiàn)象[6]。除此之外，國內(nèi)普遍使用的商品化梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)試劑盒均未通過國家的批檢，目前這一種血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)所替代。

1.3 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)

梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)是以人工合成的惰性凝膠顆粒替代紅細(xì)胞作為載體的一種血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其試驗(yàn)原理與梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)相近。梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)早在本世紀(jì)初就被美國疾病預(yù)防控制中心推薦用于梅毒確診實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)試劑盒也通過了國家的批檢。在國內(nèi)多項(xiàng)研究中，梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)敏感性與特異性顯著高于甲苯胺紅不加熱等檢測(cè)技術(shù)[7-8]。

1.4 免疫膠體金試驗(yàn)

這一種梅毒螺旋體抗體檢測(cè)技術(shù)主要是采用純化的梅毒重組抗原，以膠體金作為指示標(biāo)記，快速檢測(cè)梅毒特異性抗體。免疫膠體金試驗(yàn)方法操作便捷、價(jià)格低廉，所以被廣泛地應(yīng)用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)篩查與診斷梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，測(cè)試時(shí)主要是將患者血清標(biāo)本滴入試劑和加樣孔內(nèi)血標(biāo)本中的梅毒抗體與預(yù)包被在膜上的膠體金結(jié)合物發(fā)生反應(yīng)，所產(chǎn)生的混合物會(huì)在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析[9-10]。倘若受檢者血清中含有抗梅毒抗體，在測(cè)試區(qū)內(nèi)可見一條紫紅色條帶，無抗梅毒抗體的則不會(huì)出現(xiàn)紫紅色條帶。在等待紫紅色條帶出現(xiàn)過程中需要檢測(cè)人員注意背景清晰，尤其是對(duì)于含有滴滴度的抗梅毒抗體的檢測(cè)標(biāo)本，且要在15 min 內(nèi)讀取測(cè)試結(jié)果，保證讀取結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然免疫膠體金試驗(yàn)之后呈現(xiàn)的紫紅色條帶會(huì)因樣本中抗梅毒抗體滴度的不同顏色有較大的差異，但這一結(jié)果并不能作為判定樣本中抗體滴度高低的依據(jù)[11]。近年來，國內(nèi)外許多醫(yī)藥企業(yè)加大了對(duì)高靈敏度與特異性的免疫膠體金試驗(yàn)技術(shù)與產(chǎn)品的研發(fā)，國內(nèi)一家企業(yè)自主研發(fā)的梅毒螺旋體抗體膠體金檢測(cè)試紙條具有較高的靈敏度與特異性，可作為基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)緊急開展梅毒傳染病篩查的首選。

1.5 梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)

這一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)在20 世紀(jì)80 年代得到了發(fā)展，主要是借助轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜條上含有的梅毒螺旋體各種成分，在其與待測(cè)血清與酶標(biāo)抗體孵育以及底物顯色后，如果出現(xiàn)顯色條帶，則可判定送檢的血清中存在梅毒特異性抗體[12]。國外有部分學(xué)者認(rèn)為，梅毒螺旋體免疫印跡實(shí)驗(yàn)診斷梅毒的效果優(yōu)于梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)，在早期潛伏梅毒以及神經(jīng)梅毒的篩查與診斷中均有良好的效果，在對(duì)非梅毒螺旋體標(biāo)本的檢測(cè)中也未出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[13]。與梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)相比，這一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)結(jié)果更容易判定。但梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)也有檢測(cè)費(fèi)用較高的缺點(diǎn)，這也限制了這一項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

1.6 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

這一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)是免疫分析法與化學(xué)發(fā)光法結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)，其線性范圍寬，檢測(cè)的靈敏度也會(huì)高于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是繼酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)后梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)中的新主流技術(shù)。因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定的自動(dòng)化程度高、檢測(cè)速度快，所以檢測(cè)的靈敏度、特異性與梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)的靈敏度與特異性持平或更高?，F(xiàn)階段，國際上有名的生物醫(yī)藥公司先后研制了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀以及化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒，如瑞士羅氏公司等，國內(nèi)也有多家企業(yè)自主研制了化學(xué)發(fā)光儀以及相應(yīng)的試劑盒，為化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)在梅毒螺旋體檢查中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐[14-15]。

2 梅毒螺旋體病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)

國內(nèi)外多個(gè)國家的指南中推薦梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)與病原學(xué)檢測(cè)，這兩種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法用于梅毒鑒別診斷中，梅毒螺旋體病原學(xué)檢測(cè)主要方法有暗視野顯微鏡檢查、直接免疫熒光法以及近年來快速發(fā)展的梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)[16-18]。

2.1 暗視野顯微鏡檢查

這一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)是國內(nèi)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)常用的梅毒病原學(xué)診斷方法，主要借助暗視野顯微鏡，直接觀察病灶分泌物中運(yùn)動(dòng)活潑的梅毒螺旋體，并結(jié)合患者的臨床癥狀直接診斷梅毒，適用于一期梅毒以及二期梅毒早期的篩查與診斷中，大多是從硬下疳、宮頸、陰道等部位取材。然而，陰道、肛門等部位有大齒密螺旋體以及其他條件致病螺旋體存在，在檢測(cè)過程中容易將這些病原體與梅毒螺旋體混合進(jìn)而影響診斷。

2.2 直接免疫熒光法

這一種梅毒螺旋體病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)是現(xiàn)階段國外應(yīng)用較多的一種檢測(cè)技術(shù)，是由專業(yè)的檢測(cè)人員將特異性的抗梅毒螺旋體單克隆抗體使用熒光素標(biāo)記后在熒光顯微鏡下觀察其是否會(huì)與抗原特異性結(jié)合后產(chǎn)生蘋果綠色的梅毒螺旋體。從臨床應(yīng)用情況來看，直接免疫熒光法的特異性以及靈敏度均明顯高于暗視野顯微鏡檢查。

2.3 梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)是一種新型的梅毒螺旋體病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，近年來國內(nèi)外學(xué)者加大了對(duì)這一項(xiàng)技術(shù)的研究，目前仍處于研發(fā)階段，國內(nèi)外均未有批準(zhǔn)核酸檢測(cè)的試劑盒上市，但從研發(fā)階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，該項(xiàng)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景[16]。目前國內(nèi)外正在研發(fā)的梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)包括定時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR 等檢測(cè)技術(shù)。

3 結(jié)語

梅毒螺旋體感染引起的梅毒對(duì)輸血安全以及母嬰安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，加強(qiáng)對(duì)梅毒螺旋體的檢測(cè)對(duì)于鑒別診斷梅毒具有重要的意義。目前梅毒螺旋體時(shí)驗(yàn)視檢測(cè)技術(shù)包括血清學(xué)檢測(cè)以及病原學(xué)檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)的方法較多，常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、梅毒螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)等，具有較高的靈敏度與特異性，在梅毒篩查與診斷中發(fā)揮著重要的作用。暗視野顯微鏡檢查、直接免疫熒光法是國內(nèi)外常見的梅毒螺旋體病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，隨著國內(nèi)外在這一領(lǐng)域研究的不斷深入，梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)被研發(fā)出來且在臨床試驗(yàn)中取得了良好的效果，在梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。