潰瘍性結(jié)腸炎中巨噬細(xì)胞差異基因及功能分析

陳夢(mèng)雪 王宏剛 謝 睿

江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇淮安 223300

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的腸道炎癥性疾病，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升[1-2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序（single-cell sequencing，SCS）被用于UC 的發(fā)病機(jī)制研究。SCS 評(píng)價(jià)腸道組織的單個(gè)細(xì)胞異質(zhì)性，能更準(zhǔn)確地解析各類細(xì)胞參與的腸道炎癥過(guò)程[3-4]。

Boland 等[5]對(duì)UC 患者的直腸黏膜組織進(jìn)行SCS分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與UC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究挖掘SCS 數(shù)據(jù)[5]，篩選UC 與非UC 患者腸道巨噬細(xì)胞的差異基因，分析參與的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，從固有免疫細(xì)胞角度討論UC 的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究原始數(shù)據(jù)來(lái)自數(shù)據(jù)集GSE125527。選取2019 年1 月至12 月前往the VA San Diego 醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診的7 例UC 患者和7 名健康對(duì)照者的直腸黏膜作為對(duì)照SCS 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。UC 組納入標(biāo)準(zhǔn)：處于疾病活動(dòng)期的UC 患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：行結(jié)腸鏡篩查的非腸炎人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：直腸型UC；合并明顯腸道并發(fā)癥或感染；合并惡性腫瘤；肝腎功能不全[4]。UC 組平均年齡（43.3±13.6）歲；男3 例，病程中位數(shù)為6 年；女4 例，病程中位數(shù)為9 年；病變范圍為左半結(jié)腸1 例，全結(jié)腸6 例。Mayo 內(nèi)鏡評(píng)分為輕度1 例，中度5 例，重度1 例[7]。對(duì)照組平均年齡（48.1±17.8）歲；男5 例，女2 例。

1.2 研究方法

1.2.1 質(zhì)控及篩選細(xì)胞 計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中nFeature-RNA。過(guò)濾掉基因數(shù)目＞2500、＜200 及超過(guò)5%的線粒體占比的細(xì)胞。

1.2.2 鑒定差異基因 使用vst 方法計(jì)算細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異基因。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 聚類分析 進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，基于篩選好的主成分對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類。

1.2.4 基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基金和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析 采用cluster Profiler R 包對(duì)巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因進(jìn)行功能富集和信號(hào)通路富集分析。富集分析基于超幾何分布原理。

2 結(jié)果

2.1 聚類分析結(jié)果

獲得了15 個(gè)聚類的細(xì)胞群，不同類的細(xì)胞群標(biāo)記為不同的顏色，分別用cluster 0 至14 表示。見圖1。

2.2 巨噬細(xì)胞識(shí)別

CellMarker 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到143 個(gè)人的巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因。與cluster 對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行交集，有19 個(gè)巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因?qū)儆赾luster 11，分別為CD68、CD14、CD86、LYZ、TREM1、MS4A7、MXD1、SPINT2、PLBD1、CSF1R、FGR、FAM49A、CYBB、DSE、MS4A6A、SAMHD1、CIITA、TGFBI、AIF1，所以識(shí)別cluster 11 為巨噬細(xì)胞。

2.3 差異基因篩選

將兩組巨噬細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)量分析，共篩選出31 個(gè)顯著差異基因。按照差異倍數(shù)（對(duì)照/UC）的對(duì)數(shù)值（logFC）由小到大排序，見表1。結(jié)果顯示，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 組顯著高表達(dá)。

表1 兩組巨噬細(xì)胞差異基因

2.4 GO 功能富集分析

包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個(gè)方面。在BP 方面，差異基因富集于對(duì)氧化應(yīng)激、對(duì)活性氧、對(duì)病原體的防御、體液免疫等反應(yīng)。在CC 方面，主要富集于分泌顆粒內(nèi)腔、胞質(zhì)囊腔、囊腔等。在MF 方面，主要富集于酶抑制劑活性等。見圖2。

2.5 KEGG 信號(hào)通路富集分析

差異基因顯著富集于白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、趨化因子、Toll 樣受體等信號(hào)通路。見圖3。這些信號(hào)通路是巨噬細(xì)胞炎癥調(diào)控的重要通路，提示巨噬細(xì)胞可能通過(guò)這些炎癥信號(hào)通路參與UC。

3 討論

UC 是多種免疫細(xì)胞參與的慢性腸道炎性疾病[8]，發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制逐漸被深入研究。SCS 較多應(yīng)用于腫瘤研究[9]，在UC 中少有報(bào)道。Boland 等[5]對(duì)7 例UC患者的直腸黏膜組織行SCS 分析，提出適應(yīng)性免疫細(xì)胞在UC 中的作用機(jī)制。但是，以巨噬細(xì)胞為代表的固有免疫細(xì)胞是否參與UC 尚未充分闡述。

巨噬細(xì)胞常駐于腸道固有層，維持腸道穩(wěn)態(tài)，在病原體感染、炎癥反應(yīng)、免疫激活等方面起著重要作用[10-11]。UC 腸道微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程受到干擾，過(guò)多分泌促炎因子，加重UC 進(jìn)展[12-13]。因此，應(yīng)用SCS 分析UC 患者的腸道巨噬細(xì)胞功能有重要意義。

本研究比較UC 組和對(duì)照組巨噬細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平，篩選出31 個(gè)差異基因。其中，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 組巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)。本研究認(rèn)為腸道巨噬細(xì)胞的這3 個(gè)基因可能與UC 密切相關(guān)。TIMP1 是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制酶，參與腫瘤、炎癥等過(guò)程[14-15]。吳娜等[16]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TIPM1 是活動(dòng)期UC 的關(guān)鍵因子。IFITM3 是一種固有免疫系統(tǒng)反應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是免疫開關(guān)，可能增加結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)[17]。IGHG1 是免疫球蛋白重鏈編碼基因，參與腫瘤免疫過(guò)程[18-19]。因此，這3 個(gè)基因可能是參與UC 異型增生甚至癌變的相關(guān)因子。既往研究發(fā)現(xiàn)，廣泛結(jié)腸型和年齡大是我國(guó)UC 患者發(fā)生異型增生的2 個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20-21]。對(duì)結(jié)腸炎癥范圍廣和年齡較大的高危人群進(jìn)行腸黏膜活檢，檢測(cè)這3 個(gè)基因的表達(dá)從而預(yù)測(cè)異型增生，未來(lái)可能用于臨床監(jiān)測(cè)UC 癌變。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致促炎巨噬細(xì)胞的結(jié)腸浸潤(rùn)，加重結(jié)腸炎[22]。Galectin-1 通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激，降低了葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC 的嚴(yán)重程度[23]。去除氧自由基，減少氧化應(yīng)激，有助于UC 恢復(fù)。另外，IL-17 可分泌Th17 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，參與腸道炎癥。然而，關(guān)于IL-17 信號(hào)通路在UC 中的抗炎或促炎作用尚存爭(zhēng)議。有研究報(bào)道，活動(dòng)期UC 患者的腸黏膜和血清中IL-17 的水平升高，與UC 臨床嚴(yán)重程度呈顯著相關(guān)，但抑制IL-17 并不能有效誘導(dǎo)UC 緩解[24]。在動(dòng)物研究中，敲除IL-17 后，小鼠的結(jié)腸炎癥顯得更加嚴(yán)重[25]?？梢姡琁L-17 在UC 中顯示出高度復(fù)雜性。

綜上，本研究篩選出UC 患者腸道巨噬細(xì)胞的差異基因，且巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和IL-17 信號(hào)通路可能參與UC 疾病過(guò)程，這將為進(jìn)一步研究UC 發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。