一種Hg2+敏感的反蛋白石光子晶體熒光傳感薄膜

李 恒，沙夜龍，孫溢敏，馮廣東，韓 波*，張玉琦*

（1.延安市新能源新功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院；2.延安油氣產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限責(zé)任公司，陜西延安 716000）

金屬汞（Hg）是一種對(duì)人類(lèi)健康有害的重金屬元素之一，也是主要的環(huán)境污染物之一，以離子及其他衍生物形式廣泛存在于飲用水、食物及藥材等［1-2］。如甲基汞作為化妝品中的一種常用添加劑，對(duì)皮膚具有一定的美白效果，但因其具有親脂性，能夠在人體內(nèi)進(jìn)行積累，會(huì)對(duì)人類(lèi)腎臟、肝臟、腦組織以及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生極大損傷［3-5］。因此，開(kāi)發(fā)一種快速且高效檢測(cè)Hg2+的方法具有重要的意義。目前，檢測(cè)Hg2+的方法主要有原子吸收光譜法［6］、伏安法［7］、共振光散射法［8］等。以上方法需要精密儀器且操作復(fù)雜、樣品制備繁瑣。近年來(lái)，熒光法［9-10］和比色法［11-12］因試樣用量少、靈敏度高、響應(yīng)快速、選擇性好、檢測(cè)限低且操作簡(jiǎn)單而受到廣泛關(guān)注。

光子晶體是2種或2種以上的介電常數(shù)不同的材料在空間呈周期性排布的微構(gòu)材料，由于其獨(dú)特的能帶結(jié)構(gòu)和慢光子效應(yīng)在傳感檢測(cè)領(lǐng)域得到了快速發(fā)展。而根據(jù)光子晶體的慢光子效應(yīng)增強(qiáng)熒光特性開(kāi)發(fā)了各種熒光傳感薄膜，用以高靈敏檢測(cè)各類(lèi)化合物，如檢測(cè)爆炸物［13］、甲醛［14-15］、金屬Bi3+［16］等。

本文制備了以SiO2為骨架的具有三維孔狀結(jié)構(gòu)的反蛋白石光子晶體薄膜，填入與Hg2+具有專(zhuān)一作用的熒光探針?lè)肿恿_丹明B衍生物（RM），RM與Hg2+的專(zhuān)一性配位生成熒光產(chǎn)物及光子晶體慢光子效應(yīng)增強(qiáng)熒光特性，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

不同粒徑的聚苯乙烯（PS）微球購(gòu)自上海輝質(zhì)生物科技有限公司；羅丹明B衍生物（RM）根據(jù)文獻(xiàn)方法合成［17］，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，經(jīng)核磁共振光譜表征證明。實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為分析純，商業(yè)購(gòu)買(mǎi)后直接使用。

圖1 羅丹明B衍生物（RM）的結(jié)構(gòu)式

SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；PG-2000-Pro-Ex光纖光譜儀，中國(guó)上海復(fù)享光學(xué)股份有限公司；Cary Eclipse熒光光譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 RM填充的多孔傳感薄膜的制備

首先通過(guò)犧牲模板法制備了具有不同光子禁帶的SiO2反蛋白石光子晶體薄膜。具體方法參照文獻(xiàn)方法［18］。通過(guò)PS微球乳液與SiO2溶膠在恒溫60℃，恒濕60%的條件下，豎直沉積共組裝制備得到PS-SiO2復(fù)合的光子晶體薄膜；然后用四氫呋喃溶解去除PS微球模板，得到以SiO2為骨架的具有三維孔狀結(jié)構(gòu)的反蛋白石光子晶體薄膜（IOPC）。采用粒徑分別為350、370、400和450 nm的PS微球制得的薄膜分別標(biāo)記為IOPC350、IOPC370、IOPC400和IOPC450。將350、370和450 nm 3種粒徑的PS乳液混合均勻，按照同樣的方法制備得到無(wú)序多孔SiO2薄膜，記為PFNon，作為對(duì)照樣品。

取一定體積100μmol/L RM的乙醇溶液滴涂至制備得到的不同薄膜表面，待溶劑揮發(fā)后得到對(duì)Hg2+敏感的熒光傳感薄膜，分別記為RM-IOPC350、RM-IOPC370、RM-IOPC400、RM-IOPC450和RM-PFNon。

1.3 Tris-HCl緩沖液及金屬離子儲(chǔ)備液的制備

不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液的制備：稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷（Tris）0.61 g，溶于水后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，用0.01 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)至所需pH，加水定容后混合均勻備用。

不同金屬離子儲(chǔ)備液的制備：分別稱(chēng)取一定量的Hg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+、Bi3+、K+、Na+、Mn2+、Pb2+、Ca2+的鹽酸鹽溶于0.01 mol/L Tris-HCl（pH=7.0）緩沖溶液中，制備得到濃度為100 mmol/L的不同金屬離子儲(chǔ)備液，待用。以上14種金屬離子配置好后，各取500μL于10 mL的容量瓶中定容，混合均勻，各離子濃度為5 mmol/L，作為金屬離子混合樣品（標(biāo)記為Mixture）待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 光子晶體的表征

首先對(duì)制得的不同薄膜進(jìn)行了表面形貌表征。以400 nm的PS為模板制備的各個(gè)薄膜為代表，掃描電鏡照片見(jiàn)圖2。圖2A為PS與Si O2溶膠共組裝制得的薄膜PC400的表征結(jié)果，PS微球高度有序排列，微球之間為共沉積的SiO2納米粒子；經(jīng)四氫呋喃溶解去除PS微球后，得到以SiO2為骨架的空氣微球高度有序排列的三維多孔結(jié)構(gòu)的傳感薄膜（圖2B）；而在填充了RM后，薄膜的表面形貌無(wú)明顯變化（圖2C），是由于填充量很少的緣故。在未填充RM時(shí)IOPC400呈現(xiàn)薄膜本身結(jié)構(gòu)顏色（圖2B插圖），由于RM分子本身為粉紅色，因此填充后光子晶體薄膜表面呈現(xiàn)粉色（圖2C插圖）。而對(duì)于制備的PFNon，由于PS粒徑的不均一，導(dǎo)致組裝后PS成無(wú)序排列，所制備的對(duì)應(yīng)的多孔薄膜也是空氣孔無(wú)序排列的結(jié)構(gòu)。

圖2 SEM照片（插圖為對(duì)應(yīng)薄膜的光學(xué)照片）

對(duì)制備的不同薄膜的反射光譜進(jìn)行表征以獲取光子晶體光子禁帶的位置，如圖3所示。IOPC350、IOPC370、IOPC400和IOPC450的反射峰位分別位于541、586、632和730 nm，填充RM后反射峰紅移至554、600、645和740 nm，移動(dòng)了10～14 nm，由布拉格方程可知，反射光譜紅移是由于RM的填充使薄膜的 平均折射率有所增大所致。

圖3 IOPC350、IOPC370、IOPC400、IOPC450及PFNon填充RM前后的反射光譜

2.2 熒光測(cè)試條件的優(yōu)化

基于羅丹明衍生物對(duì)溶液pH的敏感性，研究了不同pH的乙腈：Tris-HCl（v∶v=1∶1）緩沖溶液中傳感薄膜與Hg2+響應(yīng)前后的熒光性質(zhì)。圖4A為RMIOPC400浸入不同pH的溶液中避光放置30 min，加入5 mmol/L Hg2+前后585 nm處的熒光強(qiáng)度。當(dāng)pH＜7且無(wú)Hg2+時(shí)，薄膜均發(fā)射強(qiáng)熒光，且隨pH增大熒光強(qiáng)度減弱。這是因?yàn)槁葸拎降腞M在酸性條件下內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)而產(chǎn)生熒光［19］；當(dāng)pH≥7時(shí)，薄膜熒光猝滅，至堿性條件下完全猝滅，這是由于隨著堿性增強(qiáng)，開(kāi)環(huán)的分子重新形成螺吡喃形式。而當(dāng)Hg2+存在時(shí)，在pH≤7的范圍內(nèi)，薄膜顯示較強(qiáng)的熒光，同樣隨pH增大而減弱，但明顯強(qiáng)于無(wú)Hg2+存在時(shí)的熒光。這是因?yàn)樵趐H＜7時(shí)主要是Hg2+誘導(dǎo)RM的內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)并與汞離子配位產(chǎn)生熒光［17］；當(dāng)pH＞7時(shí)，由于Hg2+與OH-反應(yīng)，使得探針?lè)肿訜o(wú)法與Hg2+配位因而熒光發(fā)生猝滅。顯然，在pH=7時(shí)，該薄膜在與Hg2+響應(yīng)前后熒光變化最為明顯，熒光光譜如圖4B所示。因此，后續(xù)測(cè)試均在pH值為7的緩沖溶液中進(jìn)行。

圖4 (A)RM-IOPC400在不同pH Tris-HCl緩沖溶液中與Hg2+響應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化;(B)pH=7時(shí)的熒光光譜

2.3 光子晶體傳感薄膜的優(yōu)化

研究了4種不同光子禁帶的薄膜及PFNon薄膜對(duì)Hg2+檢測(cè)的影響。如圖5所示，RM-IOPC400薄膜的熒光強(qiáng)度最高。這是由于慢光子效應(yīng)使熒光增強(qiáng)，而藍(lán)帶邊重疊的RM-IOPC400熒光最強(qiáng)是因?yàn)樘畛涞挠袡C(jī)分子屬于低折射率材料，所以慢光子效應(yīng)在藍(lán)帶邊更為明顯［20-21］。而對(duì)于RM-IOPC370薄膜，熒光幾乎猝滅，是因?yàn)榘l(fā)射波長(zhǎng)正好與其禁帶中心位置重疊，非但沒(méi)有增強(qiáng)熒光反而限制了熒光的傳播。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇RM-IOPC400作為最佳的光子晶體傳感薄膜。

圖5 RM填充的不同薄膜檢測(cè)5 mmol/L Hg2+的熒光強(qiáng)度

此外，以IOPC400為載體，填充不同量的RM溶液，研究所得薄膜檢測(cè)Hg2+的熒光性質(zhì)，585 nm處的熒光強(qiáng)度如圖6所示。當(dāng)填充量增加至100μL時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。這是因?yàn)镽M作為傳感分子，它的量越多結(jié)合的Hg2+越多，產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物越多，熒光強(qiáng)度也就越強(qiáng)。但隨著填充量的繼續(xù)增加，熒光強(qiáng)度有所降低，這可能是由于較多RM的填入使反蛋白石光子晶體的孔徑減小，光子禁帶發(fā)生移動(dòng)，慢光子效應(yīng)減弱，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。因此，以100μL RM溶液填充的IOPC400作為最優(yōu)化傳感薄膜研究汞離子的傳感性能，此時(shí)RM的最佳填充量為7.52μg。

圖6 不同體積的RM溶液填充的IOPC400檢測(cè)5 mmol/L Hg2+的熒光強(qiáng)度

2.4 RM-IOPC400薄膜檢測(cè)汞離子的性能及應(yīng)用

首先研究了傳感薄膜浸入Hg2+溶液中不同時(shí)間后的熒光光譜，以浸入5 mmol/L的Hg2+溶液為例，其在585 nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化如圖7所示。薄膜初始狀態(tài)熒光強(qiáng)度極弱，而5 min后強(qiáng)度急劇增大，隨后緩慢增大，至25 min后強(qiáng)度達(dá)到最大且趨于平穩(wěn)，說(shuō)明該薄膜與Hg2+的響應(yīng)在25 min即可達(dá)到平衡。同樣測(cè)試了薄膜在10 mmol/L和25 mmol/L的Hg2+溶液中不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果表明，薄膜也是在5 min內(nèi)熒光強(qiáng)度急劇增大，而在Hg2+例子濃度為25 mmol/L時(shí)，達(dá)到平衡的時(shí)間則只需要15 min，這是由于Hg2+濃度增大，在薄膜孔隙的擴(kuò)散速度增大，與RM作用生成產(chǎn)物的速率更快。

圖7 RM-IOPC400檢測(cè)5 mmol/L Hg2+后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化

通過(guò)將RM-IOPC400薄膜浸入不同金屬離子的溶液中研究其熒光變化以考察該薄膜檢測(cè)Hg2+的選擇性，同時(shí)用各種金屬離子的混合溶液檢測(cè)Hg2+的抗干擾性，結(jié)果如圖8A所示。RM-IOPC400薄膜只有在Hg2+存在時(shí)能夠發(fā)射強(qiáng)的熒光，在Cu2+、Pb2+、Fe3+存在時(shí)表現(xiàn)出微弱的熒光，然而這些相對(duì)于檢測(cè)汞離子的熒光強(qiáng)度可以忽略。這是由于RM與Hg2+的選擇性配位作用使其具有很好的專(zhuān)一性檢測(cè)。而薄膜在各種金屬離子的混合液中仍然表現(xiàn)出強(qiáng)熒光性質(zhì)，說(shuō)明所構(gòu)筑的光子晶體薄膜在其他離子存在的情況下仍然能夠很好的檢測(cè)Hg2+，具有良好的抗干擾性。

將RM-IOPC400薄膜浸入1～25 mmol/L不同濃度的Hg2+溶液中，熒光光譜如圖8B所示，研究了檢測(cè)Hg2+的靈敏度。熒光光譜表明，隨著Hg2+濃度增大，薄膜熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系見(jiàn)圖8C。可知，在1～10 mmol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；而在低濃度范圍內(nèi)（10～105nmol/L），熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的對(duì)數(shù)成正比，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 5，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差法（3σ/s，其中σ為空白樣品熒光響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s為校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率）計(jì)算得到最低檢出限（LOD）為2.1 nmol/L，與文獻(xiàn)［17］中報(bào)道的檢出限0.2μmol/L相比提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的高靈敏度檢測(cè)。

圖8 RM-IOPC400檢測(cè)Hg2+的性能

此外，將與Hg2+響應(yīng)后RM-IOPC400薄膜浸入10 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，避光放置30 min后薄膜熒光猝滅，這是由于EDTA與Hg2+更強(qiáng)的絡(luò)合作用從RM-Hg2+的絡(luò)合物中奪取Hg2+，使RM由開(kāi)環(huán)形式又轉(zhuǎn)變?yōu)殚]環(huán)的螺吡喃式［17］，所以熒光猝滅。將薄膜交替浸入Hg2+和EDTA溶液中，熒光強(qiáng)度可多次可逆變化（圖8D），表明該傳感薄膜可以重復(fù)性使用。

3 結(jié)論

本文制備了一種羅丹明B衍生物熒光探針?lè)肿犹畛涞腟iO2反蛋白石光子晶體熒光傳感薄膜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的高效檢測(cè)。所選探針?lè)肿幽軌蚺cHg2+專(zhuān)一配位使其螺吡喃結(jié)構(gòu)的內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)從而在585 nm處發(fā)射熒光，使該薄膜能夠高選擇性檢測(cè)Hg2+，并且不受其他金屬離子的干擾；通過(guò)選擇光子禁帶藍(lán)帶邊與熒光發(fā)射波長(zhǎng)相匹配的光子晶體，慢光子效應(yīng)極大的增強(qiáng)了發(fā)射的熒光，提高了檢測(cè)的靈敏度，最低檢出限為2.1 nmol/L，比溶液體系提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)；此外，該傳感薄膜利用EDTA與Hg2+更強(qiáng)的絡(luò)合能力實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的可逆性，使所制的傳感薄膜可以重復(fù)使用。因此，所構(gòu)筑的光子晶體傳感薄膜實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的高選擇性、高靈敏、可逆性檢測(cè)，為設(shè)計(jì)構(gòu)筑其他金屬離子傳感薄膜提供了新的思路。