低共熔溶劑提取厚樸渣中木脂素類化合物

王 帆，簡雅婷，張 宇，陳小燕，余 強(qiáng)

（1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥230000； 4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部能源植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)林生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

0 引 言

近年來，隨著國內(nèi)外依賴中藥和天然藥物資源為原料的大健康產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，藥渣產(chǎn)生量劇增，但由于提取工藝、設(shè)備和管理因素的制約，藥渣等廢棄物未能得到有效利用，不僅造成資源浪費(fèi)，且導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重污染。Li等對黃芪廢渣成分進(jìn)行了鑒定，劉常青等比較了丹參藥材與丹參藥渣中丹參酮ⅡA的含量，Biltekin檢測了橄欖渣中存在的一些有價(jià)值的生物活性化合物，在最佳條件下獲得的山楂酸和齊墩果酸總量為26 mg/g干物質(zhì)，相當(dāng)于提取物的98.21%。以上結(jié)果均說明中藥渣仍有較大的再利用價(jià)值。通常中藥的提取溶媒為水溶液，其藥渣中還殘存有大量的脂溶性成分，資源的浪費(fèi)問題更為突出。厚樸是中國三木藥材（厚樸、杜仲和黃柏）之一，具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、中風(fēng)和哮喘等主要臨床藥理作用；其主要成分為木脂素類物質(zhì)、包括厚樸酚（Magnolol）、和厚樸酚（Honokiol），異厚樸酚、三羥基厚樸酚、去氫三羥基厚樸酚，其中和厚樸酚、厚樸酚是厚樸藥材中含量最高的有效成分，是評價(jià)厚樸藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)檢測物。藥理試驗(yàn)證明兩者具有松弛骨骼肌、殺蟲、殺菌、中樞抑制和抗?jié)兊茸饔?。從厚樸渣中再提取木脂素類化合物極具應(yīng)用前景和意義，不僅能減少環(huán)境污染，而且能帶來一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，目前已成為生物質(zhì)資源與環(huán)境行業(yè)研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)中藥成分提取工藝以煎煮為主，此過程能夠溶解部分水溶性功效成分，厚樸渣中仍殘留較多有效成分。作為典型的厚樸功效成分，厚樸木脂素類化合物的提取與利用一直備受關(guān)注。已有提取方法主要為醇提、水提、堿溶酸沉法等，這些方法操作簡單、無需復(fù)雜設(shè)備，是目前工業(yè)中主要使用的方法。然而這些方法也存在許多問題，如溶劑使用量大、提取時(shí)間長、提取溫度高等。因此，尋找一種高效、綠色、易制備提取溶劑對中藥渣中殘留功效成分的提取具有重要意義。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是由兩個(gè)或多個(gè)組分形成氫鍵作用形成的共晶混合物，因其在常溫下呈液體狀態(tài)，且具有與傳統(tǒng)溶劑相近的功能，引起廣泛關(guān)注。DES的組分包含氫鍵供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）與氫鍵受體（Hydrogen Bond Acceptor，HBA），可被生物降解，符合綠色化學(xué)的要求，同時(shí)，DES制備過程簡單、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)，有望成為傳統(tǒng)溶劑的綠色替代品。DES較常規(guī)溶劑滲透能力強(qiáng)，通過輔助分解植物細(xì)胞壁木質(zhì)素、半纖維素及纖維素，使活性成分的溶出率增加。熊穎等發(fā)現(xiàn)采用氯化膽堿/草酸可有效提取多酚類化合物，提取率為常規(guī)甲醇溶劑的2倍以上；Cui等應(yīng)用微波加熱方法輔助低共熔溶劑提取黃酮類化合物，黃酮提取率較傳統(tǒng)水熱浸提提高100%以上；Chanioti等發(fā)現(xiàn)檸檬酸/氯化膽堿所提取的總酚含量和抗氧化活性均高于均質(zhì)化、微波、超聲波和高靜水壓力輔助等方法。此外，DESs可回收再利用，如利用醋酸鈉和乳酸合成的NADESs提取玉竹中的黃酮提取量為20.13 mg/g，回收利用一次提取量仍有18.79 mg/g；Zhang等重復(fù)利用氯化膽堿/草酸提取茯苓多糖，重復(fù)6次后其提取率為38.40%，較傳統(tǒng)的熱水提取提高了7.2倍。DES組成成分對中藥功效成分的提取效率影響較大，中藥功效成分的結(jié)構(gòu)差異也顯著影響提取率。因此，了解提取過程中溶劑與溶質(zhì)間相互作用機(jī)理，將對改善提取反應(yīng)效率具有重要的指導(dǎo)作用。

本試驗(yàn)以厚樸渣為提取研究對象，考察多種DES對厚樸渣中殘留木脂素類化合物的提取效率，篩選得到最優(yōu)溶劑，考察主要影響因素對和厚樸酚、厚樸酚的提取率變化，優(yōu)化提取工藝，旨在提高木脂素類化合物提取效果，為有效利用厚樸渣及拓展 DES應(yīng)用領(lǐng)域提供理論支撐。最后，利用密度泛函理論對提取過程進(jìn)行模擬與量子化學(xué)分析，研究低共熔溶劑與木脂素類化合物的相互作用，揭示復(fù)合體系組分之間相互作用關(guān)系，以期為設(shè)計(jì)高效提取溶劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

厚樸原料購買于神龍百草行經(jīng)方藥材店（產(chǎn)地：四川），粉碎過篩，取300 g 20～40目（425～850m）顆粒大小厚樸粉用1.5～2.0 L去離子水煮沸半小時(shí)后于烘箱烘干至恒質(zhì)量，得到干物質(zhì)厚樸渣為后續(xù)試驗(yàn)原料。和厚樸酚、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司，其他試劑購自上海麥克林生化科技有限公司，均為分析純。

1.2 DES的制備

DES組成參照表1，以氯化膽堿（Choline Chloride，ChCl）等為HBA，以一元酸、二元酸、二元醇等為HBD，按相應(yīng)摩爾比制備10種DES。制備方法參照Abbott等方法，將 HBA與HBD混勻于厚壁耐壓瓶中，攪拌加熱至80～90 ℃約30～60 min，形成透明澄清的液體，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同DES對功效成分的提取效率比較

考察10種DES對厚樸渣中厚樸酚、和厚樸酚的提取效率，參照文獻(xiàn)報(bào)道，選取固液比1∶15 g/mL，將2 g厚樸渣與30 mL DES混勻于微波提取器，放入常壓微波反應(yīng)器（MCR-3常壓微波反應(yīng)器，廣州市星爍儀器有限責(zé)任公司）中進(jìn)行提取反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置功率160 W、溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物進(jìn)行抽濾，殘?jiān)盟疀_洗干凈后烘干至恒質(zhì)量，清液用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測提取物中各木脂素類化合物的含量。

表1 本試驗(yàn)中所用低共熔溶劑Table 1 Deep Eutectic Solvents (DES) used in present study

1.4 不同反應(yīng)因素對提取率影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取1.3中最佳提取溶劑，在不同反應(yīng)時(shí)間（30、60、90、120 min）與反應(yīng)溫度（30、50、70、90 ℃）條件下，分別對固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25與1∶30 g/mL）、溶劑含水率（30%、40%、50%）、DES組成摩爾比（1∶2、1∶3、1∶4），進(jìn)行單因素變量替換工藝流程中相應(yīng)的常規(guī)量，考察各因素對木脂素類化合物提取效果的影響，以上每個(gè)處理均重復(fù)3次。同時(shí)，參考中國藥典中的厚樸提取方法，以甲醇作為溶劑代替低共熔溶劑，精密稱取0.2 g厚樸渣，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，浸漬24 h，考察其對厚樸渣中木脂素類化合物提取率。

1.5 分析方法

1.5.1 木脂素類化合物含量檢測方法

和厚樸酚、厚樸酚的含量檢測采用HPLC方法，液相色譜儀器型號為Alliance2695（Waters，USA），分離柱選用Waters XBridge BEH C18柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10L，流動(dòng)相為甲醇∶超純水=78∶22（體積比），流速0.80 mL/min，示差檢測器2414的檢測波長：294 nm。以標(biāo)準(zhǔn)厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出厚樸酚、和 厚 樸 酚 的 回 歸 方 程 為=1.51×10+3.42×10，=0.999 521，=1.66×10+3.32×10，=0.999 547，線性相關(guān)性良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出木脂素類化合物提取率（Extraction yield，mg/g）計(jì)算公式如下：

式中為提取溶液中木脂素類化合物的濃度，mg/mL；為提取溶液的體積，mL；為厚樸渣的質(zhì)量，g。

1.5.2 DES提取木脂素類化合物的量子化學(xué)分析

DES的HBD和HBA初始猜測構(gòu)型由gaussview軟件得到。以ChCl分別與有機(jī)酸類、醇類形成的DES的構(gòu)象優(yōu)化在M06-2X/6-311G**（**表示對該基組加一套d、p軌道的極化函數(shù)）的水平上進(jìn)行，并通過虛頻檢驗(yàn)保證獲得最穩(wěn)定構(gòu)型。利用密度泛函理論gaussian16 對DES進(jìn)行單電能和頻率優(yōu)化，得到能量最低的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用 Multiwfn和Vmd軟件計(jì)算分子表面靜電勢（Electrostatic Potential，ESP）和約化對比梯度密度（Reduced Density Gradient，RDG），分析DES的HBD和HBA分子間相互作用，分析DES的形成機(jī)理。RDG（無量綱的形式）分析采用約化密度梯度函數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES體系的選擇

DES配位劑組成會(huì)顯著影響植物活性物質(zhì)的溶出，配置合成不同組分的混合物，其理化性質(zhì)有較大的差異，考察了10種不同酸類、酮類物質(zhì)為HBD的DES對厚樸渣木脂素類化合物提取能力。分析結(jié)果（圖1）顯示，氯化膽堿/乙酰丙酸（ChCl-La，DES-8）DES對厚樸渣中木脂素類化合物總提取率最高為20.31 mg/g，推測與ChCl-La破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的能力有關(guān)。

圖1 不同DES的總木脂素類化合物的提取效果Fig.1 Extraction yield of total lignanoids by different DES

氯化膽堿/乙酸（ChCl-AC，DES-9）、氯化膽堿/乳酸（ChCl-Lac，DES-6）對木脂素類物質(zhì)的提取效果僅次于ChCl-La溶劑，總提取率分別為19.69、14.95 mg/g，其余以氯化膽堿為HBA的DES對木脂素類化合物提取效果較低。其中ChCl-Ur （DES-1）、MTAC-EG（DES-2）與ChCl-MEA（DES-3）提取液中未檢測到厚樸酚成分，ChCl-PA（DES-10）提取液中未檢測到和厚樸酚成分，故分別只計(jì)算對應(yīng)提取到物質(zhì)的提取率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇ChCl-La作為后續(xù)的研究對象。

2.2 固液比對木脂素提取率的影響

選取ChCl-La用于后續(xù)試驗(yàn)中的厚樸渣中木脂素類化合物提取，分析固液比在不同反應(yīng)溫度（30～90 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（0.5～2 h）對木脂素類化合物提取效果的影響。結(jié)果顯示（圖2），兩種目標(biāo)化合物的提取率先增大后減小，當(dāng)固液比為1∶25 g/mL時(shí)，總提取率平均值達(dá)到最高（32.87 mg/g），和厚樸酚、厚樸酚的提取率分別為9.93、22.95 mg/g。隨著溶劑用量的增加，目標(biāo)化合物與溶劑充分接觸，萃取效果較好，當(dāng)溶劑過多時(shí)會(huì)造成浪費(fèi)，增加試驗(yàn)成本，甚至不利于目標(biāo)化合物的萃取。從圖中可以看出，固液比為1∶10 g/mL，溫度在50～90 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，厚樸酚、和厚樸酚的提取率增幅較小，當(dāng)固液比增加至1∶15 g/mL，時(shí)間在1～2 h之間時(shí)，隨著溫度的升高，厚樸酚、和厚樸酚的提取率在逐漸增加；而當(dāng)固液比增加到1∶25 g/mL時(shí)，厚樸酚、和厚樸酚的提取率有了大幅提升，再次增加固液比至1∶30 g/mL時(shí)，目標(biāo)化合物的提取率整體開始迅速下降，可能是因?yàn)槿軇┑拇罅吭黾樱斐赡繕?biāo)提取物的濃度降低，使提取效率降低。因此，在下一步試驗(yàn)中選擇1∶25 g/mL固液比進(jìn)一步研究。

2.3 溶劑含水率對木脂素提取率的影響

試驗(yàn)研究了相同的微波輔助提取條件下，溶劑含水率為30%、40%、50%對厚樸渣中兩種木脂素類化合物的提取率的影響（圖3）。總體而言，隨著含水率的增加，厚樸酚、和厚樸酚的提取率逐漸下降。當(dāng)含水率為30%時(shí)，總提取率最高（32.87 mg/g），并且隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，兩者的提取率均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢。當(dāng)含水率增至40%和50%，厚樸酚、和厚樸酚的提取率迅速下降，總提取率25.22 mg/g下降到14.44 mg/g。原因可能是高含水率會(huì)增加萃取介質(zhì)的極性，破壞了ChCl-La溶劑與厚樸酚、和厚樸酚之間的氫鍵結(jié)合，從而對厚樸酚、和厚樸酚的提取產(chǎn)生了不利影響。并且在含水率為40%和50%時(shí)，在相同時(shí)間下，提高溫度對厚樸酚的提取率有顯著促進(jìn)作用，而對和厚樸酚的提取率影響較小。

2.4 DES組成摩爾比對木脂素提取率的影響

綜合分析固液比與含水率的影響可知，提取條件為90 ℃、1.5 h時(shí)，黃酮的總提取率比較高，因此，選擇此條件作為固液比優(yōu)化的反應(yīng)條件。在提取條件為微波功率160 W、含水率30%基礎(chǔ)上，分析摩爾比為1∶2、1∶3、1∶4對木脂素類化合物提取率的影響。結(jié)果表明，隨著摩爾比的增加，厚樸酚、和厚樸酚的提取率呈現(xiàn)先降低后略微增加的趨勢（圖4），可能是因?yàn)镈ES體系中氫鍵受體比例的降低，造成目標(biāo)化合物與溶劑之間氫鍵的形成受到限制，此外，乙酰丙酸比例的增加，使溶劑整體的極性增加，而厚樸酚、和厚樸酚兩種化合物的極性較低，導(dǎo)致二者提取率反而下降。

綜上所述，當(dāng)氯化膽堿/乙酰丙酸摩爾比1∶2、含水率30%、固液比1∶25 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間1.5 h時(shí)，和厚樸酚、厚樸酚的提取率最高，分別為9.93、22.95 mg/g，總提取率為32.87 mg/g。采用中國藥典甲醇法提取厚樸渣，在相同條件下得到總木脂素提取率為6.64 mg/g，使用DES的總提取率相比中國藥典甲醇法提高了395.03%。

圖2 不同固液比的ChCl-La對木脂素類化合物的提取率Fig.2 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different solid-liquid ratios

圖3 不同含水率的ChCl-La在對木脂素類化合物的提取率Figure 3 Extraction rate of lignanoids by the solvents with different water contents

圖4 不同組成摩爾比的ChCl-La對木脂素類化合物的提取率Fig.4 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different molar ratios

2.5 DES形成及萃取木脂素類化合物的機(jī)理分析

基于密度泛函理論的自洽場分子軌道法在M06-2X/6-311G**基組水平上對和厚樸酚、厚樸酚和本文選用的DES（ChCl-La）以及相應(yīng)低共熔溶劑-木脂素類化合物體系進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化，得到其最穩(wěn)定構(gòu)型。為了直觀刻畫木脂素類化合物與低共熔溶劑分子結(jié)構(gòu)之間的相互作用，本文對優(yōu)化的復(fù)合體系進(jìn)行Kohn-Shame波函數(shù)計(jì)算，并基于約化密度梯度（RDG）方法對復(fù)合體系的分子間相互作用進(jìn)行可視化分析。

和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La的 RDG 等值面和填色分析結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，和厚樸酚、厚樸酚的喹啉環(huán)中存在明顯的紅色棱形區(qū)域，說明六元環(huán)中較強(qiáng)的位阻效應(yīng)，與散點(diǎn)圖中對應(yīng)（+0.01，+0.05）之間的紅色部分相吻合。綠色和墨綠色片狀明顯分布在和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La中間區(qū)域，以及ChCl-La之間，對應(yīng)散點(diǎn)圖中（-0.02，0.01）部分，證實(shí)了ChCl-La的Cl原子與厚樸酚、厚樸酚之間的弱相互作用主要表現(xiàn)為氫鍵作用力。此外，厚樸酚的兩個(gè)氧甲基之間也存在少量藍(lán)色片狀分布，對應(yīng)散點(diǎn)圖中的（-0.05，-0.02）之間的藍(lán)色部分，是厚樸酚分子內(nèi)氫鍵相互作用的體現(xiàn)。因此，RDG 等值面和散點(diǎn)分析形象直觀地說明和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La之間的作用力主要是弱相互作用，表現(xiàn)為范德華力和氫鍵作用。

物質(zhì)的互溶度是由溶質(zhì)和溶劑的分子間相互作用力來決定的，溶劑對溶質(zhì)的溶解在于溶質(zhì)－溶劑間的相互作用能夠抵消溶質(zhì)－溶質(zhì)、溶劑－溶劑間的相互作用，即溶解過程自由能變小于0。為了考察DES對木脂素類化合物的萃取能力，利用高斯軟件計(jì)算ChCl-La與厚樸酚、和厚樸酚的結(jié)合能。計(jì)算結(jié)果表明，ChCl-La與厚樸酚的分子間相互作用結(jié)合能為-81.386 kJ/mol，即ChCl-La和厚樸酚的相互作用為放熱過程，二者的結(jié)合在能量上是有利的；ChCl-La與和厚樸酚的分子間相互作用結(jié)合能為280.297 kJ/mol，即ChCl-La和厚樸酚的相互作用為吸熱過程，二者的結(jié)合在能量上是不利的。由此可見，ChCl-La與厚樸酚分子之間結(jié)合更加緊密，故ChCl-La對厚樸酚萃取能力大于和厚樸酚。

圖5 ChCl-La-木脂素類化合物相互作用的填色圖Fig.5 Color-filled maps of intermolecular interactions between ChCl-La and lignanoids

3 結(jié) 論

1）合成了10種綠色、環(huán)保、成本低的低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DES）用于提取厚樸渣中和厚樸酚、厚樸酚兩種木脂素類化合物，其中，氯化膽堿/乙酰丙酸（ChCl-La）提取效率最高?？疾炝薈hCl-La的DES組成摩爾比、含水率、固液比、提取溫度和時(shí)間等因素對兩種木脂素類化合物提取率的影響，提取工藝參數(shù)：摩爾比1∶2、固液比為1∶25 g/mL、溶劑含水率為30%、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間1.5 h，和厚樸酚、厚樸酚的提取率最高分別為 9.93、22.95 mg/g，總提取率為32.87 mg/g。

2）對ChCl-La與木脂素類化合物的量子化學(xué)分析表明，DES形成過程相互作用力以氫鍵作用為主，以范德華力為輔，無共價(jià)鍵、離子鍵等化學(xué)鍵形成。DES對厚樸酚提取過程，氫鍵作用發(fā)揮主要作用；DES提取和厚樸酚過程，以范德華力等弱作用力為主，無氫鍵形成。綜上可見，低共熔溶劑與提取物之間氫鍵強(qiáng)度顯著影響提取效果的差異，通過現(xiàn)代密度泛函理論的分子模擬計(jì)算低共熔溶劑與提取功效成分的相互作用，可指導(dǎo)快速篩選優(yōu)良溶劑。