基于高通量測序技術(shù)的燕窩罐頭腐敗嗜熱菌分析

范力藝，范群艷，胡嘉淼，張 怡※

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 中糧生物科技股份有限公司，北京 100101；3. 中糧營養(yǎng)健康研究院，北京 102200；4. 中糧融氏生物科技有限公司，上海 201500；5. 廈門燕之屋絲濃食品有限公司，廈門 360000）

0 引 言

嗜熱菌是指在40～70 ℃能正常生長繁殖的菌群，其最適生長溫度一般在50～60 ℃。研究表明嗜熱菌只要很少殘留于罐頭食品中，就會在罐頭食品儲運過程中大量繁殖從而造成產(chǎn)品腐敗，由于其極強的抗逆性，因此在熱殺菌強度較高的高溫高壓殺菌方式都難以在最終產(chǎn)品中完全將其殺死。并且嗜熱菌（莫氏菌屬）在121 ℃下的值（表示在特定的環(huán)境中和特定的溫度下，殺滅1個對數(shù)值的微生物所需要的時間）為30 min，（地芽孢桿菌屬）在121 ℃下的值為1～6 min。而大多數(shù)食品在以熱處理滅活嗜熱菌芽孢的殺菌強度下，即殺菌時間至少達(dá)到6時，品質(zhì)無法得到維持。另外，嗜熱菌能夠在生產(chǎn)線上的器具和設(shè)備表面繁殖形成生物膜，從而加大了消毒清洗的難度。再加上嗜熱菌能夠在不同的環(huán)境中生長，并且可以通過原料、土壤、水或者加工過程進(jìn)入產(chǎn)品，從而加大了生產(chǎn)過程中的控制難度。

由嗜熱菌所引起食品變質(zhì)的食品安全問題在食品行業(yè)受到廣泛的關(guān)注，嗜熱菌引起罐頭食品感官特性的變化，不但會引起食品安全問題，而且還會給企業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。有研究表明，蔬菜罐頭生產(chǎn)線上的嗜熱菌污染很可能來自于土壤或者在蔬菜準(zhǔn)備階段時人員污染。關(guān)于青豆罐頭生產(chǎn)線上微生物污染的調(diào)查報告也證實了嗜熱菌污染包含原料的初始污染和生產(chǎn)鏈上的交叉污染。在乳制品行業(yè)也有關(guān)于嗜熱菌污染的研究報道。因此，嗜熱菌可以在各個食品行業(yè)造成微生物污染，且嗜熱菌在低酸罐頭中除了具有極強的抗逆性，還具有生長廣泛性的特點，涉及食品品類非常多。Andre等收集了法國2002－2012年間變質(zhì)罐頭類食品39種，共462份，結(jié)果表明大部分罐頭類食品變質(zhì)的原因是由嗜熱菌引起：在所有變質(zhì)罐頭類食品中（穆爾氏菌屬）污染占比36%、（地芽孢桿菌屬）占比35%、（桿菌屬）占比10%，還有9%腐敗罐頭樣品由于（芽孢桿菌屬）引起的。而通常所說的罐頭平酸酸敗就是指屬中的（嗜熱脂肪地芽孢桿菌屬）引起的罐頭腐敗。

燕窩（L.）是指雨燕科（）幾種金絲燕分泌出來的唾液，再混合苔鮮、海藻和柔軟植物筑成的巢穴，又稱燕菜、燕根、燕蔬菜，自明代以來就是中國名貴的滋補食品之一。燕窩富含蛋白質(zhì)、氨基酸，且其富含的唾液酸具有很高的營養(yǎng)價值和保健功效。2019年中國進(jìn)口干燕窩已達(dá)65.5 t，同比增長27.4%，已成為全球最大的燕窩進(jìn)口國家。隨著時代發(fā)展，消費者對于簡潔時尚化食品的需求日益增加，健康、方便的飲食概念深入人心，燕窩由于泡發(fā)耗時、除毛耗力、燉煮耗功，其家庭烹制難以大規(guī)模推廣，鮮燉燕、碗燕等即食燕窩罐頭產(chǎn)品應(yīng)運而生，此類產(chǎn)品仿照罐頭產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，在保證美味食感的基礎(chǔ)上提供了更加便捷的食用方式。但由于燕窩罐頭屬于低酸性罐頭，且燕窩罐頭具有加工工序多的特點，因此燕窩罐頭容易在冗長的加工過程中被嗜熱菌污染，最終的燕窩罐頭產(chǎn)品受限于燕窩原料的加工強度而無法完全殺死嗜熱菌，從而發(fā)生腐敗變質(zhì)。由于燕窩價格昂貴，很難在生產(chǎn)線上對最終產(chǎn)品進(jìn)行大量抽檢，對分析腐敗原因造成了阻礙。目前關(guān)于燕窩的研究也越來越多，但之前的研究多是集中于燕窩的營養(yǎng)保健功能方面，少有關(guān)于燕窩微生物安全方面的研究，而由于嗜熱菌引起的即食燕窩罐頭腐敗問題未見報道。因此，本研究提出兩種驗證假設(shè)，通過16S rRNA擴增子高通量測序結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法，對比燕窩罐頭生產(chǎn)線上原料、工序和終產(chǎn)品的微生物組成。主成分分析法確定假定腐敗微生物、核心微生物、污染來源，再通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）聚類分析找出生產(chǎn)線上關(guān)鍵控制點，以期為燕窩罐頭安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)與防控方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

根據(jù)前期研究表明，嗜熱菌污染來源可能來自于原料也可能來自于工序，筆者考慮了兩種假說來解釋燕窩罐頭的污染。假設(shè)一是在同一燕窩生產(chǎn)線灌裝后產(chǎn)品與原料所包含的微生物群或者嗜熱菌存在差異，則認(rèn)為腐敗微生物不是由原料代入，而是由生產(chǎn)線的工序代入最終產(chǎn)品，因此將調(diào)查哪些工序攜帶了哪些潛在的腐敗微生物進(jìn)入到燕窩到生產(chǎn)線；另一種假說是同一燕窩生產(chǎn)線灌裝后產(chǎn)品與原料有著相同的微生物或者嗜熱菌組成，在這種情況下，則認(rèn)為腐敗微生物由原料代入生產(chǎn)線，這樣能夠確定包括假定腐敗細(xì)菌在內(nèi)的核心微生物群，并且根據(jù)主成分（Principal Component Analysis）分析確定生產(chǎn)線上與原料相關(guān)聯(lián)的幾個關(guān)鍵控制工序。本試驗假定腐敗嗜熱微生物為上述所提到的幾種罐頭主要腐敗微生物：、、、。

燕窩樣品來源于廈門的一家燕窩公司，生產(chǎn)工序流程如圖1所示，每個樣品分3個批次取樣，同批次中隨機取樣5次混合成一個批次，采樣點工序?qū)?yīng)表1所示。

1.1.2 儀器與設(shè)備

E.Z.N.A.? soil試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司），0.4L FastPfu聚合酶（中國TransGen公司），引物（上海生工公司）：338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，2%瓊脂糖（西班牙Biowest公司），AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒 （美國Axygen Biosciences公司），PCR儀：GeneAmp? 9700型（美國ABI公司），微型熒光計：QuantiFluor?-ST（美國Promega公司），高通量測序儀：Illumina MiSeq（美國Illumina公司）。

圖1 燕窩罐頭生產(chǎn)工序流程圖Fig.1 Process diagram of edible bird nest cans production process

表1 采樣點工序Table 1 Sampling point procedure

1.2 DNA抽提和PCR擴增

鑒定抽提DNA的濃度和純度，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；擴增程序：預(yù)變性（95 ℃，3 min），變性（95 ℃，30 s），退火（55 ℃，30 s），延伸（72 ℃，30 s），延伸（72 ℃，10 min）。擴增整個體系為20L，4L 5FastPfu 緩沖液，2L 2.5 mmol/L dNTPs，0.8L引物（5mol/L），0.4L FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。測序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 Illumina Miseq測序

以2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction 試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。使用微型熒光計進(jìn)行檢測定量。根據(jù)高通量測序儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。構(gòu)建文庫步驟：1）連接“Y”字型接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴增進(jìn)行文庫模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Miseq PE300平臺進(jìn)行測序。

1.4 高通量測序鑒定

取樣5個批次冰糖，5個批次燕窩，管道內(nèi)壁用棉簽涂抹的方法分5個不同時間段進(jìn)行取樣。采用AFNOR-CNERNA的標(biāo)準(zhǔn)重新激活樣品中的芽孢，在錐形瓶中每10 g的樣品用100 mL的牛肉湯培養(yǎng)基配制，放置于37與55 ℃（嗜熱微生物通常在這兩個溫度下生長），采用無氧（石蠟封口）與有氧條件分別培養(yǎng)7 d，然后搖勻后吸取錐形瓶中液體0.1 mL在錳鹽瓊脂培養(yǎng)基上置于37與55 ℃，仍然采用無氧（石蠟封口）與有氧條件下培養(yǎng)。之后用十倍稀釋法，多次分離單菌落用于分子學(xué)鑒定。DNA提取及16S rDNA高通量測序分析：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，將提取的16S rDNA進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)過程為94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，最終冷卻至4 ℃，擴增結(jié)果再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴增效果，若出現(xiàn)1.5 kb的條帶，則證明擴增出了16SrDNA序列。將擴增產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫NCBI BLAST比對后，再通過Clustal X1.8軟件將代表序列與數(shù)據(jù)庫中所得序列進(jìn)行完全比對，利用MEGA5.0軟件Neighbor.Joining法進(jìn)行1 000次步長計算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用QIIME（Version1.7.0）計算豐富度指數(shù)ACE、Chao1與多樣性指數(shù)Simpson。然后再劃分最小分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），通過FastTree工具構(gòu)建OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。再通過R軟件聚類分析PCA分析通過線性變換，將原始的高維數(shù)據(jù)（如菌群OTU豐度矩陣）通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標(biāo)系（即主成分）中，從而達(dá)到降維、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的目的，展現(xiàn)樣本的自然分布。使用Mothur軟件，調(diào)用Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）的統(tǒng)計學(xué)算法，對門、屬及種水平的各個分類單元在樣本（組）之間的序列量（即絕對豐度）差異進(jìn)行兩兩比較檢驗。采用DPS軟件分析數(shù)據(jù)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕窩罐頭原料與生產(chǎn)工序細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

對各樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行顯著性分析確定微生物菌群在工序中是否有顯著變化，若樣品的ACE和Chao1指數(shù)都有顯著性，可以認(rèn)為這個工序是高危工序。由于樣品YW1、YW2、YW4、YW5屬于冰糖灌裝生產(chǎn)線，YW3、YW6、YW7屬于另外一條燕窩處理生產(chǎn)線，YW8為兩種原料灌裝混合后的產(chǎn)品，因此兩條生產(chǎn)線單獨分析，并且在分析時可以先剔除YW3、YW4兩個非原料工序（毛巾）。如表2所示，在冰糖的灌裝工序中YW5相比YW2微生物的的ACE和Chao1指數(shù)都顯著增加（0.05），表明灌裝液在經(jīng)過管道時微生物多樣性增加，有可能管道內(nèi)壁由于生物膜的附著會帶入更多的微生物，這可能是一個需要關(guān)注的高危工序。YW3樣品ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最大，這說明了挑毛車間的毛巾也可能是一個要關(guān)注的高?？刂泣c，在生產(chǎn)實際中干燕窩原料在挑毛池中經(jīng)過無菌水泡發(fā)再過濾水分后，需要使用挑毛車間的毛巾擦拭桌面水滴，因此毛巾可能被多種燕窩原料中攜帶的微生物污染。燕窩是金絲燕分泌出來的唾液，混合苔鮮、海藻和柔軟植物筑成的巢穴，不同地區(qū)的苔鮮、海藻和柔軟植物攜帶微生物種類都可能不同，因此燕窩中被污染的微生物種類多。Simpson這個反映細(xì)菌均勻度的指數(shù)沒有顯著差異，這也表明了沒有特別優(yōu)勢的微生物在生產(chǎn)過程繁殖。研究結(jié)果表明，冰糖灌裝工序，微生物的多樣性增加。

表2 燕窩罐頭生產(chǎn)工序細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果Table 2 Results of Alpha diversity index of bacterial community in edible bird nest's cans production procedure

2.2 燕窩罐頭原料與不同生產(chǎn)工序中微生物群落的分析

燕窩罐頭原料與不同生產(chǎn)工序中微生物群落的門和屬水平上的相對豐度如圖2。8個樣品中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria（變形菌門）、Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）（圖2a）。從圖2b屬水平來看樣品中的優(yōu)勢菌屬為（不動桿菌屬屬），這是一種常在人體中分離出的微生物；（異常球菌屬），此類微生物耐受性強，并且可能引起食品形成紅色菌斑；（瓦菌屬），此類微生物多見于呼吸道感染，屬于條件致病菌，一旦感染臨床治療困難較大。如圖2c熱力圖所示，YW1、YW2、YW3、YW4、YW5和YW8有著相同的優(yōu)勢菌屬和，YW6和YW7有著相同的優(yōu)勢菌屬，YW3的優(yōu)勢菌不同于另外幾個樣品；并且熱力圖表明，優(yōu)勢菌屬從燕窩原料（YW6）到灌裝后產(chǎn)品（YW8）的過程明顯減少（熱圖色塊從紅色變?yōu)榫G色），優(yōu)勢菌屬和從冰糖原料（YW1）到灌裝后產(chǎn)品（YW8）過程中也明顯減少，這表明這3種優(yōu)勢菌屬會在加工過程中減少，并且以往研究也表明這3種優(yōu)勢菌都不是引起罐頭腐敗的嗜熱菌，因此需要對樣品微生物進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖2 燕窩罐頭不同生產(chǎn)工序中微生物群落的樣品門水平、樣品屬水平、樣品熱力圖Fig.2 Phylum and genus level of microbial community and heatmap in different production processes of edible bird's nest cans

燕窩罐頭原料與不同生產(chǎn)工序中的嗜熱脂肪芽孢桿菌的檢測結(jié)果如表3所示，樣品YW1、YW2、YW4、YW5、YW8發(fā)現(xiàn)了，YW6、YW7、YW8中發(fā)現(xiàn)了，并且還在YW3中發(fā)現(xiàn)了。有研究表明，這3種微生物為罐頭主要腐敗微生物。Cameron綜述了在糖類中發(fā)現(xiàn)的嗜熱菌，并證明冰糖中的嗜熱菌是罐頭產(chǎn)業(yè)的重要安全隱患，這個結(jié)果與本文的研究結(jié)論一致。常存在于土壤與干燥環(huán)境中，其生長環(huán)境特點符合燕窩建造的材料（混合苔鮮、海藻和柔軟植物）與本身低水分的理化環(huán)境（含水率＜25%）的要求。在試驗中除冰糖原料和干燕窩原料中發(fā)現(xiàn)嗜熱菌，還在挑毛工序的擦拭毛巾中發(fā)現(xiàn)了，這種熱抵抗能力強的微生物在罐頭工藝工序中被發(fā)現(xiàn)，因此還需要對該工序的毛巾著重監(jiān)控殺菌。從結(jié)果來看冰糖原料攜帶的兩種嗜熱菌在其相關(guān)工序與灌裝后產(chǎn)品（YW8）都被檢出，這表明很可能是這兩種嗜熱微生物隨著冰糖原料沿著相關(guān)工序一直攜帶到最終產(chǎn)品。

表3 不同生產(chǎn)工序中的嗜熱菌屬Table 3 Bacillus thermophilus in different production processes

2.3 燕窩罐頭原料及不同生產(chǎn)工序中微生物聚類分析

燕窩罐頭原料與不同生產(chǎn)工序中微生物聚類分析見圖3，將3個平行樣品平均值后再通過PCA分析將繁雜工序聚類成關(guān)聯(lián)工序，菌群結(jié)構(gòu)相似的工序在圖中表示出更近的距離，以此找到生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵控制點。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)YW1、YW2、YW4、YW5、YW8中微生物群落結(jié)構(gòu)相似，YW6、YW7中微生物群落相似，YW3微生物群落結(jié)構(gòu)與其他樣品不同。實際生產(chǎn)中YW1、YW2、YW4、YW5、YW8 都是與冰糖聯(lián)系非常密切的工序，因此有著很強的關(guān)聯(lián)性；YW6、YW7是干燕窩處理前后的原料，因此微生物結(jié)構(gòu)相似；YW3不同于其他工序。

圖3表明，冰糖原料YW1與灌裝后產(chǎn)品YW8微生物菌群結(jié)構(gòu)相似，圖2c顯示YW1與YW8優(yōu)勢均屬相同，且表3的檢測結(jié)果也表明，灌裝后產(chǎn)品與冰糖原料腐敗微生物相同，都包含了和，因此從整體結(jié)果來看符合假設(shè)二中所述的微生物污染來自于原料YW1而非工序，從而推斷了產(chǎn)品中的與可能是由冰糖原料代入。雖然燕窩原料的菌群結(jié)構(gòu)與灌裝后產(chǎn)品不相似，但由于燕窩原料中也攜帶了這種燕窩罐頭中腐敗微生物，因此干燕窩原料也極有可能引入也需要對干燕窩原料與相關(guān)工序進(jìn)行控制。以上研究確定了嗜熱菌的污染來自于原料而非工序，因此還需要確定原料相關(guān)工序是否是高危工序。

圖3 燕窩罐頭不同生產(chǎn)工序中的微生物主成分分析Fig.3 PCA analysis of microorganisms in different production processes of edible bird's nest cans

2.4 燕窩罐頭冰糖原料及與冰糖相關(guān)工序所取樣本間微生物分類學(xué)組成的差異分析

在以上分析基礎(chǔ)上，再針對兩種原料經(jīng)過不同工序時微生物分類學(xué)組成的差異性進(jìn)行分析，從而發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵腐敗微生物是否在不同加工工序中增加。圖4為燕窩罐頭冰糖原料及與冰糖相關(guān)工序所取樣本間微生物分類學(xué)差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對罐頭食品安全威脅很大的在冰糖原料及與冰糖相關(guān)工序之間有明顯的增長，但是圖4燕窩處理過程中此類微生物沒有顯著增長。在磷酸鹽緩沖液中為10 min（磷酸鹽緩沖液中以113 ℃殺死一個對數(shù)值需要10 min），并且研究已經(jīng)證實了在介質(zhì)中比在純水中有更高的耐熱值，因此會對罐頭食品微生物安全造成很大威脅。圖4表明（YW1-YW2）之間沒有顯著差異（＞0.05），說明了冰糖原料到蒸煮鍋的過程沒有明顯增長，但是（YW2-YW5）有了極顯著增長（＜0.01），因此可以判斷冰糖液經(jīng)過管道輸送后明顯增加，且Aphlha多樣性分析表明YW1、YW2、YW5中YW5有著更高的微生物多樣性，這很可能與管道內(nèi)部附著的生物膜有關(guān)，隨著生物膜積累而增加。有研究表明，微生物在管道內(nèi)部形成生物膜會嚴(yán)重威脅人體健康。早期報道了利用16S rRNA技術(shù)研究飲用水生產(chǎn)管道內(nèi)壁中存在的生物膜和水體中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)管道內(nèi)壁上生物膜的微生物多樣性高于水體中微生物多樣性。并且還證實了管內(nèi)壁上附著的生物膜的微生物數(shù)量比水體中的微生物數(shù)量更多，并且因為多種因素（如水流剪切力等）都會導(dǎo)致生物膜從管壁上脫落進(jìn)入水體中。研究揭示生物膜在形成的過程主要包括可逆性吸附階段、不可逆性吸附階段、群落形成階段、生物膜成熟階段及最后老化階段后脫落水體中。因此，YW5灌裝口糖液微生物多樣性與的顯著增長應(yīng)該是由于管道內(nèi)壁生物膜脫落造成的。另外管道長期輸送80 ℃以上的糖液，由于在更高的產(chǎn)芽孢溫度下產(chǎn)生的芽孢通常有著更高的熱抵抗能力，因此殘留在管道內(nèi)壁生物膜中的微生物通常是對熱抵抗能力很強的嗜熱菌，管道內(nèi)的嗜熱菌生物膜對食品安全威脅更高。這與本文的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了冰糖液經(jīng)過管道是一個高位工序相互印證了管道內(nèi)壁的生物膜存在極高的食品安全隱患，因此企業(yè)需要加大對管道內(nèi)壁清洗頻率、改善清潔方法以保障食品安全。另外從圖中可以發(fā)現(xiàn)、、（蒼白桿菌屬）、（沙門桿菌屬）在YW1-YW2工序中變化較大，（沙雷氏菌屬）在YW1-YW2工序中變化較大。這4個菌屬都是典型的人體攜帶菌。這表明灌裝工序應(yīng)該注意操作人員對產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制。

圖4 冰糖原料經(jīng)過相關(guān)工序微生物分類學(xué)組成的差異分析Fig.4 Differential analysis of microbial taxonomy composition of of rock sugar raw materials

圖5 燕窩原料經(jīng)過相關(guān)工序微生物分類學(xué)組成的差異分析Fig.5 Differential analysis of microbial taxonomy composition of edible bird's nest raw materials relevant with procedures

2.5 燕窩罐頭生產(chǎn)原料和關(guān)鍵工序中微生物的培養(yǎng)與鑒定

通過16S rRNA檢測發(fā)現(xiàn)冰糖原料中攜帶了、，干燕窩攜帶了，這兩種微生物均為罐頭原料中的主要腐敗菌屬；再通過多樣性指數(shù)顯著性分析與分類學(xué)組成的差異分析確定危險工序為冰糖液輸送管道。因此，針對這兩種原料和管道內(nèi)壁這3個生產(chǎn)關(guān)鍵控制點，進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)原料和危險工序中所攜帶微生物的種。

通過55 ℃培養(yǎng)分離鑒定結(jié)果如表4，干燕窩的菌種分離出了一種嗜熱菌，在冰糖中分離出了兩種嗜熱菌，在管道內(nèi)壁表面分離出了兩種嗜熱菌。再通過圖6發(fā)育樹證明了編號為a、b菌與有很高的相似度都屬于屬，c、e菌也為屬，d菌屬于屬。通過NCBI比對結(jié)果，表4顯示干燕窩中的菌種a很可能為，d和e為冰糖輸送管道中的分離出的兩個種，其中一個為，另外一個通過基因比對最高相似度只有97.43%，因此為潛在新菌種。除了c菌報道較少，其他菌種在早期都有研究，在法國腐敗罐頭調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)了和，其中的值為10 min，的值為7.95 min（100 ℃殺死1個對數(shù)值需要7.95 min），但在不同介質(zhì)中值變化較大，并且它經(jīng)常從腐敗罐頭中分離出來，因此有必要將其接種到燕窩溶液中做進(jìn)一步研究。從分離鑒定結(jié)果來看，管道內(nèi)壁的微生物中還分離出了一種潛在新菌種，這種菌與奶粉中分離出的有著很強的親緣關(guān)系，并且根據(jù)早期研究表明可以在120～125 ℃存活30 min。再從發(fā)育樹來看與罐頭常見腐敗微生物嗜熱脂肪地芽孢桿菌有很強的情緣關(guān)系同屬于屬，從序列親緣關(guān)系來看，這種微生物有著很強的熱抵抗能力。因此從分離培養(yǎng)來看，管道工序仍然是一個需要重點關(guān)注的高危工序。

表4 燕窩原料、冰糖原料與管道內(nèi)壁分離出的嗜熱菌Table 4 Thermophilic bacteria isolated from edible bird's nest raw material, rock sugar raw material and the inner wall of the pipe

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離結(jié)合分子生物學(xué)鑒定了燕窩罐頭原料和危險工序中的嗜熱微生物，發(fā)現(xiàn)了罐頭中易分離出的和還發(fā)現(xiàn)了與這種熱抵抗能力很強的微生物有著很近親緣關(guān)系的潛在新嗜熱菌菌種，為今后燕窩企業(yè)生產(chǎn)過程中微生物的防控指導(dǎo)提供了一定的理論依據(jù)。

圖6 基于16S rRNA序列的分離出的嗜熱菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of thermophiles bacteria in samples based on 16S rRNA sequence

3 討 論

本文通過16S rRNA高通量測序技術(shù)對燕窩罐頭原料及各個工序中的微生物群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冰糖原料與燕窩罐頭灌裝后產(chǎn)品的優(yōu)勢菌屬相似，并且都存在這種可能對產(chǎn)品顏色造成影響的微生物菌屬與這種條件致病菌，還發(fā)現(xiàn)干燕窩中的優(yōu)勢菌屬為這種經(jīng)常可以從人體分離出的微生物菌屬，以此推測這是干燕窩儲運過程人為接觸的污染。同時，在冰糖原料、干燕窩原料中發(fā)現(xiàn)了，結(jié)合PCA聚類分析燕窩罐頭原料及各個工序中的微生物，結(jié)果證明原料與灌裝后產(chǎn)品有著相同腐敗菌與優(yōu)勢菌，證明了腐敗微生物的來源為燕窩罐頭原料而非加工工序。

此外通過樣本間分類學(xué)差異性分析，發(fā)現(xiàn)輸送冰糖液的管道中顯著增加。但是由于16S rRNA高通量測序方法不論是否為活菌都會鑒定出來，為了篩選出活的嗜熱菌，因此通過培養(yǎng)分離再結(jié)合16S rRNA與系統(tǒng)發(fā)育樹方法鑒定出5種存活的嗜熱菌，以往研究證實了序列與其較為接近的有著很強的耐熱性，在125 ～130 ℃的高溫下殺菌30 min仍然不能保證食品的安全性，然而在生產(chǎn)過程中管道內(nèi)冰糖液體的溫度最多達(dá)到100 ℃，因此輸送冰糖的管道內(nèi)存活的嗜熱菌很可能通過冰糖液體代入最后燕窩罐頭中，因此該工序有著很大的安全隱患。并且早有研究表明熱灌裝的管道內(nèi)部會產(chǎn)生耐熱性更強的微生物，并且管道內(nèi)形成的生物膜的脫落會對后續(xù)灌裝工藝造成很大食品安全隱患，而用普通針對生產(chǎn)線的安全監(jiān)管已經(jīng)無法保證最后罐頭達(dá)到商業(yè)無菌水平。通過分析管道內(nèi)壁僅僅接觸了冰糖液體，由此得出結(jié)論該微生物的來源是冰糖，因此應(yīng)該著重對原料進(jìn)行控制，如采購冰糖原料時利用16S rRNA技術(shù)確保其中沒有超強的耐熱菌種，或者針對原料進(jìn)行預(yù)處理，先將冰糖在高溫高壓條件下溶解加熱，減少或者完全殺死嗜熱微生物再將后續(xù)冰糖液體輸送管道，以此確保后續(xù)工序的安全性。以往研究表明因為罐頭產(chǎn)品極低不良率抽檢100個成品都可能無法檢測到嗜熱菌，但也無法保證其他罐頭不被嗜熱菌污染，因此罐頭食品的嗜熱菌檢測也極為困難。通常罐頭食品殺菌標(biāo)準(zhǔn)需要在121 ℃后將不良率控制在十萬分之一以下，而燕窩罐頭不同一般罐頭產(chǎn)品，其極高商品價值與企業(yè)品牌價值，對最后產(chǎn)品不良率的期望值更為苛刻，因此這是一個極大的挑戰(zhàn)。

本文參考之前針對雞肉生產(chǎn)線上腐敗微生物來源分析，通過16S rRNA結(jié)合了兩種假設(shè)的方法，可以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)腐敗微生物來源，該方法也是一種非常適合其他食品生產(chǎn)線上的品質(zhì)控制與腐敗微生物調(diào)查的方法，可以在各食品企業(yè)推廣應(yīng)用，為企業(yè)微生物安全防控提供了一定理論指導(dǎo)方向。這種整體探究的方法也為之后學(xué)術(shù)深入研究提供很好的指導(dǎo)方向，如可在之后的研究中進(jìn)一步探究管道中生物膜隨著時間的變化發(fā)生變化，進(jìn)一步通過形態(tài)學(xué)與理化性質(zhì)確認(rèn)并鑒定嗜熱菌，還可以研究分離出的嗜熱菌在不同介質(zhì)中的耐熱性等。

4 結(jié) 論

基于高通量測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，對燕窩罐頭生產(chǎn)過程中不同工序的微生物多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在灌裝過程中糖液微生物多樣性顯著增加，這可能是微生物污染風(fēng)險較高的生產(chǎn)工藝；（不動桿菌屬屬）、（異常球菌屬）、（瓦菌屬）為燕窩罐頭生產(chǎn)中的優(yōu)勢菌，但是結(jié)合熱力圖分析表明，這3種優(yōu)勢菌會在生產(chǎn)過程中減少，并且證實了這3種優(yōu)勢菌不是罐頭主要腐敗嗜熱菌。熱力圖分析與主成分分析法表明罐裝后產(chǎn)品與冰糖原料有著相似的菌群結(jié)構(gòu)與相同的優(yōu)勢菌屬，并且測序結(jié)果證實冰糖原料與最終產(chǎn)品有著相同的腐敗嗜熱菌，因此推斷出嗜熱菌是由冰糖原料引入的。再通過對冰糖及其相關(guān)工藝樣品的微生物分類差異分析，發(fā)現(xiàn)典型的罐頭腐敗菌在冰糖管道內(nèi)輸過程中顯著增加，進(jìn)一步說明了冰糖管道輸送工序應(yīng)該作為關(guān)鍵控制工序重點監(jiān)控。

最后針對燕窩原料、冰糖原料及輸送冰糖管道內(nèi)的嗜熱菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在燕窩原料、冰糖原料、輸送冰糖液的管道中存在5種嗜熱菌（其中兩種是同一種但是登記號不同）。其中從管道中分離出的是一種常見罐頭腐敗嗜熱菌，而分離出的另一種嗜熱菌是一種常存在于管道中，這表明運輸冰糖的管道可能殘留嗜熱細(xì)菌，因此，在燕窩罐頭生產(chǎn)中，運輸運輸冰糖的管道應(yīng)該作為高風(fēng)險工序重點關(guān)注。綜上所述，本研究證實了冰糖很可能是食用燕窩罐頭生產(chǎn)過程中嗜熱微生物污染的主要來源，另外與冰糖有關(guān)的工序特別是輸送冰糖液的管道，存在較高的微生物污染風(fēng)險，應(yīng)引起高度重視。