牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌的miRNA轉(zhuǎn)錄組分析

山亞男，鄭津輝，高 虹

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬鰈形目（Pleuronectiformes）牙鲆科（Paralichthyidae）牙鲆屬（Paralichthys），是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類.牙鲆生長過程中易感染細(xì)菌、病毒和真菌等，從而引發(fā)疾病，影響牙鲆的產(chǎn)量和品質(zhì).由于細(xì)菌感染導(dǎo)致的發(fā)病率較高且傳染性強(qiáng)，比病毒和真菌的覆蓋面更廣泛[1-2]，因此細(xì)菌感染致病是牙鲆養(yǎng)殖研究中需要重點(diǎn)解決的問題.遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有嚴(yán)重危害的致病菌，主要通過魚類的消化道、鰓或受傷表皮侵入魚體[3]，目前發(fā)現(xiàn)該種細(xì)菌能夠在二十多種魚類中引發(fā)病害，如牙鲆、中華鱉、鯉魚等.遲鈍愛德華氏菌是一種人、魚共患病原菌[4-5]，對(duì)人類健康存在潛在威脅.全面深入研究牙鲆對(duì)遲鈍愛德華氏菌免疫應(yīng)答的分子機(jī)理，能夠?yàn)榻⒁环N有效的可預(yù)防和控制該病菌感染的免疫防治新方法提供理論基礎(chǔ).

MicroRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA，通過識(shí)別同源序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯或表觀遺傳過程來調(diào)控基因表達(dá).目前對(duì)魚類miRNA的研究相對(duì)較少，大部分miRNA的研究還是集中在疾病、常見動(dòng)物或者植物方面[6-7].mi RNA在魚類的免疫系統(tǒng)中有重要作用，很多差異表達(dá)miRNA參與入侵感染所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，表達(dá)量被上調(diào)或下調(diào).如Sha等[8]研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨被鰻弧菌侵染后，其肝臟、頭腎、脾和腸中有10個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNA；Xia等[9]研究發(fā)現(xiàn)，尖吻鱸感染弧菌后，體內(nèi)檢測(cè)到了63種miRNA，其中34種表達(dá)量上升，12種表達(dá)量下降；Ordas等[10]使用沙門氏傷寒桿菌對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號(hào)通路激活并誘導(dǎo)miR-146a/b表達(dá)上調(diào).另外，聚肌苷酸胞苷酸誘導(dǎo)的大黃魚、柱狀黃桿菌侵染的鯉魚、嗜水氣單胞菌侵染的草魚和虹彩病毒屬腫大細(xì)胞病毒侵染的牙鲆中，也存在相似的miRNA差異性表達(dá)結(jié)果[11-13].因此，找到魚類參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵miRNA并鑒定其功能，將有助于深入理解魚類感染病菌的生理病理活動(dòng)以及深度開發(fā)和應(yīng)用mi RNA.本研究以牙鲆的頭腎組織為實(shí)驗(yàn)材料，用遲鈍愛德華氏菌侵染牙鲆，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌后miRNA的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步評(píng)估m(xù)i RNA在牙鲆免疫調(diào)控系統(tǒng)中的作用提供重要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及處理

實(shí)驗(yàn)用牙鲆購自天津市西青區(qū)某水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，從中選取9尾生長發(fā)育狀態(tài)良好的個(gè)體，體長約35 cm，大小均勻.將牙鲆分為感染組和對(duì)照組，每組3尾，設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照.選擇消毒滅菌后的可控溫、供氧和水過濾的水循環(huán)魚缸，溫度控制在20℃左右，鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%～1.8%，充氧處理7 d，使牙鲆充分適應(yīng)環(huán)境.牙鲆營底棲生活，不適合強(qiáng)光照射，因此需要對(duì)魚缸進(jìn)行遮光處理.實(shí)驗(yàn)開始前將牙鲆放在上述水環(huán)境中暫養(yǎng)1 d使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，每天喂養(yǎng)1次.

實(shí)驗(yàn)用遲鈍愛德華氏菌由天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中心提供，保存在本研究實(shí)驗(yàn)室.將其接種于pH值為7.2的LB液體培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（200 r/min）中培養(yǎng)24 h.當(dāng)菌液OD600等于1.0時(shí)，在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體.感染前用PBS離心洗滌菌體3次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).從6尾牙鲆中任意選取3尾作為感染組，用PBS將菌液稀釋到1×107CFU/mL，立即注射進(jìn)感染組牙鲆體內(nèi).分別在感染3 h和6 h時(shí)對(duì)牙鲆進(jìn)行解剖，取出頭腎組織，將其剪成小塊放入冷凍管中，立即放入液氮中冷凍，之后保存于-80℃冰箱中，用于RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析.委托上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

1.2 miRNA測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

通過高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina HiSeq）對(duì)牙鲆的miRNA進(jìn)行測(cè)序，得到原始的FASTQ數(shù)據(jù)，里面含有帶接頭、低質(zhì)量的序列（raw reads）.為了保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，運(yùn)用Fastx-Toolkit軟件對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)量控制，得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果（clean reads），基于clean reads進(jìn)行生物信息學(xué)分析.為了確定已知的miRNA，將得到的高質(zhì)量測(cè)序結(jié)果與miRBase數(shù)據(jù)庫中斑馬魚（Danio rerio）的miRNA前體及成熟體序列進(jìn)行比對(duì).

1.3 差異表達(dá)miRNA的篩選及其靶基因功能分析

對(duì)各樣本的已知miRNA進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析，利用TPM對(duì)表達(dá)量進(jìn)行均一化處理.應(yīng)用DEGseq2軟件對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選不同樣本間差異顯著的基因.應(yīng)用miRanda靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因.應(yīng)用Gene Ontology、KEGG pathway軟件對(duì)靶基因的代謝通路或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行富集分析.

1.4 差異表達(dá)miRNA的熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本次篩選差異表達(dá)miRNA的準(zhǔn)確性，選擇6個(gè)差異表達(dá)的miRNA（miR-730、miR-727-5p、miR-127-3p、miR-205、miR-34a-5p、miR-202-3P），采用熒光定量PCR方法，分析它們?cè)谘丽易⑸溥t鈍愛德華氏菌后的相對(duì)表達(dá)量變化.使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（cDNA一鏈合成試劑盒）對(duì)所提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理，使用Primer5設(shè)計(jì)差異表達(dá)miRNA的PCR引物，引物序列如表1所示.使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（without ROX）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，取擴(kuò)增后所得3個(gè)平行管Ct值（即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù)）的平均值.

表1 6個(gè)差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)定量表達(dá)引物序列Tab.1 Real time quantitative expression primer sequences of six differentially expressed miRNAs

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆對(duì)照組和感染組的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)

通過高通量測(cè)序平臺(tái)得到牙鲆感染組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù).原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：對(duì)照組有11 071 405條raw reads，感染組（3 h）有15 770 243條raw reads，感染組（6 h）有15 122 498條raw reads.對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)量控制，得到clean reads：對(duì)照組有9 571 465條clean reads，GC含量為68.59%；感染組（3 h）有13 277 647條clean reads，GC含量為68.08%；感染組（6 h）有12 868 934條clean reads，GC含量為70.44%.不同處理組中miRNA的長度分布如圖1所示.由圖1可以看出，本研究中clean reads的序列長度大部分在21～23 nt，其中22 nt的比例最大，這與miRNA的普遍分布長度一致.

圖1 不同處理組中miRNA長度分布Fig.1 Length distribution of miRNA in different treatment groups

2.2 牙鲆對(duì)照組和感染組的miRNA堿基分析

分析對(duì)照組和感染組中牙鲆miRNA的堿基組成：對(duì)照組中，腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）所占比例分別為25.81%、28.42%、19.38%、26.39%；感染組（3 h）中，4種堿基所占比例分別為26.15%、28.04%、19.51%、26.30%；感染組（6 h）中，4種堿基所占比例分別為26.17%、28.12%、19.26%、26.45%.胞嘧啶在3組轉(zhuǎn)錄組中的比例均最低，這與房路京等[14]對(duì)大黃魚的研究結(jié)果一致，說明不同物種之間的miRNA堿基種類所占比例存在著相似之處.

2.3 牙鲆差異表達(dá)miRNA分析

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)|log2（foldchange）|＞1和Q值＜0.01，對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行評(píng)估.從感染組（3 h）中篩選得到12個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中2個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)；從感染組（6 h）中篩選得到32個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中20個(gè)上調(diào)，12個(gè)下調(diào).感染組（3 h）與感染組（6 h）的差異表達(dá)miRNA對(duì)比交集如圖2所示.由圖2可以看出，相較于感染3h，感染6h有更多miRNAs的表達(dá)發(fā)生了變化，說明不同的miRNAs作用時(shí)間不同，隨著感染時(shí)間的延長，越來越多的miRNAs參與到免疫反應(yīng)中.

圖2 感染組（3 h）和感染組（6 h）的差異表達(dá)miRNA對(duì)比交集Fig.2 Comparison of miRNA between the infection group（3 h）and the infection group（6 h）

2.4 差異表達(dá)miRNA的靶基因GO富集分析

對(duì)靶基因進(jìn)行GO通路富集分析，結(jié)果顯示，感染組（3 h）中有2 793條差異顯著的富集通路（P＜0.05），其中包括2 021個(gè)生物過程（biological process，BP）、315個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）和457個(gè)分子功能（molecular function，MF）；感染組（6 h）有3 048條差異顯著的富集通路（P＜0.05），其中包括2 235個(gè)生物過程、342個(gè)細(xì)胞組分和471個(gè)分子功能.對(duì)比分析2個(gè)感染組，結(jié)果顯示，差異顯著的富集通路有2 803條（P＜0.05），其中包括1 984個(gè)生物過程、341個(gè)細(xì)胞組分和478個(gè)分子功能.這些差異顯著的富集通路大部分跟生物過程有關(guān)，如生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊等.每個(gè)部分選取20個(gè)最富集的通路，做GO富集柱狀圖，結(jié)果如圖3所示.由圖3（a）可以看出，感染組（3 h）生物過程中候選靶基因富集程度最高的GO條目是生物調(diào)節(jié)（biological regulation），其次是生物過程調(diào)節(jié)（regulation of biological process）；細(xì)胞組分中富集程度最高的GO條目是質(zhì)膜（plasma membrane），其次是細(xì)胞外圍（cell periphery）；分子功能中富集程度最高的GO條目是結(jié)合（binding），其次是細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合（cytoskeletal protein binding）.由圖3（b）可以看出，感染組（6 h）生物過程中候選靶基因富集程度最高的GO條目是生物調(diào)節(jié)，其次是多細(xì)胞生物過程（multicellular organismal process）；細(xì)胞組分中富集程度最高的GO條目是細(xì)胞外圍，其次是質(zhì)膜；分子功能中富集程度最高的GO條目是結(jié)合，其次是蛋白質(zhì)的結(jié)合（protein binding）.由圖3（c）可以看出，感染組（3 h vs 6 h）生物過程中候選靶基因富集程度最高的GO條目是發(fā)育過程（developmental process），其次是身體結(jié)構(gòu)發(fā)育（anatomical structure development）；細(xì)胞組分中富集程度最高的GO條目是細(xì)胞外圍，其次是質(zhì)膜；分子功能中富集程度最高的GO條目是結(jié)合，其次是蛋白質(zhì)的結(jié)合.

圖3 GO富集柱狀圖Fig.3 Histogram of GO enrichment

2.5 靶基因KEGG富集分析

對(duì)牙鲆感染組差異顯著表達(dá)的miRNAs進(jìn)行KEGG富集分析.感染組（3 h）差異顯著表達(dá)的miRNAs共獲得71個(gè)KEGG富集通路（P＜0.05），其中包括31個(gè)有機(jī)系統(tǒng)、17個(gè)環(huán)境信息處理、6個(gè)細(xì)胞過程、13個(gè)人類疾病和4個(gè)代謝通路.選取差異顯著的30條通路繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖4（a）所示，富集程度最大的KEGG通路是軸突導(dǎo)向（axon guidance），其次是谷氨酸突觸（glutamatergic synapse），富集靶基因數(shù)目最多的是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPKsignaling pathway）.感染組（6 h）差異顯著表達(dá)的miRNAs共獲得69個(gè)KEGG富集通路（P＜0.05），其中包括33個(gè)有機(jī)系統(tǒng)、18個(gè)環(huán)境信息處理、6個(gè)細(xì)胞過程、10個(gè)人類疾病和2個(gè)代謝通路.選取差異顯著的30條通路繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖4（b）所示，富集程度最大的KEGG通路是軸突導(dǎo)向，其次是Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway），富集靶基因數(shù)目最多的是癌癥通路（pathways in cancer）.將感染組（3 h）和感染組（6 h）兩組進(jìn)行對(duì)比分析，共得到79個(gè)KEGG富集通路（P＜0.05），其中包括33個(gè)有機(jī)系統(tǒng)、19個(gè)環(huán)境信息處理、6個(gè)細(xì)胞過程、20個(gè)人類疾病和1個(gè)代謝通路.選取差異顯著的30條繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖4（c）所示，富集程度最大的通路是軸突導(dǎo)向，其次是鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway），富集靶基因數(shù)目最多的是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路.這些信號(hào)通路共同參與牙鲆細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)以及分裂分化等生物學(xué)過程.

圖4 KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.4 Catter plot of KEGG enrichment

2.6 差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性，選取靶基因，對(duì)與免疫相關(guān)的6個(gè)差異表達(dá)miRNA（miR-730、miR-727-5p、miR-127-3p、miR-205、miR-34a-5p、miR-202-3p，其中3個(gè)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果如表2所示.miR-730預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)楦事短鞘荏w（mannose receptor，MR），包括牙鲆陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體樣、牙鲆巨噬細(xì)胞甘露糖受體1樣（X1、2、3）、牙鲆甘露糖受體C型1和牙鲆胰島素樣生長因子2受體；miR-727-5p預(yù)測(cè)到的靶基因是牙鲆C型甘露糖受體2樣；miR-127-3p預(yù)測(cè)到的靶基因是牙鲆C型甘露糖受體2樣；miR-205預(yù)測(cè)的靶基因之一是TIRAP，這是Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)通路中的接頭分子，上接TLR，下接MyD88；miR-34a-5p預(yù)測(cè)的靶基因是TLR13；miR-202-3p預(yù)測(cè)的靶基因之一是TLR7.

表2 實(shí)時(shí)定量PCR和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果Tab.2 Results of qPCR and RNA-seq

由表2可知，6個(gè)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果和高通量測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致，miR-730、miR-727-5p、miR-127-3p表達(dá)下調(diào)，miR-205、miR-34a-5p、miR-202-3p表達(dá)上調(diào)，由此表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可信.

3 討論與結(jié)論

本研究用遲鈍愛德華氏菌感染牙鲆，利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)牙鲆的頭腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，得到clean reads.對(duì)照組中得到9 571 465條clean reads，GC含量為68.59%；感染組（3 h）中得到13 277 647條clean reads，GC含量為68.08%；感染組（6 h）中得到12 868 934條clean reads，GC含量為70.44%.分析牙鲆對(duì)照組與感染組中miRNA的堿基組成發(fā)現(xiàn)，胞嘧啶所占比例均最低.利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析，得到牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌過程中頭腎組織的差異表達(dá)miRNA結(jié)果為：感染組（3 h）有12個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中2個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)；感染組（6 h）有32個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中20個(gè)上調(diào)，12個(gè)下調(diào).牙鲆被遲鈍愛德華氏菌感染的時(shí)間不同，miRNA的反應(yīng)程度也不同，感染6 h時(shí)應(yīng)激反應(yīng)處于高峰，預(yù)測(cè)miRNA可能參與了牙鲆的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié).選取與模式識(shí)別受體（TLR、MR）信號(hào)通路相關(guān)的6個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證，所得結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可信.感染組（6 h）的3個(gè)miRNA均發(fā)生上調(diào)，這3個(gè)miRNA的靶基因與TLR信號(hào)通路有關(guān)，可能與牙鲆的免疫負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)，miRNA的表達(dá)上調(diào)，它對(duì)應(yīng)的靶基因TLR的表達(dá)應(yīng)下調(diào).本課題組前期研究結(jié)果顯示，牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌過程中，感染6 h時(shí)多數(shù)TLR基因處于表達(dá)峰值.

miRNA在抗細(xì)菌的先天免疫反應(yīng)中起著非常重要的負(fù)反饋調(diào)控作用，這種調(diào)控可以確保免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)不會(huì)出現(xiàn)過激反應(yīng).TLR信號(hào)必須受到嚴(yán)格控制以避免產(chǎn)生過度炎癥，并且在組織感染或損傷后允許組織修復(fù)恢復(fù)穩(wěn)態(tài).miRNA是TLR信號(hào)的重要控制因子，部分miRNA由固有免疫細(xì)胞中的TLR激活誘導(dǎo)，同其他miRNA一起通過靶向TLR通路中的信號(hào)分子miRNA起作用[15].TLR信號(hào)通路中存在著一些具有重要調(diào)控作用的調(diào)節(jié)因子，其調(diào)控可以是正向也可以是負(fù)向的，miRNA還可以通過作用于這些調(diào)節(jié)因子間接發(fā)揮對(duì)TLR信號(hào)通路的調(diào)控作用.miRNA被證明是固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的重要連接，它們的失調(diào)可能在炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[16-22].本研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因所參與的信號(hào)通路大部分跟生物過程以及細(xì)胞組分中的膜成分有關(guān)，如生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊、質(zhì)膜等.生物過程中候選靶基因富集程度最高的GO條目是生物調(diào)節(jié)，富集程度高的通路大多跟免疫調(diào)節(jié)以及分裂分化等生物學(xué)過程相關(guān)聯(lián)，質(zhì)膜具有識(shí)別和傳遞信息的功能，以上結(jié)果可以為牙鲆免疫基因的篩選和免疫系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù).這些差異表達(dá)miRNA及其靶基因可能與牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染過程密切相關(guān)，對(duì)研究牙鲆的免疫調(diào)控機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義，其所提供的差異表達(dá)量變化的信息可以為后續(xù)研究牙鲆應(yīng)對(duì)遲鈍愛德華氏菌刺激時(shí)靶基因的篩選以及靶基因所起作用提供理論依據(jù).