錯配修復(fù)蛋白聯(lián)合血清腫瘤標(biāo)志物與Ki-67增殖指數(shù)對結(jié)直腸癌預(yù)后的臨床價(jià)值

陳 璽，曾曉穎，陳佳艷，劉 菲，唐 曦

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院腫瘤科，上海 200040；2.上海市靜安區(qū)統(tǒng)戰(zhàn)部，上海 200041

最新數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率居全球常見惡性腫瘤第3位［1］。在中國結(jié)直腸癌發(fā)病率也居惡性腫瘤第3位，死亡率居第5位［2］。由于結(jié)直腸癌早期無明顯癥狀，發(fā)展相對緩慢，臨床表現(xiàn)不典型，故在早期容易被忽視。目前臨床上應(yīng)用較多的預(yù)后評估方式有血清腫瘤標(biāo)志物、術(shù)后病理學(xué)、影像學(xué)等檢查方式。

糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA72-4、CA12-5、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是目前在臨床上比較常用的腫瘤標(biāo)志物，在結(jié)直腸癌的預(yù)后評估中也具有重要的作用。因各個標(biāo)志物的特異度和靈敏度均存在較大差異，雖然CEA已經(jīng)被美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版分期標(biāo)準(zhǔn)作為單獨(dú)的預(yù)后因素，且證據(jù)等級為Ⅰ級［3］，但腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的存在較為普遍，因此選用單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測的方式對于結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷往往無法取得理想的效果。研究［4］結(jié)果證實(shí)，聯(lián)合多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測的特異度和靈敏度均顯著高于單項(xiàng)檢測，故聯(lián)合檢測對于結(jié)直腸癌患者治療方案的選擇、預(yù)后的評估均具有重要參考價(jià)值。

Ki-67增殖指數(shù)是反映細(xì)胞增殖的特異性指標(biāo)，能比較有效地反映細(xì)胞的過度增殖情況，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）系統(tǒng)中的基因突變或甲基化，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一［6］。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)MSI與10%～15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌（sporadic colorectal carcinoma，SCC）和90%的Lynch綜合征的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。所以MMR與SCC患者臨床表型及預(yù)后的關(guān)系受到越來越多臨床研究人員的關(guān)注。根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2021年的相關(guān)指南，建議對所有結(jié)直腸癌患者均進(jìn)行MSI/MMR檢測［7］?！吨袊Y(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》推薦對所有結(jié)直腸癌患者進(jìn)行錯配修復(fù)蛋白表達(dá)或微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測，用于遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌篩查、預(yù)后分層及指導(dǎo)免疫治療等［8］。2016年《腫瘤病理診斷規(guī)范（結(jié)直腸癌）》中也指出，有條件的單位建議對結(jié)直腸癌組織進(jìn)行錯配修復(fù)蛋白檢測，報(bào)告錯配修復(fù)蛋白表達(dá)情況（MLH1、MSH2、MSH6及PMS2），以指導(dǎo)臨床治療和評價(jià)預(yù)后［9］。

本研究旨在探討免疫組織化學(xué)法檢測錯配修復(fù)蛋白表達(dá)聯(lián)合血清檢測腫瘤標(biāo)志物與免疫組織化學(xué)法檢測Ki-67增殖指數(shù)在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性以及預(yù)后判斷的臨床價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院2014年7月—2018年6月收治的234例經(jīng)手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的臨床資料，分析其術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物及石蠟包埋組織標(biāo)本病理學(xué)檢查結(jié)果。其中男性128例，女性106例，年齡平均68.66歲（39～94歲）。通過電話訪問患者或家屬方式進(jìn)行隨訪，隨訪起點(diǎn)為手術(shù)日期，隨訪截止日期為2020年12月31日，隨訪229例，失訪5例，隨訪率為97.9%，隨訪時間為19～70個月，平均隨訪時間為40.91個月。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受過放化療；② 均經(jīng)術(shù)前活檢及術(shù)后病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①缺乏完整的臨床資料；② 其他部位惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤標(biāo)志物檢測

所有患者均通過瑞士羅氏診斷公司生產(chǎn)的電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（Cobas e602）檢測CA19-9、CA72-4、CA12-5和CEA水平，試劑均從羅氏公司購買。檢測方法：患者晨起空腹采肘靜脈血2 mL，分離血清，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測CA19-9、CA72-4、CA12-5和CEA水平。各項(xiàng)指標(biāo)的正常值參考范圍：CA19-9為0.0～34.0 U/mL，CA72-4為0.0～8.2 U/mL，CA12-5為0.0～35.0 U/mL，CEA為0.0～5.0 ng/mL。

1.2.2 Ki-67增殖指數(shù)與錯配修復(fù)蛋白檢測

所有患者結(jié)直腸癌術(shù)后組織標(biāo)本采用二步法Envision System法檢測Ki-67增殖指數(shù)、4種錯配修復(fù)蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）的表達(dá)情況。Ki-67增殖指數(shù)判斷：Ki-67免疫涂色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒視為陽性，Ki-67增殖指數(shù)按陽性細(xì)胞所占百分比表示。錯配修復(fù)蛋白結(jié)果判斷：定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核著色視為陽性表達(dá)，未著色為缺失，其中MLH1、MSH2、MSH6、PSM2均陽性表達(dá)判定為表達(dá)正常（proficient mismatch repair，pMMR），任意一項(xiàng)染色缺失判定為表達(dá)缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)患者術(shù)前血清CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5水平及手術(shù)標(biāo)本組織中的Ki-67增殖指數(shù)與錯配修復(fù)蛋白的表達(dá)，分析上述指標(biāo)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征［性別、年齡、腫瘤原發(fā)病灶部位、腫瘤分化程度、TNM分期（按AJCC第8版分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管血管侵犯、神經(jīng)侵犯等］及患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對資料進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。采用Kaplan-Meier法對各個因素的生存預(yù)后進(jìn)行單因素分析，并繪制生存時間曲線。組間的差異性檢驗(yàn)采用log-rank檢驗(yàn)。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錯配修復(fù)蛋白表達(dá)與患者各項(xiàng)基本病理學(xué)參數(shù)及觀察指標(biāo)的關(guān)系

在234例結(jié)直腸癌患者術(shù)后標(biāo)本中發(fā)生dMMR的共29例（12.4%），pMMR的有205例（87.6%），按此分為2組，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

pMMR組與dMMR組在腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），主要表現(xiàn)為dMMR組較pMMR組更多見于右半結(jié)腸癌，在低分化腺癌及黏液腺癌中多見，T分期較晚（T3、T4比例高），但總體分期較早（以Ⅱ期為多），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少見。而兩組患者的性別、年齡和有無神經(jīng)、淋巴管血管侵犯差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

而在觀察指標(biāo)方面，234例患者中Ki-67增殖指數(shù)采用50%為分界點(diǎn)，＞50%分為Ki-67高陽性率組，而≤50%為Ki-67低陽性率組。術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物水平按正常參考值分為術(shù)前正常組與術(shù)前升高組。

采用χ2檢驗(yàn)分析后，pMMR組與dMMR組在Ki-67增殖指數(shù)、術(shù)前CEA、CA72-4的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與術(shù)前CA19-9、CA12-5的水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 錯配修復(fù)蛋白表達(dá)與患者各項(xiàng)基本病理學(xué)參數(shù)及觀察指標(biāo)的關(guān)系Tab.1 Relationship between mismatched repair protein expression and basic pathological parameters and observed indicators of patients

2.2 單因素預(yù)后分析

預(yù)后隨訪中，234例中5例失訪，共229例患者隨訪成功?；颊呋九R床病理學(xué)因素與預(yù)后分析中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分期較晚組生存率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。而在性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、分化類型、T分期各組別中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。錯配修復(fù)蛋白dMMR組患者的生存率為100%（29/29），pMMR組的生存率為83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ki-67增殖指數(shù)低陽性率組患者的生存率為91.5%，高陽性率組的生存率為82.9%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)前CEA、CA72-4正常與升高組的患者生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2、圖1）。

圖1 不同情況下生存分析Fig.1 Survival analysis of different items

表2 單因素預(yù)后分析Tab.2 Univariate prognostic analysis

2.3 多因素預(yù)后分析

單因素分析顯示，錯配修復(fù)蛋白表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、術(shù)前CEA、術(shù)前CA72-4水平均為影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，錯配修復(fù)蛋白表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA與患者預(yù)后無顯著相關(guān)，分期與術(shù)前CA72-4水平與預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05，表3），提示較晚的分期和術(shù)前CA72-4水平升高是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 預(yù)后影響因素的多因素COX回歸分析Tab.3 Multivariate COX regression analysis of prognostic factors

3 討 論

結(jié)直腸癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，一般認(rèn)為是由飲食習(xí)慣、生活方式、生活環(huán)境以及遺傳因素等多因素共同作用下導(dǎo)致的結(jié)果，但是具體的發(fā)病機(jī)制仍未明確。

由于在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率依舊處于逐漸上升的趨勢，作為結(jié)直腸癌重要發(fā)生機(jī)制之一的MMR系統(tǒng)的基因突變或甲基化，越來越受到臨床醫(yī)生及研究者的重視。

MMR系統(tǒng)的主要作用是在正常細(xì)胞增殖過程中，當(dāng)細(xì)胞DNA在復(fù)制中出現(xiàn)堿基配對錯誤（正常細(xì)胞復(fù)制中最容易出現(xiàn)錯配的是微衛(wèi)星序列）時，MMR系統(tǒng)可以識別并糾正錯配的堿基，保持基因轉(zhuǎn)錄翻譯的穩(wěn)定性，避免腫瘤的發(fā)生。而一旦MMR系統(tǒng)中的基因發(fā)生了突變或甲基化，就會導(dǎo)致細(xì)胞基因組穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生MSI，MSI使得正常的基因發(fā)生突變并使某些癌基因或突變的抑癌基因不斷累積，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生腫瘤。

目前發(fā)現(xiàn)的MMR蛋白共有9種，正常時MMR蛋白無缺失稱為pMMR，而當(dāng)MMR系統(tǒng)中的基因發(fā)生突變或甲基化后，會導(dǎo)致相對應(yīng)的MMR蛋白出現(xiàn)表達(dá)缺失，即為dMMR。其中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白表達(dá)缺失是臨床最為常見的dMMR類型，而MMR系統(tǒng)中的基因突變導(dǎo)致任意一種dMMR均會引發(fā)MMR系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致MSI發(fā)生［10］。

國內(nèi)外指南均推薦檢測組織MMR和MSI狀態(tài)［7-9］。不過由于MSI基因突變檢測費(fèi)用比較昂貴限制了其臨床應(yīng)用，而免疫組織化學(xué)檢測法檢測MMR蛋白表達(dá)因其費(fèi)用較低，且具有高度敏感性和特異性，與MSI基因突變檢測的一致性較高，所以近年來大多采用免疫組織化學(xué)法作為首選的方案對患者的手術(shù)標(biāo)本MMR蛋白進(jìn)行檢測來預(yù)測MSI狀態(tài)。最常見的免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果是MSH2和MSH6染色正常，而MLH1和PMS2同時缺失，表明患者可能是Lynch綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌或錯配修復(fù)基因蛋白缺失的散發(fā)性結(jié)直腸癌。

本研究結(jié)果顯示，在234例結(jié)直腸癌患者術(shù)后標(biāo)本中發(fā)生dMMR的共有29例（12.4%），pMMR的有205例（87.6%），dMMR發(fā)生率與之前的研究結(jié)果相近［11］。在本研究臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析中dMMR組與pMMR組在腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示dMMR更多見于右半結(jié)腸癌患者，低分化及黏液腺癌為多，分期相對較早（Ⅱ期偏多），腫瘤浸潤深度較深（T3、T4），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生較少，提示MMR檢測對于結(jié)直腸癌患者的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后評估有一定的意義。在單因素預(yù)后分析中dMMR組與pMMR組的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示dMMR組患者較pMMR組患者預(yù)后更好，這與另一項(xiàng)納入了2 940例根治性切除術(shù)后結(jié)直腸癌患者的臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致，dMMR導(dǎo)致MSI高的患者預(yù)后較好［12］。

血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5是目前臨床診療中常用的腫瘤標(biāo)志物，廣泛地應(yīng)用于肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤的診斷與預(yù)后判斷中。雖然國內(nèi)外的一些研究［13-15］都分別提示CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5有助于結(jié)直腸癌術(shù)前診斷、療效評價(jià)及預(yù)后判斷，但單一標(biāo)志物的特異性都不高，需要通過聯(lián)合檢測來提高預(yù)測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性［16-18］。

Ki-67增殖指數(shù)與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)［19-20］。本研究顯示，pMMR組與dMMR組在Ki-67免疫染色陽性率、術(shù)前CEA、CA72-4的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與術(shù)前CA19-9、CA12-5的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體表現(xiàn)為dMMR組患者的Ki-67增殖指數(shù)大多≤50%，術(shù)前CEA正常水平者較多，術(shù)前CA72-4水平升高者較多。而在單因素預(yù)后分析中術(shù)前Ki-67增殖指數(shù)及CEA、CA72-4表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示術(shù)前CEA、CA72-4水平升高是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

本研究通過單因素分析得到影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的5項(xiàng)變量，然后進(jìn)行多因素預(yù)后分析，其中錯配修復(fù)蛋白表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后無顯著相關(guān)，而分期及術(shù)前CA72-4水平與預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05），提示較晚的分期和術(shù)前CA72-4水平升高是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失與臨床病理學(xué)參數(shù)（腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）具有明顯相關(guān)性。錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失在Ki-67增殖指數(shù)、術(shù)前血清CEA與CA72-4的水平上與錯配修復(fù)蛋白正常表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估具有一定的意義。

但由于本研究的病例數(shù)仍偏少，且錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失率本就不高，這可能造成偏倚，影響了統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果的可信度。在今后的研究中，可調(diào)整研究方案設(shè)計(jì)，嘗試前瞻性研究，并擴(kuò)充樣本量，納入術(shù)后治療方案作為評價(jià)預(yù)后的參考指標(biāo)之一，減少系統(tǒng)性偏差。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。