黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)、危害特征及殺蟲菌種的篩選

吳煜，鄧嬌，張曉娜，黃凱豐，陳慶富

貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心/蕎麥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550001

蕎麥(Buckwheat)屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，是一種糧藥兼用的雜糧作物[1]．近年來，隨著對蕎麥關(guān)注度的升高、國家扶持力度的增大，蕎麥的種植面積逐年擴(kuò)大，病蟲害的問題也逐漸增加．2016年首次在貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鎮(zhèn)蕎麥上發(fā)現(xiàn)黑唇平背葉蜂，而后隨著種植面積擴(kuò)大，發(fā)現(xiàn)其在貴州省蕎麥主產(chǎn)區(qū)上均有分布[2]．

黑唇平背葉蜂Allantusluctifer(F.Smith)，又稱黑翅葉蜂或黑唇十脈葉蜂，屬于膜翅目(Hymenoptera)葉蜂科(Tenthredinidae)葉蜂屬(Tenthredo)，主要危害蓼科蓼屬植物[3]，幼蟲最喜食蕎麥和棉毛葉蓼[4]．其幼蟲以咀嚼式口器取食植物葉片，造成植物缺刻，嚴(yán)重時取食整個植物的莖和花，造成光合速率降低，植物減產(chǎn)．目前關(guān)于黑唇平背葉蜂的生物學(xué)研究較少，且貴州省作為蕎麥的主要生產(chǎn)大省，對其研究也基本為零．

為了保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)，生物防治已經(jīng)成為一種有效的替代化學(xué)防治的新農(nóng)業(yè)害蟲防治措施，生物防治主要分為天敵防治[5-6]和微生物制劑防治[7]．利用昆蟲病原真菌(Entomopathogenic fungi，EPF)調(diào)節(jié)自然害蟲種群，已成為以生物防治為主導(dǎo)的綜合治理重要途徑之一[8]．蟲草屬(Cordyceps)屬于子囊菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)蟲草科(Cordycipitaceae)[9]，是重要的昆蟲病原真菌屬之一，該屬在我國目前共報道約120種，在自然界中可以持續(xù)存在控制靶標(biāo)害蟲[10]，在生物防治中發(fā)揮著重要的作用[11-12]．其中，環(huán)鏈蟲草(Cordycepscateniannulata)，又稱環(huán)鏈擬青霉(Paecilomycescateniannulatu)或環(huán)鏈棒束孢(Isariacateniannulata)； 玫煙色蟲草(Cordycepsfumosorosea)，又稱為玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)； 粉棒束孢(Isariafarinosa)，又稱為粉擬青霉(Paecilomycesfarinosus)，是重要的昆蟲病原真菌，在自然界中廣泛分布，可以寄生感染多種害蟲．目前研究發(fā)現(xiàn)環(huán)鏈蟲草對鱗翅目[13-14]、蜱螨目[15-16]、半翅目[17]等，玫煙色蟲草對鞘翅目[18]、鱗翅目[19]、半翅目[20-22]、雙翅目[23]等，粉棒束孢對害蟲、線蟲和蜱螨類[24]等都有一定的防治效果，但對于蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)，目前對其防治農(nóng)業(yè)害蟲的研究報道較少．因此，測定蟲生真菌對黑唇平背葉蜂幼蟲的致病力，可為減少對環(huán)境有害的化學(xué)農(nóng)藥的使用、探究蟲生真菌作為黑唇平背葉蜂生物防治劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)．

因此，本文擬對黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征、發(fā)育歷期、生長規(guī)律、取食危害情況及蟲生真菌致病力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期為該害蟲的預(yù)防、預(yù)測、預(yù)報及生物防治制劑研發(fā)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：黑唇平背葉蜂采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鎮(zhèn)田間(海拔1 345 m，106°53′E，26°52′N)，帶回實(shí)驗(yàn)室，用小毫筆挑置培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每皿中鋪兩層圓形濾紙(直徑9 cm)并用無菌水完全濕潤，每天放入大小約為5 cm×6 cm的新鮮多年生苦蕎葉片，用保鮮膜封好并戳孔10個，放置于人工氣候箱(溫度25±1 ℃，相對濕度80%±5%，光照周期L∶D=16∶8)中培養(yǎng)．

供試菌株：如表1，其中4號菌株由貴州大學(xué)真菌資源研究所惠贈．

表1 供試蟲生真菌菌株

1.2 方法

1.2.1 黑唇平背葉蜂幼蟲形態(tài)特征、發(fā)育歷期及生長情況的觀察

將黑唇平背葉蜂卵置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每組30個，設(shè)置3個重復(fù)．將培養(yǎng)皿放置于1.1條件下連續(xù)培養(yǎng)25 d，每天觀察其幼蟲形態(tài)顏色變化、記錄其蛻皮的時間，在體視顯微鏡下，每日下午2點(diǎn)觀察測定幼蟲體長、體寬(胸部第一節(jié)處)等．

1.2.2 黑唇平背葉蜂幼蟲危害特征觀察

選取1.2.1中相同齡期的幼蟲置于塑料養(yǎng)蟲盒(長、寬、高為19 cm×14 cm×11.5 cm)中，每個蟲齡選10頭，3個重復(fù)，每盒中鋪兩層濾紙并用無菌水完全濕潤，放入兩片大小約為6 cm×7 cm的新鮮多年生苦蕎葉片．將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天觀察不同齡期幼蟲危害葉片的特征并記錄．

1.2.3 黑唇平背葉蜂幼蟲人工飼養(yǎng)取食情況觀察

將1.2.1中不同齡期的黑唇平背葉蜂幼蟲置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每皿中鋪兩層圓形濾紙并用無菌水完全濕潤，每天放入大小約為5 cm×6 cm的新鮮多年生苦蕎葉片，每組30頭，設(shè)置3個重復(fù)．將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)25 d．記錄每次新加入新鮮葉片和取食過葉片的質(zhì)量．

1.2.4 黑唇平背葉蜂幼蟲室外取食情況觀察

貴州師范大學(xué)蕎麥研究中心植物生長室(海拔1 090 m，106°43′10″E，26°35′31″N)飼養(yǎng)觀察其危害蕎麥的特征．

1.2.5 孢子懸液的制備

將供試菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在150 r/min，25 ℃ 的條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d，利用雙層擦鏡紙過濾菌絲，得到孢子懸液．用血球計數(shù)板測定孢子濃度，將孢子懸液用無菌水稀釋成濃度為1×108個/mL．

1.2.6 蟲生真菌致病力測定

采用浸漬法，將3齡的黑唇平背葉蜂幼蟲浸入菌株的孢子懸液5 s，后取出置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，用保鮮膜封好并戳孔10個．20頭為1組，3個重復(fù)，對照組采用無菌水浸漬，其他條件與實(shí)驗(yàn)組一致．每隔24 h觀察并記錄幼蟲死亡情況，連續(xù)觀察10 d，計算死亡率(M)和校正死亡率(CM)．

M=D/T×100%

CM=(M-C)/(1-C)×100%

式中，D為處理死亡幼蟲數(shù)，T為處理總蟲數(shù)，C為對照死亡率．

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007，SPSS 19對黑唇平背葉蜂幼蟲齡期、體長、體寬、取食情況、致病力進(jìn)行分析，采用Tukey法在0.05水平對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征

1齡幼蟲，頭部呈黑色且有光澤； 體表呈淡黃色，進(jìn)食后呈淡綠色； 頭部較胸部大，胸足3對，胸足較發(fā)達(dá)，無色透明呈圓錐狀； 腹足不明顯，體側(cè)無氣門出現(xiàn)(圖1a)．

2齡幼蟲，頭部呈褐色且有光澤； 體表呈黃綠色，胸足3對，位于第1至第3腹節(jié)； 腹足7對，位于第4至第10腹節(jié)； 臀足1對，位于第11腹節(jié)； 體側(cè)無氣門出現(xiàn)(圖1b)．

3齡幼蟲，頭部呈褐色且有光澤； 胸足3對，腹足7對，臀足1對，共11對； 體側(cè)出現(xiàn)呈黑色的氣門．體表呈黃綠色，臀板呈嫩黃色(圖1c)．

4齡幼蟲，頭部呈黃褐色且有光澤； 胸足3對，腹足7對，臀足1對； 體表呈黃綠或淺綠色，臀板呈淡黃褐色，分節(jié)明顯，各節(jié)粗細(xì)基本一致(圖1d)．

5齡幼蟲，體表呈深綠色，腹部各節(jié)明顯突起，背側(cè)中部出現(xiàn)較暗線狀斑點(diǎn)； 胸足3對，腹足7對，臀足1對(圖1e)．

6齡幼蟲，此時蟲體長、寬均達(dá)到最大值，體表呈深綠色(圖1f)．隨時間增長，蟲體顏色逐漸加深變?yōu)楹诤稚硞?cè)中部線狀斑點(diǎn)呈淺褐色，幼蟲開始縮?。?dāng)蟲體縮小至10 mm左右時，蛻皮進(jìn)入蛹期(圖1g)．期間取食逐漸減少直至無進(jìn)食，排便也隨之減少．在培養(yǎng)皿內(nèi)不斷爬動尋找遮蔽物，鉆入濾紙下方后靜止不動．

所有蟲齡的幼蟲受驚擾后，尾部左右擺動并翹起，但胸足牢牢抓住葉片不放，并口吐黃綠色汁液．

圖1 黑唇平背葉蜂幼蟲各蟲齡形態(tài)特征

2.2 黑唇平背葉蜂幼蟲的發(fā)育歷期測定

在25 ℃下，幼蟲的發(fā)育歷期為15.33±2.12 d．其中，1～3齡的幼蟲蛻皮時間較為接近，發(fā)育時間較短，分別為1.83±0.75 d，2.10±0.84 d，2.03±0.89 d； 4齡開始蛻皮時間逐漸延長，發(fā)育時間逐漸增加； 6齡時達(dá)到最大值，分別為2.17±0.95 d，2.57±0.97 d和4.63±1.50 d (圖2)．

圖2 黑唇平背葉蜂各蟲齡幼蟲的發(fā)育歷期

2.3 黑唇平背葉蜂的生長情況觀察

黑唇平背葉蜂幼蟲在1～3齡時，體長、體寬勻速增長，體長分別為3.05±0.97 mm，4.24±0.45 mm，5.51±1.10 mm，體寬分別為0.46±0.04 mm，0.65±0.09 mm，0.84±0.16 mm．4齡后，幼蟲體長、體寬均較快增長．4齡幼蟲的體長、體寬分別為7.37±1.50 mm，0.98±0.25 mm； 5齡幼蟲體長、體寬顯著增長，此時分別為10.31±1.60 mm，1.49±0.26 mm； 6齡時達(dá)到最大，分別為14.21±1.5 mm，2.25±0.26 mm．6齡后期幼蟲蟲體開始縮小并蜷縮至10 mm左右，此時蛻皮進(jìn)入蛹期(圖3)．

圖3 不同齡期黑唇平背葉蜂幼蟲的體長和體寬變化情況

2.4 黑唇平背葉蜂的危害特征

黑唇平背葉蜂對蕎麥各個品種均有危害，其中多年生苦蕎麥和金蕎麥?zhǔn)侵饕芎ο螅疚闹兄饕枋龊诖狡奖橙~蜂幼蟲以咀嚼式口器對多年生苦蕎的危害，喜食植株嫩葉，一般在開花期及開花前期進(jìn)行危害，不進(jìn)食時，幼蟲卷曲在葉片背面休息．危害特征如圖4．黑唇平背葉蜂幼蟲孵出后，1～2齡幼蟲，常群集在葉背取食，形成不規(guī)則的孔洞，但不穿透葉片，留下白色薄膜(圖4a和圖4b)．3齡幼蟲開始主動遷移分散取食但遷移距離不遠(yuǎn)，多在附近的3～4葉片間活動取食，穿透葉片形成孔洞(圖4c和圖4d)．4～6齡幼蟲爬行能力顯著增強(qiáng)，開始對整株進(jìn)行危害(圖4e)； 葉片孔洞逐漸增加，出現(xiàn)失水變干的現(xiàn)象(圖4f)； 嚴(yán)重影響光合作用，直至整個植株枯死(圖4g)，繼而轉(zhuǎn)株危害．6齡后期幼蟲不再進(jìn)食，鉆入土壤蛻皮后進(jìn)入蛹期(圖4h)．

2.5 黑唇平背葉蜂的取食情況

黑唇平背葉蜂幼蟲取食率隨著齡期的增加而增加．1齡平均日取食量為0.000 24±0.000 05 g； 2齡平均日取食量為0.006 40±0.002 30 g； 3齡幼蟲取食量明顯增大，平均日取食量為0.017 10±0.003 70 g； 4齡幼蟲平均日取食量為0.026 90±0.004 10 g； 5齡幼蟲平均日取食量為0.036 10±0.004 70 g； 幼蟲日取食量在6齡前期時達(dá)到最大，平均為0.063 50±0.005 80 g，6齡后期幼蟲取食量迅速降低直至不進(jìn)食進(jìn)入蛹期(圖5)．

2.6 4種蟲生真菌菌種對黑唇平背葉蜂幼蟲致病力測定

5株蟲生真菌對黑唇平背葉蜂3齡幼蟲均有一定的致死效果，但不同菌株致死率不同(圖6)．不同蟲生真菌侵染幼蟲10 d后，4號環(huán)鏈蟲草、5號蝙蝠蛾擬青霉致死率較高，分別為58.33%±2.89%，71.67%±2.89%； 2號玫煙色蟲草、3號粉棒束孢致死率較低，分別為51.67%±2.89%，48.33%±5.77%； 1號玫煙色蟲草致死率最低，為45.00%．

圖4 幼蟲危害蕎麥情況

圖5 不同齡期幼蟲對蕎麥葉片的日取食量

小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．圖6 5株蟲生真菌對黑唇平背葉蜂3齡幼蟲侵染10 d的累計校正致死率

3 結(jié)論

黑唇平背葉蜂幼蟲共6齡，溫度是影響昆蟲發(fā)育歷期的關(guān)鍵因素[25-26]．周傳金等[27]研究發(fā)現(xiàn)在平均溫度為27.4 ℃時發(fā)育時間最短，為8.9 d．本研究中各世代幼蟲的飼養(yǎng)溫度為25 ℃，幼蟲發(fā)育歷期為15.33±2.12 d，原因可能是本實(shí)驗(yàn)在恒定的環(huán)境條件下測定，而周傳金等人所做的實(shí)驗(yàn)為田間環(huán)境，溫度受晝夜影響較大．

黑唇平背葉蜂幼蟲體長、體寬與齡期成正相關(guān)．研究發(fā)現(xiàn)黑翅葉蜂[27]各齡期幼蟲的生長規(guī)律為1～3齡勻速增加，4齡后增長緩慢．本研究中幼蟲的生長在1～3齡較為勻速，4齡后增長更快，可能是由于前者與本研究幼蟲取食的蕎麥品種、溫濕度不同有關(guān)．前者未對幼蟲的體寬進(jìn)行研究，且所取食的蕎麥品種未公布，因此相關(guān)研究還需進(jìn)一步驗(yàn)證．

黑唇平背葉蜂幼蟲的取食危害情況、取食量與齡期成正相關(guān)．Formosempriatakeuchi[28]，Orientabiasinica[29]，Waldheimiasaurauia[30]等葉蜂幼蟲1齡時群居危害葉脈間的相對幼嫩葉片，后期幼蟲危害漸增，啃食整片葉子，形成缺刻．杏絲角葉蜂[31]，Hoplocampatestudinea[32]，西北槌緣葉蜂[33]，杜鵑三節(jié)葉蜂[34]等葉蜂幼蟲3齡前群集危害，3齡后幼蟲分散危害．黑翅葉蜂[27]1～2齡幼蟲平均食葉量較少，3齡后幼蟲食葉量明顯增加，6齡食葉量劇增．本研究中黑唇平背葉蜂幼蟲取食危害情況與黑翅葉蜂較為相似．

蟲生真菌對害蟲有一定的生物防治效果，并且不同的蟲生真菌對同一寄主的致病力存在差異．Ramirez J L等[35]發(fā)現(xiàn)蟲草屬中不同菌種對Aedesaegypti埃及伊蚊致病力不同，當(dāng)孢子濃度為5.1×105個/mL時C.cateniannulata半致死時間(LT50)為5.14，遠(yuǎn)高于C.amoenerosea(LT50=10.28)，與本研究中當(dāng)孢子濃度為1×108個/mL時，環(huán)鏈蟲草、蝙蝠蛾擬青霉致病力較玫煙色蟲草、粉棒束孢強(qiáng)的結(jié)果相似，導(dǎo)致不同菌種致病力出現(xiàn)差異的原因可能是不同蟲生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同[24，36-38]．

本實(shí)驗(yàn)首次對黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征、發(fā)育歷期、生長規(guī)律、取食危害、蟲生真菌致病力方面進(jìn)行了研究，這將為黑唇平背葉蜂幼蟲的深入了解、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的補(bǔ)充、預(yù)測預(yù)報及綜合治理提供科學(xué)依據(jù)，為蟲生真菌作為黑唇平背葉蜂生物防治劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)．

致謝：感謝集美大學(xué)魏美才教授對黑唇平背葉蜂的鑒定．