趙烜影,楊 揚(yáng),王國(guó)驕,雍靖怡,李 楠
(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)
在過(guò)去的幾十年里,益生菌的概念一直在發(fā)展,目前公認(rèn)的定義將益生菌描述為“當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí),對(duì)宿主產(chǎn)生健康益處的活性微生物”[1]。有大量證據(jù)支持益生菌對(duì)健康的益處,大量研究成果表明,這些微生物在治療腹瀉、乳糖不耐癥、結(jié)腸炎、腸易激綜合征、某些類型的癌癥、胰島素抵抗、肥胖癥和降低膽固醇、降低血壓等方面能夠發(fā)揮作用[2-8]。雖然益生菌的定義表明微生物應(yīng)該是具有活力的才能提供有益作用,但最近的研究表明,微生物的活力并不是產(chǎn)生益處所必需的[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的提取物具有體外腫瘤抑制活性[11-12]。目前已有研究提出滅活或無(wú)活力的益生菌,以及它們的代謝副產(chǎn)物均能夠?yàn)樗拗鞯慕】堤峁┮嫣幍挠^點(diǎn)[13]。目前可以通過(guò)益生菌、益生元、后生元3 種方式調(diào)節(jié)微生物群,這為功能性食品領(lǐng)域發(fā)展提供了潛在的機(jī)會(huì)[14]。
后生元又稱代謝物、生物源或無(wú)細(xì)胞上清液(cellfree supernatant,CFS),是指“活細(xì)菌分泌的或細(xì)菌裂解后釋放的可溶性因子”[12]。這些可溶性因子可以是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)、微生物組分、功能性蛋白質(zhì)/酶、胞外多糖、細(xì)胞裂解物、胞壁肽(磷壁酸、脂磷壁酸、肽聚糖等)[15-17]。后生元發(fā)揮特定功效的確切作用機(jī)制尚未完全闡明[18]。但已有科學(xué)數(shù)據(jù)表明,后生元具有不同的功能特性,包括但不限于抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)[19-22]。這些特性可以對(duì)菌群穩(wěn)態(tài)、宿主代謝和信號(hào)通路產(chǎn)生積極影響,從而影響特定的生理、免疫、神經(jīng)激素生物學(xué)調(diào)節(jié)和代謝反應(yīng)[23]。最近的研究表明,后生元的功能特性可能與增強(qiáng)腸道屏障功能和黏膜免疫有關(guān),進(jìn)而能夠預(yù)防免疫疾病,調(diào)節(jié)腸道菌群組成及活性[24-28]。還有研究認(rèn)為,后生元具有抑制病原體、控制肥胖、維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)等功能特性[29]。盡管后生元的重要性還未得到普遍重視,研究?jī)?nèi)容主要來(lái)源于常見(jiàn)的乳桿菌,但有關(guān)其功能特性的研究正在逐步增加[19,21-22,30]。
后生元主要來(lái)源于腸道菌群,少部分由可發(fā)酵的膳食纖維受刺激而代謝產(chǎn)生,主要存在于結(jié)腸和盲腸中,包括蛋白質(zhì)、肽、有機(jī)酸和其他小分子[31]。它們具有不同的功能特性,如用作抗菌劑、抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑[12,32]。此外,它們對(duì)微生物群的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及代謝、免疫和神經(jīng)通路等具有積極影響[23]。圖1顯示了由腸道細(xì)菌代謝形成的主要后生元[31]。
已經(jīng)從包括干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在內(nèi)的許多乳桿菌中分離出了蛋白質(zhì)p40和p75[33],它們是含有羧基(C)端CHAP片段或NlpC/P60超家族結(jié)構(gòu)域的胞壁質(zhì)酶,分子質(zhì)量分別約為40 kDa和75 kDa,來(lái)自鼠李糖乳桿菌GG的蛋白質(zhì)p40在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示出免疫調(diào)節(jié)作用[34]。有研究認(rèn)為,p40能夠誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體的磷酸化,抑制細(xì)胞凋亡并保護(hù)結(jié)腸的屏障功能,從而改善腸道損傷和炎癥[31,35-37]。此外,從鼠李糖乳桿菌GG和干酪乳桿菌BL23中純化的p75通過(guò)誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子/蛋白激酶B途徑具有抗凋亡活性[33]。而且p40和p75蛋白能夠通過(guò)蛋白激酶C和促分裂素原活化蛋白激酶依賴性機(jī)制保護(hù)腸上皮緊密連接和屏障功能[38]。
乳桿菌可以分泌多種APF蛋白,是一類負(fù)責(zé)連接接合對(duì)、自聚集、維持細(xì)胞形狀及與其他共生菌或病原菌共聚集的胞外蛋白[39-40]。分泌自乳酸桿菌的APF功能主要涉及定植于宿主內(nèi)和排斥病原體,APF使乳酸桿菌能夠在胃腸道中定植,并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥或與病原體共聚集來(lái)抑制病原體的黏附[41-42]。來(lái)自格氏乳桿菌ATCC 9857菌株的APF-2蛋白有助于抑制陰道毛滴蟲(chóng)對(duì)人陰道外宮頸細(xì)胞的黏附[43-44]。嗜酸乳桿菌GGDEF蛋白和來(lái)自植物乳桿菌NCIMB 8826中富含絲氨酸/蘇氨酸的APF蛋白能夠提升胞外聚合物產(chǎn)量,增強(qiáng)其共聚能力[45]。
細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽[46]。乳酸桿菌可以分泌多種細(xì)菌素,如來(lái)自嗜酸乳桿菌和約氏乳桿菌的乳酸菌素B、來(lái)自干酪乳桿菌的乳酸菌素、來(lái)自干酪乳桿菌的乳酸菌素705、來(lái)自乳酸桿菌的乳酸菌素G和來(lái)自植物乳桿菌的乳酸菌素[47-48]。
乳桿菌分泌的細(xì)菌素可以抑制病原體。瑞士乳桿菌PJ4分泌的細(xì)菌素PJ4可以抑制腸道病原體的活性;陰道短乳桿菌DT24產(chǎn)生的細(xì)菌素DT24對(duì)泌尿病原體大腸桿菌有拮抗作用[49-50]。羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的羅伊氏蛋白通過(guò)修飾硫醇基團(tuán)和誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激發(fā)揮抗菌作用[51]。此外,來(lái)自不同乳桿菌屬的純化細(xì)菌素在小鼠模型中顯示出抗感染功能,證明細(xì)菌素有望成為對(duì)抗胃腸道感染藥物的替代品[52]。除了抗菌作用外,乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素也能夠影響宿主免疫,從嗜酸乳桿菌中分離的細(xì)菌素提高了巨噬細(xì)胞的吞噬活性[53]。
SCFA是由腸道微生物群通過(guò)不同的代謝途徑從纖維、寡糖和多糖等難消化的食物成分中產(chǎn)生的[54]。研究表明,益生菌可以產(chǎn)生不同類型的SCFA[55]。鼠李糖乳桿菌GG和格氏乳桿菌PA16/8能夠產(chǎn)生丙酸[56]。Dhaliwal等[57]證實(shí),給小鼠補(bǔ)充植物乳桿菌會(huì)增加小鼠盲腸中乙酸和丁酸水平,并降低腸道通透性,同時(shí)還會(huì)增加大腦中的單胺氧化酶活性。植物乳桿菌CECT 7529可產(chǎn)生丙酸和丁酸,顯示出降低膽固醇水平的優(yōu)異特性[58]。此外,唾液乳桿菌FP25、FP35及羅伊氏乳桿菌NCIMB產(chǎn)生的SCFA能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[59]。
腸道細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、谷氨酸、血清素、多巴胺、去甲腎上腺素、組胺和乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)腸-腦軸的正常功能[60]。副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等可以產(chǎn)生GABA、血清素、兒茶酚胺、多巴胺和乙酰膽堿等多種神經(jīng)遞質(zhì)[57,61-64]。據(jù)報(bào)道,乳桿菌作為“心理生物”對(duì)心理健康有益處[65]。除此之外,腸道共生乳酸菌產(chǎn)生的組胺和多巴胺在睡眠相關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用,還能調(diào)節(jié)抑郁癥、焦慮癥中的神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo),這表明益生菌對(duì)心理健康的影響可能歸因于神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生[66]。
從不同微生物培養(yǎng)物中獲得的含有由細(xì)菌和酵母分泌到周圍液體中的生物活性代謝物CFS具有不同的活性[14]。嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌CFS通過(guò)抑制促炎性腫瘤壞死因子α及增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)的分泌表現(xiàn)出抗腫瘤活性[67]。來(lái)自乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液最近也在體外實(shí)驗(yàn)中被證明能夠通過(guò)阻止大腸桿菌侵入腸細(xì)胞,從而顯示出抗菌活性,盡管這些抗菌特性可能是由于抑制病原菌株的黏附,但CFS也可能對(duì)腸道環(huán)境、細(xì)胞屏障和基因的表達(dá)產(chǎn)生部分影響[68]。
細(xì)菌細(xì)胞壁的許多成分具有免疫原性(即引發(fā)特定的免疫反應(yīng)),包括細(xì)菌脂磷壁酸[14]。脂磷壁酸存在于革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中,可以自發(fā)釋放到環(huán)境中[69]。盡管脂磷壁酸已被證明具有免疫刺激作用,但關(guān)于其活性的數(shù)據(jù)尚不明確。部分研究表明,脂磷壁酸可減少IL-12的產(chǎn)生并誘導(dǎo)具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子(如IL-10)的產(chǎn)生[70]。脂磷壁酸還可以增強(qiáng)非特異性防御機(jī)制,釋放β-防御素和導(dǎo)管素等抗感染肽,以及刺激皮膚肥大細(xì)胞對(duì)某些細(xì)菌和病毒感染的反應(yīng)[71]。
益生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有不同化學(xué)性質(zhì)的生物聚合物。這些生物聚合物可以釋放到細(xì)菌細(xì)胞壁外,形成一組異質(zhì)的物質(zhì),稱為胞外多糖[14]。從植物乳桿菌產(chǎn)物中分離出的胞外多糖在體外模型中誘導(dǎo)一氧化氮分泌,進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力,還能顯著增加腸黏膜中的免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)含量(P<0.05)并極顯著刺激淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01)[71]。從瑞士乳桿菌中獲得的胞外多糖糖醛酸能夠結(jié)合鐵離子,而具有抗氧化潛力[72]。β-葡聚糖是另一類胞外多糖,可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1受體,增強(qiáng)針對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和癌細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)[73]。
微生物具有針對(duì)活性氧破壞的防御機(jī)制,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和還原型輔酶Ⅰ等抗氧化酶在對(duì)抗活性氧中起著關(guān)鍵作用[14]。研究發(fā)現(xiàn),2 種具有高含量谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的發(fā)酵乳桿菌菌株,在體外具有強(qiáng)大的抗氧化活性[74]。在炎癥性腸病小鼠模型中,具有高過(guò)氧化氫酶活性的乳酸桿菌菌株比產(chǎn)生過(guò)氧化物歧化酶的相同菌株能更有效地緩解炎癥,與對(duì)照組相比,2 種菌株均顯著降低了體溫(P<0.05)[75]。
制備后生元需要先將微生物滅活[10]。不同的滅活方法會(huì)對(duì)微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或其生理功能產(chǎn)生不同的影響,但都要保證制備的后生元能夠保持有益功效[12]。
一般來(lái)說(shuō),后生元是通過(guò)細(xì)胞破碎技術(shù)制備的,包括熱處理、化學(xué)品(如福爾馬林)、超聲處理、酶處理和溶劑提取等[10,12,20,76]。此外,離心、透析、凍干和柱純化等額外的提取和凈化步驟也可用于獲得后生元[10,12,77]。熱處理是最常見(jiàn)的制備方法,加熱的時(shí)間和溫度取決于影響微生物熱阻的因素(如微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基、微生物的生長(zhǎng)階段、微生物的水分活度等)[77]。在Kamilya等[78]的一項(xiàng)研究中,解淀粉芽孢桿菌FPTB16和枯草芽孢桿菌FPTB13經(jīng)60 ℃加熱2 h滅活后對(duì)細(xì)胞免疫的刺激效果優(yōu)于活菌。Sa?udo等[79]通過(guò)121 ℃、20 min加熱處理唾液乳桿菌CECT 5713制備的無(wú)活力細(xì)胞能夠抑制與齲齒形成相關(guān)的病原體變形鏈球菌,臨床研究顯示,志愿者體內(nèi)的變形鏈球菌唾液含量從治療的第3天開(kāi)始顯著降低。
另一方面,非熱和新興技術(shù)雖然報(bào)道較少,但也已用于制備后生元(表1)[77]。與熱處理相比,這些技術(shù)具有提高微生物的滅活率、減少有機(jī)廢物的產(chǎn)生和能源消耗等多種優(yōu)勢(shì)[77]。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)紫外線照射腸球菌L-1滅活處理2.5 h獲得的后生元在刺激4 種不同細(xì)胞免疫系統(tǒng)的過(guò)程中能提高白細(xì)胞的吞噬活性、呼吸爆發(fā)和過(guò)氧化物酶含量[80]。Dunand等[81]通過(guò)噴霧干燥的方法制備5 種商業(yè)菌株(Delvo-Add 100-HDSF、LH-B02、Lb-12、Cheestart H 2085和Cheestart H 2087)和11 種本地乳桿菌菌株(瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、德氏乳桿菌)的后生元。結(jié)果表明,與對(duì)照組(活細(xì)胞)相比,噴霧干燥制備的后生元刺激了小鼠糞便中分泌性IgA的產(chǎn)生,并保護(hù)小鼠免受沙門(mén)氏菌感染。Rakhuba等[82]通過(guò)超臨界流體技術(shù)(以超臨界CO2為流體)從植物乳桿菌B-01中提取糖脂,糖脂定量測(cè)定結(jié)果表明,在25 MPa、40 ℃、超臨界CO2流速為5 mL/min、以供氫甲醇作為助溶劑(體積分?jǐn)?shù)9.3%)的條件下提取9 h,可在每毫克提取物中得到620 μg糖脂。
表 1 后生元制備技術(shù)[77]Table 1 Postbiotic preparation techniques[77]
從根本上講,后生元是否能夠抑制與食品安全相關(guān)的有害微生物,主要通過(guò)分析其化學(xué)成分和進(jìn)行體外拮抗實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證[83]。后生元和具有拮抗活性分子的定量和質(zhì)量應(yīng)使用分析程序進(jìn)行測(cè)試[12]。鑒于具有不同聚合度和糖苷鍵的生物化合物的復(fù)雜性,后生元的定性、定量分析通常需要具有多個(gè)濃縮/凈化步驟的復(fù)雜設(shè)備[83]。對(duì)于后生元的定性、定量分析已經(jīng)應(yīng)用了大量?jī)x器技術(shù)和創(chuàng)新方法,常見(jiàn)的方法有色譜法(氣相、液相、薄層色譜等)、光譜法(核磁共振、傅里葉變換紅外吸收光譜)及分光光度法[18]。通常根據(jù)分析目標(biāo)和所追求的表征類型選擇適當(dāng)?shù)姆椒╗18,83]。
盡管所有這些技術(shù)都可用于檢測(cè)、識(shí)別和量化后生元,但需要對(duì)提取方案和分析工具進(jìn)行更多研究,以便于發(fā)現(xiàn)和表征新型后生元、了解作用機(jī)制及調(diào)節(jié)信號(hào)通路[83]。還需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及分析方法[84]。一旦實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模優(yōu)化,就需對(duì)其進(jìn)行放大和優(yōu)化,提高工業(yè)后生元產(chǎn)量[12]。
在過(guò)去的幾年里,消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)和健康的重要性有了更多的認(rèn)識(shí)和關(guān)注,使得包含益生菌在內(nèi)的功能性食品迅速崛起,據(jù)估計(jì),到2023年全球益生菌市場(chǎng)將達(dá)到693 億美元[18]。乳制品具有與高緩沖能力和脂肪球、酪蛋白膠束和乳糖這些牛乳成分相關(guān)的理想特性,這些特性能為益生菌通過(guò)胃腸道期間提供保護(hù)[85]。同時(shí),由于乳粉、酸乳等食品具有低水分活度和低pH值等特性,對(duì)益生菌在貯藏期間的存活率幾乎沒(méi)有限制。這些因素使得乳制品(發(fā)酵乳、乳飲品、冰淇淋、奶酪)成為最常見(jiàn)的益生菌載體,占據(jù)了益生菌市場(chǎng)的最大份額[86]。
受限于益生菌的活力是其發(fā)揮生物功效的必要條件,乳制品在加工、貯藏甚至人體消化過(guò)程中,添加的益生菌濃度需達(dá)到106~109CFU/g(mL)來(lái)保持活力[18]。而乳制品載體的理化指標(biāo)(pH值、蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物含量、水分活度、天然抗生素的存在)、加工和貯藏條件(時(shí)間、溫度、接種率、pH值、氧含量、包裝材料)等應(yīng)激因素可能對(duì)其存活率和功能產(chǎn)生不利影響[18,87]。相比之下,后生元在工業(yè)使用中更穩(wěn)定、更安全。因此,與相同的活微生物相比,其在乳制品中的應(yīng)用可能提供多項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)[18]。
與益生菌產(chǎn)品相比,添加后生元的乳制品在生產(chǎn)加工和商業(yè)化方面更加簡(jiǎn)單和方便。它們與食品基質(zhì)或成分的化合物相互作用很少或沒(méi)有相互作用,從而延長(zhǎng)保質(zhì)期[77]。它們?cè)诤軐挼膒H值和溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,在不影響后生元功能的前提下能夠在熱處理之前添加到具有較高酸度的食品中,最大限度減少加工后微生物污染[12,77]。根據(jù)產(chǎn)品的不同,后生元產(chǎn)品在貯運(yùn)過(guò)程中可能擺脫冷鏈運(yùn)輸范圍的限制,除了有利于功能性乳制品下沉至欠發(fā)達(dá)地區(qū),還節(jié)省了產(chǎn)品成本及損耗[18]。另一巨大優(yōu)勢(shì)是后生元不會(huì)改變產(chǎn)品的感官特性,含有后生元的酸乳發(fā)酵后會(huì)避免發(fā)生高酸化[12,18,77]。因此,后生元除了在乳制品的生產(chǎn)和商業(yè)化過(guò)程中提供便利性和實(shí)用性以外,還可能在不適合益生菌生存的食品中應(yīng)用,擴(kuò)大功能性產(chǎn)品的市場(chǎng)。
除了上述優(yōu)點(diǎn)外,由于其功能特性,后生元對(duì)最終產(chǎn)品的理化和感官特性也會(huì)產(chǎn)生積極影響,提供更好的穩(wěn)定性、質(zhì)地和適口性,從而用作功能性輔料進(jìn)行添加[18]。Ali等[88]發(fā)現(xiàn),嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠克服脫水收縮問(wèn)題,減少乳清析出,可以作為合成食品添加劑(增稠劑和乳化劑)的替代品在酸乳生產(chǎn)過(guò)程中提供更好的質(zhì)地和感官特性。該研究發(fā)現(xiàn),后生元被機(jī)體適當(dāng)?shù)匚蘸痛x后,具有與各種組織和器官顯著的信號(hào)傳導(dǎo)潛力,鑒于其良好的抗菌作用,它們很有可能成為抗生素替代品[89]。由于其獨(dú)特的特性(保質(zhì)期長(zhǎng)、無(wú)毒、易于運(yùn)輸和維護(hù)成本低),后生元可作為抗菌物質(zhì)用于食品工業(yè)中防止食品腐敗[13,90]。Lactis菌株的后生元成分可用作奶酪中的防腐劑[91]。此外,作為一種天然化合物,后生元還能夠幫助實(shí)現(xiàn)乳制品的“清潔標(biāo)簽”要求,滿足消費(fèi)者對(duì)健康和天然食品的需求[18,83]??刮⑸飫┳鳛橐环N后生元可通過(guò)抑制食源性病原體和腐敗微生物的生長(zhǎng)來(lái)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期,運(yùn)用在酸乳中可達(dá)到“清潔標(biāo)簽”的效果[92]。
后生元可能有助于改善宿主健康。本文對(duì)于后生元特性的概述使我們能夠確定:1)它們可以由多種益生菌菌株制成;2)它們可以通過(guò)多種滅活方法獲得/生產(chǎn);3)它們可以通過(guò)多種分析方法進(jìn)行定性和定量表征;4)后生元在乳制品行業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
未來(lái)后生元的發(fā)展方向應(yīng)側(cè)重于機(jī)制研究,需要更多的證據(jù)來(lái)支持后生元作為健康補(bǔ)充劑的主張。腸道菌群是未來(lái)臨床研究的重要參數(shù),可以通過(guò)應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法來(lái)更好地了解后生元影響健康的潛在機(jī)制和信號(hào)通路。
后生元對(duì)于開(kāi)發(fā)具有功能性成分的生物技術(shù)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)具有寶貴的潛力,但首先需要解決安全和監(jiān)管問(wèn)題,而且需要在工業(yè)水平上設(shè)計(jì)用于規(guī)?;a(chǎn)后生元的工藝,以及發(fā)現(xiàn)并表征新型后生元的新技術(shù),以保證它們?cè)谏a(chǎn)過(guò)程中和在潛在的預(yù)防及治療中保持一致性與有效性。