腸道菌群與結(jié)直腸癌進(jìn)展關(guān)系的臨床研究探討*

張默涵 葛振宇 譚楊 谷金華 史立宏 張小茜

近年來，隨著中國人群飲食結(jié)構(gòu)與生活方式逐漸西方化，相關(guān)癌癥（結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌）發(fā)病率呈上升趨勢。結(jié)直腸癌近年來已成為全球，尤其是中國的常見惡性腫瘤[1]。大多數(shù)散發(fā)的結(jié)直腸癌遵循常規(guī)的“正常-腺瘤-癌”序列，與在特定進(jìn)展階段發(fā)生的特定突變相關(guān)[2]。在分子水平上，有研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）可通過激活STAT3信號通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[3-4]。

大量的證據(jù)表明結(jié)直腸癌發(fā)生與腸道菌群、遺傳和其他因素密切相關(guān)[5-6]。有研究顯示，多種腸道菌群與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)，但特異菌仍未明確。有研究表明，在結(jié)直腸癌患者的糞便中Prevotellaceae、Fusobacterium和Peptostreptococcus等菌群顯著升高[7]。

本研究旨在尋找與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的特定腸道菌群，通過16srRNA測序技術(shù)對健康對照組、腺瘤性息肉組和結(jié)直腸癌組的腸道菌群進(jìn)行比較，并檢測3組樣本腸道組織的IL-6的表達(dá)，以評估腸道菌群對結(jié)直腸癌進(jìn)展的影響，為進(jìn)一步臨床治療策略的確定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選取2020年1月至2021年5月于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的40例患者，根據(jù)疾病類型分為C組（20例結(jié)直腸癌患者）、A組（20例腺瘤性息肉患者）。另外，篩選于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)胃腸鏡健康查體的就診者20例，設(shè)為N組作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有結(jié)直腸癌與腺瘤性息肉的診斷均由至少2名專業(yè)醫(yī)師依據(jù)結(jié)腸鏡表現(xiàn)與病理結(jié)果進(jìn)行診斷。2）年齡在18～70歲，過去近6個(gè)月無抗生素與益生菌服用史。3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）具有其他胃腸道疾病或具有糖尿病、高血壓、肥胖癥、結(jié)石及各種存在肝、臟嚴(yán)重原發(fā)性疾病患者、精神疾病障礙不能耐受腸鏡檢查者；2）標(biāo)本收集前3個(gè)月應(yīng)用抗生素或益生菌的；3）依從性差，難以隨訪的患者。4）具有3年及以上酗酒史的。所有參加研究的受試者都被告知研究性質(zhì)，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集和DNA提取 所有糞便樣本均采用無菌糞便盒收集，收集后分類編號并于2 h內(nèi)置于-80℃冰箱儲存，以準(zhǔn)備進(jìn)一步提取DNA。使用Power Soil DNA提取試劑盒（MO Bio Laboratories公司，購自北京）按照說明書的操作規(guī)程從樣品中提取細(xì)菌總DNA。以260 nm/280 nm和260 nm/230 nm的比值評價(jià)DNA的質(zhì)量和數(shù)量。然后將DNA保存在-80℃，等待下一步處理。

用通用引物對（正向引物：5’-ACTCCTACGGG AGGCAGCA-3’；反向引物：5‘-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3’）結(jié)合適配序列和條碼序列，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增總體積為50 μL，包括10 μL Buffer，0.2 μL Q5高保真DNA聚合酶，10 μL高GC增強(qiáng)子，1 μL dNTP，每個(gè)引物10 μM，60 ng基因組DNA。熱循環(huán)條件為：在95℃下初始變性5 min，然后在95℃下變性1 min，在50℃下變性1 min，在72℃下加熱1 min，最后在72℃下延伸7 min。第1輪的PCR產(chǎn)物通過VahtsTM DNA清潔珠純化。第2輪PCR在40 μL反應(yīng)中進(jìn)行，該反應(yīng)包含20 μL 2×Phμsion HF MM、8 μL ddH2O、每種引物10 μM和第1輪的PCR產(chǎn)物10 μL。熱循環(huán)條件如下：首先在98℃下變性30 s，然后在98°C下變性10 s，65℃變性30 s，72℃變性30 s，在72℃下延長5 min。最后用Quant-itTMdsdna-hs試劑對所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并匯集在一起。利用中國北京Biomarker Technologies Corporation的Illumina HiSeq 2 500平臺（2×250對末端）對純化的混合樣品進(jìn)行細(xì)菌rRNA基因的高通量測序分析。物種鑒定和分類細(xì)菌 16S：使用Silva（Release128，http：//www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫對物種鑒定和分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測IL-6在3組腸道組織的表達(dá) C組取材于結(jié)直腸癌患者術(shù)后的腫瘤組織，A組取材于腸鏡下所取的腺瘤性息肉患者的息肉組織，N組取材于健康體檢者的腸壁組織。將收集的C組、A組、N組的組織進(jìn)行固定、包埋，利用免疫組織化學(xué)法分別檢測3組組織樣本IL-6的表達(dá)情況，IL-6定位于細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色顆粒為染色陽性。染色結(jié)果判定采用半定量結(jié)果判斷：每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度：細(xì)胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞＜5%為0分， 5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將陽性細(xì)胞百分比和陽性強(qiáng)度兩項(xiàng)相乘，得到該視野的最終得分。每張切片的得分為該切片選取的5個(gè)視野得分的平均值。最后該切片按照得分為下述4個(gè)等級：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），8分以上為強(qiáng)陽性（+++）。統(tǒng)計(jì)學(xué)上把強(qiáng)陽性（+++）與陽性（++）所占比率稱為為陽性率。

1.2.3 觀察指標(biāo) 1）α多樣性分析：α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，其中度量菌群豐度的指標(biāo)：Chao1指數(shù)；度量菌群多樣性的指標(biāo)：香農(nóng)指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)越大說明群落多樣性越高。

2）β多樣性分析：β多樣性分析用于比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。基于binary_jaccard等算法呈現(xiàn)物種多樣性的矩陣；基于R語言平臺繪制主坐標(biāo)分析（PCoA），通過主坐標(biāo)分析實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的分類，進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異；UPGMA分析，樣品越靠近，枝長越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似；Anosim分析，可以對不同分組的樣品之間beta多樣性是否有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。

3）LefSe和Metastats分析：LefSe分析，即組間差異顯著物種分析（或biomarkers分析），采用線性判別分析（LDA）來估算每個(gè)組分（物種）豐度對差異效果影響的大小，該分析目的為找到組間在豐度上有顯著性差異的物種。Metastats分析，對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)得到P值，并對P值進(jìn)行校正得到Q值；最后根據(jù)P值（或Q值）篩選出導(dǎo)致兩組樣品組成差異的物種，P＜0.05，Q＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件用于所有統(tǒng)計(jì)分析和圖表構(gòu)建。使用t檢驗(yàn)來評估微生物分類群、臨床參數(shù)和多樣性指數(shù)差異的顯著性，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，多樣本率的比較采用KrusKal-Wallis秩和檢驗(yàn)法（H檢驗(yàn)法）。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同樣本間菌群的豐度差異

隨著測序條數(shù)的加大，檢測到的OTU數(shù)目逐漸增多，稀釋性曲線先急劇上升后趨于平緩（圖1A）。熱圖展示了不同樣本在屬的水平所包含優(yōu)勢菌群的豐度差異，呈現(xiàn)組內(nèi)聚集現(xiàn)象（圖1B）。物種分布柱狀圖展示了不同樣本在屬的水平特征菌群所占的比例（圖1C）。綜上所述，在“健康—腺瘤性息肉—結(jié)直腸癌”3組中，每個(gè)樣本的菌群的豐度并不相同。

圖1 不同樣本間菌群的豐度差異

2.2 不同樣本間菌群的多樣性差異

反映物種多樣性的香農(nóng)指數(shù)曲線隨著測序條數(shù)的加大先急劇上升后趨于平緩（圖2A）?；赽inary_jaccard算法的PCoA顯示，3組樣本的多樣性同組之間相互聚集，不同組之間相互分離。（圖2B）。基于binary_jaccard算法的Anosim分析箱形圖可見R=0.322，P=0.001（圖2C）。

圖2 不同樣本間菌群的多樣性差異

2.3 部分菌群與結(jié)直腸癌的進(jìn)展相關(guān)

C組、A組與N組的Chao1指數(shù)具有顯著性差異，且C組與A組的差異較大（P＜0.01），而A組與N組的差異較?。≒＜0.05）（圖3A）。物種分布柱狀圖顯示在N組中Bifidobacterium、Faecalibacterium豐度較高、A組中Escherichia-Shigella、Enterobacteriaceae豐度較高、C組中Lachnospiraceae豐度明顯降低，Escherichia-Shigella、Enterobacteriaceae豐 度 較 高（圖3B）。分支圖和LEfSe分析顯示差異最顯著的菌為結(jié)直腸癌組中Prevotellaceae；腺瘤性息肉組中的Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae和正常組中的Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae（LDA得分＞4，P＜0.05，圖3C，3D）。

2.4 IL-6在3組不同組織樣本中的表達(dá)水平比較

利用免疫組織化學(xué)法檢測3組不同腸道組織的IL-6的表達(dá)，IL-6的陽性部位在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色。結(jié)果顯示IL-6蛋白在C組中的陽性率為95%（19/20），其中強(qiáng)陽性為60%（12/20），陽性為35%（7/20），弱陽性為5%（1/20），陰性為0（0/20），在A組中的陽性率為60%（12/20），其中強(qiáng)陽性為5%（1/20），陽性為55%（11/20），弱陽性為40%（8/20），陰性為0（0/20），在N組中的陽性率為0（0/20），弱陽性為30%（6/20），陰性為70%（14/20）。IL-6在C組中的陽性率高于A組高于N組，且3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=43.570，P＜0.01）（表1，圖4）。

圖4 免疫組織化學(xué)檢測各組織中IL-6的表達(dá)水平 （IHC×400）

表1 IL-6蛋白在3組腸道組織中的表達(dá)情況

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可以通過多種方式影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展，例如誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子[8]、抑制NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷[9]等，也有部分腸道微生物可通過代謝食物成分產(chǎn)生短鏈脂肪酸抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[10]。與健康人相比，結(jié)直腸癌患者的糞便微生物豐度以及優(yōu)勢菌群有很大差異[11]。據(jù)報(bào)道，腸道菌群的差異可能會影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[12]。目前，16srRNA測序作為一種分析腸道微生物多樣性的工具已在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用[13]。盡管腸道菌群與腸道疾病之間的關(guān)系已有大量研究，但與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的特異性菌群仍不明確。

本研究中采用16srRNA測序技術(shù)，探究在“健康-腺瘤性息肉-結(jié)直腸癌”的進(jìn)展過程中受試者腸道菌群的數(shù)量和豐度差異。有研究表明與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組的糞便腸道菌群多樣性增加[14-15]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。但也有其他研究表明，與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組的腸道微生物豐度和多樣性降低[2,14]，這可能與地域差異、樣本數(shù)量或疾病的進(jìn)展時(shí)期有關(guān)。通過α多樣性及β多樣性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組腸道微生物群落的組成及多樣性與腺瘤性息肉組及健康對照組之間有顯著性差異：即3組中，每個(gè)樣本的菌群豐度與多樣性并不相同，且呈現(xiàn)出組內(nèi)樣本差異小，組間樣本差異大的現(xiàn)象。有研究表明，Prevotellaceae可能與結(jié)直腸癌有密切關(guān)系，其在結(jié)直腸癌患者的腸腔內(nèi)明顯富集[16]。Prevotellaceae在既往研究中也被證明在AOM/DSS小鼠中的表達(dá)高于對照組，并可以增加DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度[17]。Bifidobacteriaceae豐度較高的一組可檢測到結(jié)腸中較高的短鏈脂肪酸水平[18]，另外有研究表明，Ruminococcaceae也產(chǎn)生短鏈脂肪酸[19]。在本研究中，初步探討了在“健康-腺瘤性息肉-結(jié)直腸癌”的進(jìn)展過程中受試者腸道菌群的變化，并通過LEfSe分析進(jìn)一步明確了結(jié)直腸癌組中差異最顯著的菌為Prevotellaceae，這與既往研究一致，說明該菌群可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展；而腺瘤性息肉組中差異最顯著的菌為Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae，提示上述菌群可能參與腺瘤性息肉的發(fā)生。而正常組中，差異最顯著的菌為Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae，說明這兩種菌可能抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。簡而言之，LEfSe分析揭示3組間差異最顯著的特定菌群。最后，本研究還驗(yàn)證了大腸癌進(jìn)展過程中健康受試者的腸壁組織、腺瘤性息肉患者的息肉組織和結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中IL-6的表達(dá)，IL-6在腫瘤組織中的陽性率高于腺瘤性息肉組高于健康組，且3組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明隨著結(jié)直腸癌的進(jìn)展，IL-6的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，即慢性炎癥可能通過產(chǎn)生IL-6等炎性因子導(dǎo)致癌前病變，進(jìn)而進(jìn)展為結(jié)直腸癌。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，腸道菌群在結(jié)直腸癌進(jìn)展的不同階段可能作為評估患者病情的生物標(biāo)志物，并可能通過IL-6影響癌癥的進(jìn)展。鑒別癌前病變或腫瘤病變特有的細(xì)菌群落可提供更有效的診斷策略，后續(xù)將分析長期處于不同結(jié)直腸癌進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)中的患者，并繼續(xù)加大樣本數(shù)量、深入探索更多通路，探究潛在的促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物及其促癌作用的機(jī)制。