添加枸杞副產(chǎn)物對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質及微生物多樣性的影響

張歡，牟怡曉，張桂杰

（寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021）

紫花苜蓿（Medicago sativa）因營養(yǎng)品質佳而廣泛用于畜牧業(yè)，由于收獲受雨季影響而制約牧草加工利用。青貯是基于厭氧條件下乳酸發(fā)酵的貯存方法，可較大程度保留青綠飼料營養(yǎng)成分，并有利于解決季節(jié)性飼草短缺的問題［1-2］。紫花苜?？扇苄蕴妓衔锖康?、干物質含量低、緩沖能高且附生乳酸菌數(shù)量少，因而青貯發(fā)酵品質較差。枸杞（Lycium barbarum）是我國西北干旱地區(qū)重要藥食同源的植物資源，是寧夏傳統(tǒng)優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)之一。截至2018年，寧夏全區(qū)枸杞種植面積達6.67萬hm2，年枸杞干果產(chǎn)量達14萬t［3］。枸杞副產(chǎn)物（Lycium barbarumby-products，LBP）為枸杞加工業(yè)副產(chǎn)品，主要包括殘次果、果柄和枸杞葉等。據(jù)估算，寧夏枸杞主產(chǎn)區(qū)枸杞干果殘次品年產(chǎn)量為6萬～7萬t［4］，大量LBP不合理利用將帶來環(huán)境污染及資源浪費等問題。近年來，抗生素濫用造成細菌耐藥性和藥物殘留等問題日益突出。因此，將枸杞等中草藥作為飼料添加劑開發(fā)是替代抗生素、降低成本的重要舉措。

枸杞枝條、葉厭氧發(fā)酵后，仍保留其藥用及營養(yǎng)成分，可提高反芻動物飼糧中蛋白質及有機酸含量并促進畜禽腸道健康［5-7］。此外，寧夏枸杞及LBP富含活性物質枸杞多糖［8-9］，是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，已作為安全的非抗生素替代品用作動物飼料［10］。枸杞多糖具有抗氧化、免疫調節(jié)等生物活性，可促進反芻動物瘤胃發(fā)酵，并抑制家畜感染病毒［10-12］。研究表明，枸杞中多糖類物質經(jīng)發(fā)酵后分解為小分子糖類，可增加乳酸菌和雙歧桿菌豐度，抑制腸桿菌生長［13-14］?；诖?，推測LBP可作為青貯添加劑，通過改善糖發(fā)酵底物和抑制有害微生物來提高青貯質量。本研究針對苜蓿青貯品質不佳及LBP資源利用兩個問題，研究適宜比例LBP對苜蓿青貯營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質和微生物多樣性的影響，以期為LBP合理開發(fā)、高效利用及改善苜蓿青貯發(fā)酵品質提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗分為對照組（CK）和LBP處理組，共設4個處理，每個處理4個重復。對照組為苜蓿單貯，處理組為苜蓿枸杞副產(chǎn)物混合青貯，二者混合比例分別為每kg青貯飼料（基于鮮重基礎）40（T1）、60（T2）、80 g（T3）枸杞副產(chǎn)物（風干重）。LBP含水量為6.26%，按上述比例與苜?；旌虾笸ㄟ^晾曬和添加水分將含水量調至65%左右。約500 g裝入密封發(fā)酵罐（瓶口直徑92 mm，封蓋高97 mm，密度約為775 kg·m-3），置于室溫貯存60 d。青貯60 d后測定營養(yǎng)成分、發(fā)酵特性及微生物多樣性。

1.2 試驗材料

紫花苜蓿（中苜三號）：種植于寧夏農(nóng)墾茂盛草業(yè)有限公司（溫帶大陸性氣候，106°03′E，38°33′N，海拔1135 m），2019年5月18日收獲后立即運回實驗室用閘刀切短至1～2 cm備用。

枸杞副產(chǎn)物：購于寧夏綠健源生物科技有限公司，粉狀。

1.3 指標測定

1.3.1發(fā)酵參數(shù)及化學成分 取10 g青貯飼料樣品于90 mL蒸餾水，勻漿1 min，4℃下浸提24 h，經(jīng)4層紗布和雙層濾紙過濾后獲得青貯飼料浸提液，每個樣品取4份浸提液-20℃保存。分別用雷磁PHS-3G精密pH計、苯酚-次氯酸鈉比色法［15］、乳酸測試盒（A 019-2-1型，南京建成生物工程研究所）乳酸脫氫酶法和日本島津GC-2010氣相色譜儀測定pH值、氨態(tài)氮、乳酸、乙酸和丁酸含量。

原料及剩余青貯飼料取200 g裝入信封于105℃殺青30 min，65℃烘箱烘干48 h至恒重，測定干物質含量，粉碎后過2 mm篩進行化學分析。參照張麗英［16］的方法測定粗蛋白質、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量；參照李富國［17］的方法測定可溶性碳水化合物含量；使用總多糖含量測試盒（ZDT-1-Y型，蘇州科銘生物）微量法測定多糖含量。

1.3.2有氧穩(wěn)定性 發(fā)酵60 d后將青貯飼料裝入新的發(fā)酵袋中，將溫度記錄儀（HOBO Pendant Temperature，美國）放入發(fā)酵袋幾何中心處，封口并在青貯袋上扎孔，使空氣可以自由進入袋中，置于室溫下保存。同時在室內(nèi)放置溫度記錄儀，每30 min記一次溫度。若青貯袋中溫度高于室溫2℃，則說明青貯飼料開始腐敗變質，計算青貯飼料開袋至腐敗變質的時間即為有氧穩(wěn)定性。

1.3.3原料及青貯飼料微生物多樣性測定 使用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國）試劑盒提取樣品中微生物總DNA。選用細菌16S rRNA的V 3～V 4可變區(qū)，采用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對所提取的DNA模板進行PCR擴增。使用Illumina Miseq測序平臺（Illumina Corporation，San Diego，美國）進行測序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS 18.0比較均值進行ANOVA方差分析，組間差異利用Duncan氏進行多重比較，P＜0.05作為差異顯著并標注。使用Uparse軟件對有效序列進行OTU聚類（相似度97%以上），利用RDP classifier比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU 132），對每條序列進行物種分類注釋，設置比對閾值為70%。采用Mothur軟件平臺進行Alpha多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 青貯原料特性

紫花苜蓿和LBP青貯前營養(yǎng)成分及微生物組成分別見表1及圖1。LBP的CP含量高達17.16%，NDF和ADF含量相對較低。LBP和紫花苜蓿主要生物活性成分多糖含量（基于鮮重）分別為1.70%和1.30%。紫花苜蓿附生微生物中，乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）及片球菌屬（Pediococcus）相對豐度分別為2.65%、1.10%及0.06%；LBP中魏斯氏菌屬相對豐度為0.23%，并含有0.12%片球菌屬。紫花苜蓿中泛菌屬（Pantoea）相對豐度為13.21%，而LBP中泛菌屬相對豐度較低，為12.11%。

圖1 青貯前紫花苜蓿和枸杞副產(chǎn)物微生物組成Fig.1 Microbial composition of fresh alfalfa and LBP

表1 青貯原料化學成分Table 1 Nutrient composition of fresh alfalfa and LBP

2.2 枸杞副產(chǎn)物和苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分分析

LBP可提高苜蓿青貯飼料多糖含量（表2），且隨LBP比例上升而顯著增加（P＜0.05）；NDF含量隨LBP添加量的增加而顯著下降（P＜0.05）；T3處理中WSC含量顯著高于其他處理（P＜0.05），但T1、T2和CK之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 枸杞副產(chǎn)物對紫花苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分的影響Table 2 Effects on nutrient composition of alfalfa silage pr epar ed with LBP

2.3 枸杞副產(chǎn)物和苜蓿青貯發(fā)酵品質分析

LBP處理組的pH值和氨態(tài)氮含量顯著降低（P＜0.05），并顯著增加乳酸含量及乳酸乙酸比（P＜0.05），所有青貯樣品中均未檢測到丁酸（表3）。苜蓿自然發(fā)酵開封后，僅95 h后有氧變質（圖2）。LBP處理組較對照組有氧穩(wěn)定時間分別延長至214、213、170 h，表明LBP可提高苜蓿青貯飼料有氧穩(wěn)定性。LBP添加比例超過6%時有氧穩(wěn)定性略有降低，但仍高于對照組。

圖2 枸杞副產(chǎn)物對紫花苜蓿青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects on aer obic stability of alfalfa silage prepar ed with LBP

表3 枸杞副產(chǎn)物對紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質的影響Table 3 Effects on fermentation quality of alfalfa silage pr epar ed with LBP

2.4 枸杞副產(chǎn)物和苜蓿青貯飼料微生物多樣性指數(shù)特征分析

Alpha多樣性分析中，所有樣本Coverage指數(shù)均在0.99以上（表4），表明測序結果足以反映樣本中絕大部分微生物物種信息。樣本中序列豐度＞1%的OTU數(shù)目分別為57（CK）、59（T1）、72（T2）、94（T3），OTU數(shù)目隨LBP添加比例增加而上升，說明LBP可增加苜蓿青貯中微生物豐富度，促進菌群增殖。T3處理組Chao指數(shù)顯著（P＜0.05）高于對照組，說明添加一定量LBP可增加苜蓿青貯中微生物豐度。而各處理香農(nóng)指數(shù)無顯著差異，表明LBP對苜蓿青貯中微生物多樣性無顯著（P＞0.05）影響。

表4 Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index

2.5 枸杞副產(chǎn)物和苜蓿青貯飼料微生物群落的Venn圖分析

4個不同處理共獲得285個OTU（圖3），其中共有OTU數(shù)目為67個，占比為23.51%。CK、T1、T2和T3分別含有137、138、176和208個OTU，表明隨LBP添加比例增加，OTU數(shù)目隨之上升。CK、T1、T2和T3中所特有的OTU數(shù)目分別為15、14、24和41個。T1和T2兩個處理的213個OTU中，共有101個OTU，占比為47.42%；T1和T3兩個處理的241個OTU中，共有105個OTU，占比為43.57%；T2和T3兩個處理的251個OTU中，共有133個OTU，占比為52.99%，說明T2和T3微生物組成更為接近。T1和CK兩個處理的193個OTU中，共有82個OTU，占比為42.49%；T2和CK兩個處理的218個OTU中，共有95個OTU，占比為43.58%；T3和CK兩個處理的237個OTU中，共有108個OTU，占比為45.57%，表明T3和CK微生物組成更為接近。

圖3 基于OTU水平的青貯細菌群落的Venn圖Fig.3 Venn map of silage bacter ia community on OTU level

2.6 基于屬水平的枸杞副產(chǎn)物和苜蓿青貯飼料微生物豐度分析

LBP和苜蓿青貯在屬水平下豐度前10的微生物組成比較見圖4。苜蓿青貯優(yōu)勢菌屬分別為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬。LBP降低了苜蓿青貯中乳桿菌屬相對豐度，增加了魏斯氏菌屬和片球菌屬（P＜0.05）相對豐度。對照組乳桿菌屬相對豐度為70.60%，添加LBP后分別下降至66.40%（T1）、64.92%（T2）和56.77%（T3）；對照組魏斯氏菌屬相對豐度為23.73%，添加LBP后分別增加至27.92%（T1）、26.03%（T2）和32.24%（T3）；對照組片球菌屬相對豐度為2.82%，添加LBP后分別增加至3.19%（T1）、6.19%（T2）和7.20%（T3）。腸球菌屬（Enterococcus）、氣球菌屬（Aerococcus）和泛菌屬（Pantoea）極顯著（P＜0.01）影響不同處理中微生物群落的相對豐度。

圖4 青貯微生物相對豐度（前10個屬）變化Fig.4 Microbial abundance of silage based on percentages on genus level（top 10 genus）

3 討論

3.1 枸杞副產(chǎn)物對苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

原料特性會直接影響青貯飼料品質［18］。LBP的CP、NDF和ADF含量分別為17.16%、22.05%和15.97%。相對較高的CP含量和較低的纖維含量表明LBP既可作為潛在優(yōu)質動物蛋白飼料來源，又具有較好的消化性能。WSC含量是決定青貯飼料發(fā)酵品質的重要因素之一［19］。本研究發(fā)現(xiàn)T3處理組可提高青貯飼料中WSC含量，但添加比例低于80 g·kg-1則對苜蓿青貯飼料無影響。本試驗中，LBP處理組中多糖含量顯著高于對照組，但不同添加比例之間無顯著差異，這是由于枸杞多糖類物質經(jīng)發(fā)酵后被消耗或降解為更易吸收的小分子糖類［20-21］，LBP中多糖轉化為糖類物質可為乳酸菌提供更多發(fā)酵基質。青貯中多糖含量較發(fā)酵之前有所下降，這可能與青貯過程中某些微生物利用多糖作為糖源有關。馬曉娟等［21］研究表明，枸杞多糖可作為益生元對乳酸菌起到增殖作用，進一步表明乳酸菌代謝與轉化可能會與多糖有關。綜上所述，通過對青貯原料和青貯飼料營養(yǎng)成分的分析表明，LBP有助于提高紫花苜蓿青貯飼料營養(yǎng)價值和活性成分。

3.2 枸杞副產(chǎn)物對苜蓿青貯品質的影響

青貯是一種基于乳酸發(fā)酵的牧草貯存方法，在厭氧條件下利用乳酸菌分解糖類產(chǎn)生大量乳酸，由于乳酸和其他有機酸的產(chǎn)生，致使pH值下降，并抑制腐敗菌和病原微生物生長［22］。與對照組相比，隨著LBP比例增加p H值呈下降趨勢，表明LBP可促進苜蓿青貯快速降低p H值。乙酸是異型發(fā)酵產(chǎn)物，有利于提高青貯有氧穩(wěn)定性，乳酸乙酸比能反映同型發(fā)酵程度，值越高同型發(fā)酵程度越高［23］。LBP添加量為80 g·kg-1時降低了乙酸含量，不利于青貯的有氧穩(wěn)定性。與對照相比，LBP處理可增加苜蓿青貯飼料的有氧穩(wěn)定性（圖2），可能與枸杞多糖等活性物質抑制不良微生物有關，其中40和60 g·kg-1添加量效果較佳。本試驗中乳酸含量隨LBP比例的增加而增加，乳酸乙酸比增大。這可能是因為枸杞經(jīng)發(fā)酵后主要含有乳酸、酒石酸和草酸等有機酸［20］，從而提高了乳酸含量。氨態(tài)氮反映了青貯中蛋白質等含氮物質的降解程度，氨態(tài)氮的積累受植物蛋白酶活性和微生物活性影響，當p H值達到5.0～6.0時，梭狀芽孢桿菌和植物蛋白水解酶活性較大，從而積累大量氨態(tài)氮［24］。對照組氨態(tài)氮含量較高的原因可能是p H值（4.91）較高，LBP可降低苜蓿青貯飼料中氨態(tài)氮含量，可能是由于p H值較低所致。此外，枸杞副產(chǎn)物中某些生物活性成分可能通過抑制不良微生物來減少蛋白質水解。

3.3 枸杞副產(chǎn)物對苜蓿青貯微生物多樣性的影響

青貯原料在發(fā)酵和貯藏過程中會產(chǎn)生一系列生化和微生物菌群變化［25］。紫花苜蓿鮮草中泛菌屬（Pantoea）微生物的相對豐度為13.21%，泛菌屬微生物在厭氧條件下將糖發(fā)酵為乙酸、丙酸和琥珀酸［26］，這也解釋了苜蓿青貯乙酸含量高、乳酸乙酸比低的現(xiàn)象。本試驗中，發(fā)酵完成后的青貯飼料相比青貯原料的微生物多樣性降低。大量學者研究表明苜蓿青貯過程中和發(fā)酵完成后微生物群落組成及相對豐度將發(fā)生變化，進而影響青貯飼料質量［22，27］。本試驗結果表明，苜蓿青貯OTU數(shù)、Chao指數(shù)隨LBP比例增加而增加，這意味著LBP可改變苜蓿青貯某些微生物豐富度。由于受LBP添加比例或附生微生物的影響，其對苜蓿青貯多樣性影響較小，或因青貯中某些附生微生物對厭氧和酸性條件適應性較差，構成苜蓿青貯發(fā)酵的穩(wěn)定微生物群落較為單一。通過Venn圖分析也得出不同處理間微生物組成較為單一的結論。研究表明苜蓿青貯微生物主要由厚壁菌門中乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬等組成［22］，本試驗也得出相似結論。產(chǎn)酸能力強的乳酸球菌（如腸球菌、乳球菌和類腸膜明串珠菌）通常為青貯發(fā)酵啟動菌，乳桿菌則為青貯穩(wěn)定期主要菌群［28］。本研究發(fā)現(xiàn)青貯發(fā)酵60 d后，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬為苜蓿青貯發(fā)酵的優(yōu)勢菌屬。張玲［29］研究認為殘次棗粉改變了苜蓿青貯微生物群落結構，提高了優(yōu)勢菌種乳桿菌屬、魏斯氏菌屬的相對豐富度，使青貯微生物多樣性趨于單一化。從青貯微生物相對豐度變化來看，LBP處理降低了苜蓿青貯中乳桿菌屬微生物的相對豐度，增加了魏斯氏菌屬和片球菌屬微生物的相對豐度，表明LBP通過改變苜蓿青貯的微生物相對豐度，從而進一步影響微生物的群落組成。片球菌屬的相對豐度較高時會產(chǎn)生更多乳酸［30］，進一步證實LBP可增加苜蓿青貯中乳酸含量，改善苜蓿青貯發(fā)酵品質。

4 結論

本研究表明，苜蓿青貯添加LBP后，pH值和氨態(tài)氮含量降低，多糖、乳酸含量及乳酸乙酸比提高。紫花苜蓿自然發(fā)酵主要菌群為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬，LBP降低了苜蓿青貯中乳桿菌屬相對豐度，增加了魏斯氏菌屬和片球菌屬相對豐度。苜蓿與LBP混合青貯有利于提高青貯發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性，并改變了微生物群落結構，綜合來看以60 g·kg-1添加量改善效果最佳。