踐踏脅迫下狗牙根草坪土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化特征

衛(wèi)宏健，丁杰，張巨明，楊文，王詠琪，劉天增

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

踐踏脅迫是草坪使用壽命的主要影響因素之一［1］，踐踏一方面直接造成草皮磨損，降低草坪葉片的光合作用導(dǎo)致草坪植株生長緩慢［2］，另一方面改變了土壤性質(zhì)，造成土壤緊實［3］，土壤中水分、養(yǎng)分和氧氣減少影響草坪根系生長［4］，間接影響草坪草發(fā)育，進(jìn)而降低草坪的坪用質(zhì)量［5］。

土壤真菌是指在土壤中生存的呈菌絲狀的多細(xì)胞或者單細(xì)胞的異養(yǎng)真核微生物，在土壤中形成了高度豐富的物種群落，在森林、草地等多種陸地生態(tài)系統(tǒng)中扮演著不可或缺的角色［6］，其群落結(jié)構(gòu)的改變對于生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)有著重要的指導(dǎo)意義［7］。土壤真菌作為土壤微生物的主要成分，參與了土壤有機(jī)物與無機(jī)物的相互轉(zhuǎn)化過程［8］，其群落結(jié)構(gòu)與多樣性在植物不同種類之間、同一植物的不同品種之間均存在差異［9］。錢秋平等［10］研究發(fā)現(xiàn)不同大豆（Glycine max）品種顯著影響了其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。真菌群落在不同草地間差異顯著，其結(jié)構(gòu)受到多種環(huán)境變量的影響，例如溫度［11］、土壤pH［12］和地上的植被群落［13］。踐踏作用直接影響地上草本植物的生長發(fā)育，姚玉嬌等［14］研究發(fā)現(xiàn)地上生物量的改變會對土壤微生物結(jié)構(gòu)造成影響。踐踏作用可以直接改變土壤孔隙結(jié)構(gòu)，從而改變土壤容重［15］、土壤硬度和緊實度［16］、通水透氣性等物理性狀指標(biāo)，引起土壤微生物數(shù)量和種類的變化［17］，同時踐踏會改變土壤養(yǎng)分組成進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［18］。國內(nèi)有部分研究通過模擬踐踏的方式來直接改變草地土壤的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響土壤微生物物種豐富度和多樣性［19-21］。土壤、土壤微生物和地上植被三者存在一定的聯(lián)系，因此研究踐踏脅迫下的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化對于草坪的生長和養(yǎng)護(hù)有著重要意義。

我國大多數(shù)運動場草坪常常處于過度踐踏使用狀態(tài)，其土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化對于草坪的生長養(yǎng)護(hù)和恢復(fù)有著重要的參考作用，然而目前鮮有關(guān)于南方草坪草踐踏條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征的研究和報道。狗牙根（Cynodon dactylon）作為我國南方應(yīng)用最廣泛的暖季型草坪草種之一，其成坪速度快、耐低修剪的同時也有著較強(qiáng)的恢復(fù)能力，是熱帶和亞熱帶足球場草坪建設(shè)的首選草種［22］，同時也是南方高爾夫球場的常用草種［23］。因此本試驗以2種在亞熱帶地區(qū)廣泛應(yīng)用的狗牙根品種草坪草作為研究對象，設(shè)置踐踏與不踐踏兩種試驗處理，研究踐踏脅迫下的狗牙根土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化，以揭示踐踏脅迫下狗牙根草坪土壤真菌多樣性的差異及變化規(guī)律，對于我國南方暖季型草坪草的種植和養(yǎng)護(hù)具有重要的科學(xué)價值和指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地，地處亞熱帶，土壤類型為壤土，有機(jī)質(zhì)、速效N、速效P、速效K含量分別為1.65%、12.25 mg·kg-1、49.08 mg·kg-1、142.02 mg·kg-1，土壤pH 6.61，全年降水量1786.8 mm，年均溫22.41℃，該試驗地氣候和土壤條件能符合暖季型草坪草正常生長的要求。

1.2 試驗設(shè)計

采用兩種狗牙根品種，分別是普通狗牙根和Tifgreen狗牙根（C.dactylon×C.transvaalensiscv.Tifgreen），以踐踏脅迫為主區(qū)因素，分為踐踏處理與不踐踏處理，以不同的狗牙根品種作為副區(qū)因素?？偣?個處理，普通狗牙根踐踏處理（Com-TS）、普通狗牙根不踐踏處理（Com-NT）、Tifgreen狗牙根踐踏處理（Tif-TS）和Tifgreen狗牙根不踐踏處理（Tif-NT）。每個處理3個重復(fù)，共12個小區(qū)，每個小區(qū)1.5 m×1.5 m，小區(qū)之間留0.5 m保護(hù)行，試驗地四周各留1 m空地。踐踏處理使用自主研制的模擬踐踏器［24］，每次6個往返，于2019年夏季開始試驗，每周一、周四進(jìn)行上述踐踏處理，試驗共進(jìn)行8周，踐踏強(qiáng)度為中等。土樣取樣方法采用5點取樣法，采集0～15 cm的土壤樣品，將同一小區(qū)采集的各土樣均勻混合后裝入無菌取樣袋中，得到12份土壤樣品，立即裝入帶有冰袋的泡沫箱并第一時間帶回實驗室，將土壤樣品均分為2份，1份進(jìn)行自然風(fēng)干，用于土壤pH的測定，另1份進(jìn)行土壤DNA提取，用于土壤真菌指標(biāo)的測定。

1.3 環(huán)境因子指標(biāo)測定

將由100個小格組成的50 cm×50 cm樣框隨機(jī)放在小區(qū)草坪上，目測草坪草在每格中所占的比例，統(tǒng)計后計算草坪草的蓋度，用百分?jǐn)?shù)表示。用自制的直徑長度為5 cm的圓柱形土鉆取樣器取15 cm深的草柱，裝入取樣袋后帶回實驗室。將地上部分和地下部分分離，用水沖洗干凈后放置于80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，測量并記錄樣品干重。草坪質(zhì)量依據(jù)美國NTEP草坪9分制評價方法［25］，每個試驗小區(qū)由3位有經(jīng)驗的評價員打分，取平均值。采用Clegg草坪表面硬度測定儀測定土壤表面硬度，重物錘重量為2.25 kg，每個試驗小區(qū)隨機(jī)選取3個測試點，結(jié)果取平均值。將土壤自然風(fēng)干，過1 mm的篩網(wǎng)，稱取5 g于小錐形瓶中，加入25 mL蒸餾水，用錫紙、橡皮筋封口，放置于搖床中，搖勻30 min，靜置，使用便攜式p H計測量其p H值，記錄。

1.4 土壤總DNA提取與基因擴(kuò)增

根據(jù)OMEGA土壤DNA提取試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司）說明書進(jìn)行基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，同時利用NanoDrop One檢測DNA的濃度和純度。PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳檢測則以基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的引物及PremixTaq（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Gene Tools Analysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對比后，按照等質(zhì)量原則計算各樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。

使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，用TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。后續(xù)建庫按照NEBNext?Ultra TMDNA Library Prep Kit for lllumina?標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，完成后于廣東美格基因公司以高通量測序平臺進(jìn)行Illumina MiSeq序列分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

將截去Barcode的原始數(shù)列進(jìn)行質(zhì)控處理，排除掉過短序列（length=200 bp）后，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。對高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接后移除序列不匹配數(shù)＞5 bp，比對相似度＜90%以及序列重疊數(shù)＜16 bp的序列后進(jìn)行去冗余處理，得到的非冗余序列進(jìn)行OTUS聚類（相似度97%以上），采用QIIME 1.9軟件對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類分析、物種分類學(xué)分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、冗余分析（redundancy analysis，RDA）、非度量多維尺度法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）及線性判別（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 踐踏對狗牙根草坪環(huán)境因子指標(biāo)的影響

Tifgreen狗牙根與普通狗牙根草坪在踐踏處理后其草坪質(zhì)量相較于非踐踏處理均顯著下降（P＜0.05），下降幅度分別為9.41%和15.73%，二者的草坪質(zhì)量均小于6.5分（圖1），處于基本可以接受的程度。非踐踏處理下的草坪蓋度均在85.00%以上，踐踏處理后Tifgreen狗牙根與普通狗牙根分別下降至74.33%和70.67%，均顯著低于非踐踏處理（P＜0.05）。兩種狗牙根草坪地上生物量和地下生物量踐踏處理后均顯著降低（P＜0.05），Tifgreen狗牙根與普通狗牙根地上生物量踐踏處理相較于非踐踏處理下降了31.25%和60.00%，而兩者地下生物量下降的幅度均大于地上生物量，分別下降了44.44%和77.78%。

圖1 踐踏脅迫下的環(huán)境因子指標(biāo)Fig.1 Indicators of environmental factors under traffic stress

Tifgreen狗牙根與普通狗牙根草坪的土壤pH在踐踏條件下顯著下降（P＜0.05），下降幅度分別為11.94%和18.18%，踐踏處理下的土壤pH范圍為5.4～5.9，偏酸性，而踐踏處理下的土壤表面硬度則顯著上升（P＜0.05），兩者的土壤表面硬度分別達(dá)到了128和188。

2.2 踐踏對狗牙根根際土壤真菌OTU水平分析

利用Illumina MiSeq測序平臺對12個樣品進(jìn)行高通量測序分析，得到76萬多條序列，每個樣品平均有63425條序列，樣品Tif-TS、Tif-NT、Com-TS、Com-NT真菌OTUs數(shù)分別為1189、1289、1171、1336，其中Com-NT的最高。根據(jù)樣品OTU得到的Venn圖（圖2）可知，4個樣品共同的真菌OTUs數(shù)共有716個，其中Tif-TS、Tif-NT、Com-TS、Com-NT分別存在21，36，18和33個特有的OTUs，踐踏處理降低了草坪土壤真菌OTU數(shù)目。

圖2 不同處理下的土壤真菌群落的OTUsFig.2 OTUs of soil fungal community under different treatment

2.3 踐踏對狗牙根土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對踐踏和非踐踏處理下的兩種狗牙根草坪草土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，共檢測到4個真菌門，其中子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）屬于優(yōu)勢菌門（圖3a），相對豐度之和占全部樣本總序列的88.32%。這2個優(yōu)勢菌門相對豐度之和在Tif-TS、Tif-NT、Com-TS、Com-NT中分別占總序列的86.98%、85.71%、88.85%、84.48%。普通狗牙根和Tifgreen狗牙根在踐踏條件下子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度均上升了，上升的幅度分別為93.94%和54.06%；同樣條件下，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）相對豐度在下降，下降的幅度分別為89.46%和57.82%，可以看出踐踏條件抑制了狗牙根土壤中擔(dān)子菌門的生長，同時對子囊菌門生長有促進(jìn)作用。普通狗牙根和Tifgreen狗牙根的土壤樣品中在屬水平選取相對豐度大于0.5%且排名前10的真菌群落（圖3b），可以看出在狗牙根土壤微生物中真菌共篩選出8個屬，主要為粗糙孔菌屬（Trechispora）、黑團(tuán)孢霉屬（Periconia）、彎孢霉屬（Curvularia）、籃狀菌屬（Talaromyces）、葡萄球菌屬（Staphylotrichum）、紅酵母菌屬（Rhodotorula），還有2種并未分類（unidentified）。其中粗糙孔菌屬在非踐踏處理的Tifgreen狗牙根與普通狗牙根中相對豐度最高，分別為30.51%和27.95%，均高于踐踏處理；而彎孢霉屬在踐踏處理的Tifgreen狗牙根與普通狗牙根中相對豐度更高，分別為9.60%和15.98%，均高于非踐踏處理。

圖3 真菌群落門水平（a）和屬水平（b）相對豐度的比較Fig.3 Differ ence in r elative abundance of fungal communities at phylum level（a）and genus level（b）

2.4 踐踏對狗牙根土壤真菌群落多樣性的影響

2.4.1Alpha多樣性分析 Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果（圖4）表明，4個處理樣品的真菌ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)的排序皆為Com-NT＞Tif-NT＞Tif-TS＞Com-TS。由此可見，Com-NT的土壤真菌群落多樣性最豐富，Com-TS處理的多樣性最低。Simpson指數(shù)的趨勢則有所不同，其由小到大排序為Tif-TS＜Tif-NT＜Com-NT＜Com-TS。Simpson指數(shù)越大，土壤真菌群落多樣性則越低。綜合以上4個指標(biāo)來看，在踐踏條件下，ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著低于非踐踏處理（P＜0.05），Simpson指數(shù)則出現(xiàn)了不同程度的變化，說明踐踏不僅顯著降低了狗牙根的土壤真菌物種數(shù)量，同時還會降低其多樣性。在物種的角度上看，正常生長情況下普通狗牙根ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均在不同程度上高于Tifgreen狗牙根，二者的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)則相差不大。在踐踏條件下結(jié)果則有所不同，Tif-TS的Simpson指數(shù)低于Com-TS，普通狗牙根的其他指數(shù)均是不同程度上低于Tifgreen狗牙根，對比非踐踏處理的土樣，普通狗牙根的土壤真菌群落各指數(shù)上升或者下降的幅度均較Tifgreen狗牙根的大，由此看出，踐踏脅迫對普通狗牙根土壤真菌群落影響更大。

圖4 踐踏脅迫下的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性指數(shù)Fig.4 Alpha diver sity index of soil fungal community structur e under tr affic stress

2.4.2Beta多樣性分析 NMDS分析（圖5）進(jìn)一步探究了踐踏以及不同狗牙根品種兩種因素對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，基于Bray-curtis距離，距離代表著土樣間的相似程度，兩者距離越近，相似程度越高，從NMDS圖譜發(fā)現(xiàn)，沿NMDS1軸方向，踐踏與不踐踏處理明顯分開；沿NMDS2軸方向，普通狗牙根和Tifgreen狗牙根品種間也有較明顯區(qū)別。其中踐踏對狗牙根土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，品種差異的影響較小。

圖5 踐踏脅迫下的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度分析Fig.5 Non-metric multidimensional scaling（NMDS）analysis of soil fungal community structure under traffic stress

2.4.3RDA分析 通過RDA分析來明確真菌群落多樣性與環(huán)境因子間的相互關(guān)系（圖6）。真菌群落RDA分析表明：第一排序軸解釋率為64.30%、第二排序軸解釋率為5.45%，累計解釋率達(dá)到69.75%，表明第一、二排序軸基本能夠反映出真菌群落多樣性和環(huán)境因子間的相互關(guān)系。箭頭代表環(huán)境因子，圓點代表了樣本。箭頭越長表示某一環(huán)境因子對真菌多樣性的影響越大，箭頭連線和排序軸夾角表示某一環(huán)境因子與排序軸相關(guān)性大小，夾角越小代表其相關(guān)性越高。其中，狗牙根根際土壤真菌群落多樣性與土壤表面硬度存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與土壤pH值、草坪蓋度、草坪綜合質(zhì)量、地下生物量存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），與地上生物量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

圖6 真菌群落與環(huán)境因子的RDA分析Fig.6 Redundancy analysis（RDA）for fungal community and environmental factors

2.5 踐踏條件下狗牙根土壤真菌的物種差異

分別將兩種狗牙根草坪踐踏與非踐踏處理的土壤微生物從門水平到屬水平上的LEfSe分析結(jié)果進(jìn)行比較，圖7均為大于設(shè)定的LDA值（LDA=4.2）條件下不同處理樣品中對比其他樣品差異顯著的真菌品種，柱狀圖的長度越長表示該物種的差異越明顯?？梢钥闯觯琓ifgreen狗牙根兩個處理間豐度具有顯著差異（P＜0.05）的土壤真菌類型總共18種，其中Tif-TS處理樣品的土壤真菌類型占13種，而Tif-NT處理樣品的土壤真菌類型占5種。普通狗牙根兩個處理間豐度具有顯著差異（P＜0.05）的真菌類型總共13種，Com-TS處理樣品的土壤真菌類型占7種，Com-NT處理樣品的土壤真菌類型占6種。Com-TS和Tif-TS處理的樣品土壤真菌物種相對豐度排名前5的都是子囊菌門（Ascoamycota）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）、彎孢霉屬（Curvularia）這5種真菌物種，而Com-NT和Tif-NT處理的樣品中豐度具有顯著差異（P＜0.05）的土壤真菌類型組成都包括了擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、糙孢孔目（Trechisporales）、刺孢菌科（Hydnodontaceae）、粗糙孔菌屬（Trechispora），成分十分接近。

圖7 不同狗牙根品種土壤真菌群落差異的LEfSe分析Fig.7 LDA effect size（LEfSe）analysis of soil fungi under the different bermudagrass cultivars

3 討論

子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是土壤真菌的兩大主要分支［26］，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)。Coleman-Derr等［27］發(fā)現(xiàn)地理位置差異對龍舌蘭（Agave americana）的土壤微生物結(jié)構(gòu)有顯著影響，其中真菌所受影響程度較其他土壤微生物更大，這與真菌自身的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。Treseder等［28］發(fā)現(xiàn)，子囊菌門和擔(dān)子菌門這兩個門類的真菌相比于其他門類的真菌，更喜歡低緯度和溫暖潮濕的環(huán)境。本次試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4個處理的土樣中，子囊菌門和擔(dān)子菌門均為僅有的兩種優(yōu)勢菌門，且這2個優(yōu)勢菌門的總相對豐度都大于土樣真菌總和的84%。而汪焱等［29］發(fā)現(xiàn)，在高寒地區(qū)不同地域燕麥（Avena sativa）根際土壤微生物多樣性除了子囊菌門和擔(dān)子菌門，還有壺菌門（Chytridiomyrota）、球囊菌門（Glomeromycota）等10多個優(yōu)勢菌門，也有研究發(fā)現(xiàn)我國東北地區(qū)土壤真菌主要優(yōu)勢菌門除了子囊菌門和擔(dān)子菌門，還有接合菌門（Zygomycota）和壺菌門等［30］，說明土壤真菌結(jié)構(gòu)與地理位置息息相關(guān)。子囊菌門和擔(dān)子菌門兩者之所以在熱帶及亞熱帶地區(qū)土壤中的含量遠(yuǎn)大于其他門類的真菌，是因為這兩種門類的真菌能夠產(chǎn)生規(guī)則的隔墊，其中心孔可以封閉以防止泄漏，從而可以改善干燥條件下的節(jié)水效果［31］，因而比其他門類的真菌更適合在高溫環(huán)境下生存。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)草地生態(tài)系統(tǒng)在不同強(qiáng)度的模擬踐踏條件下，土壤微生物數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的減少［32］，本試驗中兩種狗牙根品種的踐踏處理（中等踐踏強(qiáng)度）相比于不踐踏處理，土壤真菌多樣性均有所下降，與前人研究結(jié)果相似。自制模擬踐踏器在踐踏過程中通過改變土壤的緊實度、容重和其通氣透水性，從而影響草坪的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，而子囊菌門真菌的孢子相較于其他真菌具有較厚的細(xì)胞壁，具有對外界氣候等條件的輕微變化無顯著的響應(yīng)的特點［28］，因此在土壤真菌群落的正常演替過程中，子囊菌門在真菌中占主導(dǎo)地位，多數(shù)的生態(tài)系統(tǒng)凋落物或者殘留物都要靠子囊菌門類真菌分解。而對于凋落物中難以分解的木質(zhì)素和纖維素，子囊菌門對這類凋落物的分解能力有限［33］，擔(dān)子菌門是分解這類物質(zhì)的主要力量［34］，因此擔(dān)子菌門類的真菌在木質(zhì)素含量高的凋落物中扮演著不可或缺的角色，尤其是森林生態(tài)系統(tǒng)［35］。然而草地生態(tài)系統(tǒng)與森林生態(tài)系統(tǒng)不一樣，其凋落物的木質(zhì)素和纖維素含量較低，因此子囊菌門類真菌在這類凋落物的分解中始終處于主導(dǎo)地位［35］，本試驗的LEfSe分析結(jié)果也與之相對應(yīng)。狗牙根葉子與其根系較細(xì)，木質(zhì)素和纖維素含量較低［36-37］，踐踏處理下其葉片和根系都會受到不同程度的損傷，成為凋落物，隨著分解的進(jìn)行，子囊菌門類的真菌始終是主要驅(qū)動力，其相對豐度在踐踏條件下有明顯的上升，因此子囊菌門可以作為草坪耐踐踏脅迫的真菌指示菌種之一。

Alpha多樣性描述的是單個樣品中土壤真菌種類的豐度和多樣性［38］。本研究Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)Com-NT土樣的真菌群落豐度最高，Tif-TS多樣性最為豐富，在踐踏條件下ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著低于未踐踏處理，同時Shannon指數(shù)也出現(xiàn)了不同程度的降低，說明踐踏不僅顯著降低了狗牙根的土壤真菌物種數(shù)量，同時還會降低其多樣性。而Beta多樣性則是描述不同樣品間土壤真菌群落之間的結(jié)構(gòu)差異［39］，在這個層面上，本研究結(jié)果表明，物種、踐踏這兩因素都對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且踐踏的影響程度更大。Zhang等［13］發(fā)現(xiàn)地上植被物種可能會限制某些土壤微生物群落的發(fā)展和種群組成，本試驗中，普通狗牙根與Tifgreen狗牙根兩個品種間的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)本身是有所差異的。土壤作為草地植物的重要載體，其物理性質(zhì)的變化在踐踏作用下尤為明顯［40］。在自制模擬踐踏器踐踏條件下，土壤越緊實，容重相對應(yīng)的也在增加，同時也降低了呼吸作用［41］，踐踏導(dǎo)致草地的地下生物量下降，根系的呼吸作用越來越弱［42］，以上因素均影響了土壤微生物的生活環(huán)境，導(dǎo)致在踐踏條件下狗牙根的土壤真菌豐富度與多樣性均下降。在中等強(qiáng)度的踐踏條件下，Tifgreen狗牙根的耐踐踏性要高于普通狗牙根，且地下生物量顯著高于普通狗牙根，導(dǎo)致普通狗牙根根系呼吸強(qiáng)度遠(yuǎn)低于Tifgreen狗牙根，這很大程度上是普通狗牙根土壤真菌豐富度與多樣性下降幅度遠(yuǎn)大于Tifgreen狗牙根的重要因素。LEfSe結(jié)果表明，踐踏與非踐踏相比，不同組之間有相當(dāng)一部分土壤真菌類型豐度差異顯著，很大原因是踐踏改變了土壤原本的養(yǎng)分組成和物理結(jié)構(gòu)，造成原有的土壤真菌多樣性下降，同時也為其他微生物種群提供了新的生長環(huán)境［43］。

草坪地上與地下部分在踐踏作用下的反饋是貫穿草坪生態(tài)系統(tǒng)的重要紐帶，地上植被的生長與土壤有機(jī)質(zhì)含量息息相關(guān)，踐踏導(dǎo)致草地生產(chǎn)力下降，土壤有機(jī)質(zhì)來源減少，養(yǎng)分含量的下降限制了部分土壤真菌的生存［44］。本試驗中，草坪草的地上、地下生物量分別與土壤真菌多樣性呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，踐踏直接對草坪地上部分造成撕拉和摩擦，地下部分因踐踏造成的土壤緊實導(dǎo)致生長空間被壓縮，草坪地上、地下生物量大幅度下降，導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)大量減少，同時踐踏對草坪草地上部分的磨損傷害致使其一部分內(nèi)容物外滲，流入土壤，影響土壤真菌的生長，但具體的影響作用有待研究。而趙文等［45］在三江源區(qū)退化高寒草甸的研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)，土壤真菌群落多樣性與地下生物量呈顯著負(fù)相關(guān)，可能是由草品種、植被類型不一致導(dǎo)致的。p H能夠影響真菌的呼吸作用和分解物質(zhì)的速率，是影響土壤微生物群落的最重要因素之一［46］，本試驗中，土壤p H與真菌群落多樣性呈顯著正相關(guān)，原因可能是踐踏處理降低了狗牙根草坪pH，影響了土壤真菌的呼吸和分解作用并導(dǎo)致其群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在全球尺度上，環(huán)境因子對土壤真菌豐富度和群落組成產(chǎn)生較大影響［47］，王玉琴等［48］的研究結(jié)果顯示，土壤環(huán)境因子在不同草地間均表現(xiàn)出顯著差異，同時，土壤養(yǎng)分、土壤的顆粒大小以及氣候、施肥等都是影響土壤真菌群落多樣性的主要因素［49-51］。各環(huán)境因素對土壤真菌及微生物的影響相當(dāng)復(fù)雜，目前對生物因素及生物與非生物因子之間復(fù)雜的相互作用對土壤微生物結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用研究不深，因此還需要長期的深入研究。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，踐踏處理下兩種狗牙根草坪環(huán)境因子指標(biāo)相較于非踐踏處理均存在顯著差異。在門水平上，4個處理的優(yōu)勢菌門保持一致，均是子囊菌門和擔(dān)子菌門，其在土壤真菌群落組成中相對豐度較高。子囊菌門的相對豐度在踐踏條件下有明顯的上升，可以作為草坪耐踐踏脅迫的真菌指示菌種之一。多樣性分析表明踐踏處理一定程度上改變了狗牙根的根際土壤真菌豐富度和物種多樣性，且踐踏與品種差異均與狗牙根土壤真菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其中踐踏因素的影響較大。多種環(huán)境因子對真菌群落的多樣性具有顯著影響，其中的主要影響因素是地上生物量、地下生物量以及土壤pH。