甜菜組蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族鑒定及功能預(yù)測

王琳玉，蔣依辰，于清洋，吳則東，邳 植

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080）

0 引言

組蛋白乙?；揎椬鳛楸憩F(xiàn)遺傳調(diào)控的重要機制之一，參與了植物生長、發(fā)育和脅迫響應(yīng)等過程[1]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDACs)可通過改變組蛋白電荷屬性促進或抑制基因表達(dá)[2]，從而催化可逆的組蛋白乙?；揎?。在植物研究中，組蛋白乙?；揎椗c植物成花轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。在擬南芥中，AtMSI1介導(dǎo)的H3K9ac能夠調(diào)控開花整合基因AtSOC1的表達(dá)，從而決定開花抽薹[3]。AtMSI1能夠與組蛋白去乙?；窤tHDAC6相互作用，參與H3K9的去乙酰修飾[4]。AtMSI4（又稱AtFVE1）參與CORs和CBFs等基因?qū)Φ蜏氐膽?yīng)答[5]。同時，能夠識別AtFLC組蛋白H4，通過去乙?；揎椪{(diào)控AtFLC轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控春化途徑[6]。fve突變體內(nèi)組蛋白乙?；揎椝斤@著升高，具有明顯的晚花表型。相反，在擬南芥aldh3f1突變體組蛋白H3乙?；揎椝斤@著降低，低水平的H3K9Ac顯著抑制AtFLC基因表達(dá)，導(dǎo)致突變體表現(xiàn)出明顯的早花現(xiàn)象[7]。

真核生物HDAC家族包含RPD3/HDA1、SIR2、HD2三個亞家族[8]。RPD3/HDA1亞家族是一類Zn+依賴型HDAC，催化中心由2個Asp、2個His和1個Tyr組成。該亞家族成員數(shù)目最多且保守性較高。SIR2亞家族成員是一類NAD+依賴型HDAC，具有一個保守的SIR2domain，但在N-和C-末端序列差異較大[9]。在生物和細(xì)菌中一般含有1-2個SIR2基因，在真核生物中通常具有多個SIR2基因，例如人類中包含7個SIR基因、擬南芥中包含2個SIR基因。HD2亞家族是植物特有的一類HDAC，該家族成員在N-末端通常具有一個保守的MEFW序列和100個氨基酸左右的催化domain，該區(qū)域蛋白序列與the nucleoplasmin-like domain(NPL)具有較高的相似度。對擬南芥HDTs進行基因敲除發(fā)現(xiàn)，HD2亞家族成員廣泛參與成花轉(zhuǎn)變和種子發(fā)育等形態(tài)建成[10]。

甜菜(Beta vulgarisL.)莧科二年生草本植物，作為主要糖料作物提供全球20% ～30%的糖產(chǎn)量[11]。低溫引起的春化作用是決定甜菜生長期的重要因素，影響甜菜塊根的產(chǎn)量和含糖率[12]。前人研究已經(jīng)成功從甜菜基因組中克隆了BvBTC1、BvFT1、BvFT2等多個春化相關(guān)基因，初步解析了一年生和二年生甜菜春化的分子機制[13]。目前，擬南芥和冬小麥等作物中的研究表明，組蛋白乙?；揎椀缺碛^遺傳調(diào)控是植物記憶冬季低溫和劑量春化時間的重要方式[14]。那么甜菜基因組中有哪些HDACs成員？其中哪些成員可能參與調(diào)控甜菜的春化作用？因此，研究BvHDACs基因家族成員在甜菜春化中的作用是非常有必要的。

本研究以HDAC特征domain和擬南芥HDAC蛋白序列為起始，通過HMMsearch和BLAST在甜菜基因組中對HDAC家族成員進行分析[15]。利用HMMER、iqtree、TBtools等 生 物 信 息 學(xué) 工 具 對BvHDACs基因家族成員基因結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、染色體分布、春化過程表達(dá)模式進行分析，為解析BvHDACs基因家族成員在甜菜春化作用中的功能提供必要信息。

1 材料與方法

1.1 BvHDACs基因家族的鑒定

首先，分別從NCBI、Phytozome和甜菜數(shù)據(jù)庫(http://bvseq.molgen.mpg.de)下載人類、小鼠、果蠅、擬南芥、水稻、大豆、甜菜蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。以E-value＜1E-10和score＞50為閾值，利用HMMsearch程序在人類、小鼠、果蠅、擬南芥、水稻、大豆、甜菜蛋白質(zhì)組中檢索含有Hist_deacetyl(PF00850)或SIR2(PF02146)功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，分別鑒定為RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員。由于目前沒有HD2亞家族的HMM模型，采用Blastp和HMMscan相結(jié)合的方式篩選HD2亞家族成員。以擬南芥AtHDT1-4蛋白序列檢索各物種中E-value＜1E-5且 score＞50的同源序列。隨后，通過HMMscan篩選N-末端僅含有NPL domain(PF17800)的蛋白質(zhì)，鑒定可能是HD2亞家族成員。

1.2 HDAC基因家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用Cluster Omega對篩選出的RPD3/HDA1、SIR2和HD2亞家族成員進行序列比對，所有參數(shù)采用默認(rèn)值[16]。選擇乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?AtLPXCA1)作為外類群，利用iqtree采用最大似然樹法構(gòu)建進化樹。根據(jù)ModelFinder計算結(jié)果，選擇VT+I+G4為最優(yōu)模型，Bootstrap設(shè)置為1000。最后，使用EvolView工具對HDAC家族成員進化樹進行可視化[17]。

1.3 BvHDACs家族成員基因特征的分析

利用TBtools軟件從甜菜基因組gff文件中提取HDAC基因家族成員基因組定位、外顯子和內(nèi)含子位置信息，并繪制的染色體定位圖譜。通過Expasy計算HDAC基因家族成員編碼蛋白分子量和等電點，蛋白功能結(jié)構(gòu)域信息通過HMMscan進行檢索。

1.4 轉(zhuǎn)錄組分析BvHDACs家族成員表達(dá)模式

將KWS9147甜菜種子播種在方形花盆(12 cm×12 cm×10 cm)，在溫度24±2℃，光照強度200 μmol/(m2·s)和16 h/8 h光周期的溫室中進行培養(yǎng)。待播種后24天，將甜菜幼苗轉(zhuǎn)移到4±2℃，200 μmol/(m2·s)光強和16 h/8 h光周期的冷窖中進行春化處理。在春化0、2、6、10、14周后將不同程度春化幼苗移入溫室繼續(xù)進行培養(yǎng)，測定各處理甜菜幼苗抽薹率。同時，剪取甜菜幼葉，提取RNA建庫并進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析春化過程中甜菜HDAC基因家族成員表達(dá)模式。

1.5 BvHDACs家族成員蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

運用STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫在線分析BvHDACs家族蛋白互作關(guān)系，分別篩選出與蛋白界面兩個表面結(jié)構(gòu)相似的蛋白對，通過SEARCH得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再從STRING中導(dǎo)出蛋白互作關(guān)系結(jié)果（參數(shù)為物理互作類型且score＞0.4）。最后，使用cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvHDACs家族成員蛋白理化性質(zhì)

16個BvHDACs家族成員的氨基酸長度、分子量大小和等電點都存在較大差異。表1可知，RPD3/HDA1亞家族成員通常氨基酸長度在350 aa ～500 aa，蛋白分子量在40 kDa ～70 kDa，蛋白質(zhì)等電點在5.0 ～6.5之間。BvHDAC3與其他成員理化性質(zhì)差異較大，該基因編碼蛋白氨基酸序列較短，僅124 aa，分子量13.5 kDa，等電點為8.49。3個HD2亞家族成員蛋白質(zhì)長度均為290 aa左右，分子量在31k ～32 kDa，蛋白質(zhì)等電點在4.6 ～4.7之間。SIR2亞家族成員中BvSIRT1-3具有相似的理化性質(zhì)，氨基酸長度在43k ～56 kDa，分子量在43k ～55 kDa，等電點均大于7。BvSIRT4蛋白長度和分子量均小于其他SIR2成員，等電點為6.04。根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測，16個BvHDACs中有8個基因編碼蛋白具有明確的核定位信號。在人類HDACs中，II和IV類HDAC可能同時位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與BvHDAC2、BvHDAC5、BvHDAC7、BvHDAC8被預(yù)測定位于細(xì)胞質(zhì)中相符。此外，這些HDAC可能與其他蛋白形成復(fù)合體從而進入細(xì)胞核。

2.2 HDAC基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

通過HMMsearch和Blastp方法在甜菜基因組內(nèi)共檢索HDAC家族成員16個。圖1可知其中，9個基因?qū)儆赗PD3/HDA1亞家族，SIR2亞家族共有4個甜菜基因，HD2亞家族成員共有3個。為了進一步了解甜菜HDAC家族成員的分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分別從挑取不同動物（人類、小鼠）、昆蟲（果蠅）、植物（擬南芥、水稻、大豆）HDAC家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，部分BvHDACs與HsHDACs具有較近的親緣關(guān)系(BvHDAC3、BvSIRT4)，但是大部分甜菜HDACs與植物HDACs構(gòu)成單獨分枝，暗示HDACs在動植物中獨立進化參與不同的生物學(xué)過程。RPD3/HDA1亞家族成員最多，根據(jù)Milazzo等研究結(jié)果，該亞家族包括3個組（Class I ～III）。BvHDAC1、BvHDAC3、BvHDAC6、BvHDAC8-9與HsHDAC1-3、HsHDAC8共同歸屬于Class I。其中，BvHDAC3與HsHDAC3親緣關(guān)系較近，BvHDAC1和BvHDAC6則與其他植物HDACs組成單獨一支。Class II包含多個獨立分枝且動植物基因成員之間具有較大差異，BvHDAC4、BvHDAC5、BvHDAC7則分別位于植物特有的亞枝。Class III基因數(shù)目最少，僅有BvHDAC2歸屬于該組。SIR2亞家族中包括3個大枝，其中BvSIRT1和BvSIRT3與HsSIRT1、AtSRT1具有較高相似性。BvSIRT2、BvSIRT4則與HsSIRT4、HsSIRT5、AtSIRT2位于同一分枝。HD2為植物特有的HDAC亞家族，BvHDT1和BvHDT2與AtHDT1、AtHDT2和AtHDT4親緣關(guān)系較近。而BvHDT3與單子葉植物HDTs位于同一分枝。

2.3 BvHDACs染色體定位分析

利用TBtools軟件預(yù)測了候選的HDACs基因在染色體上的分布情況。在甜菜中，BvHDACs基因家族成員它們不均勻的分布在染色體上的見圖2。其中，BvHDAC9位于Chr-2，但并沒有明確掛載染色體中的具體位置。在Chr-4染色體上分布2個基因，分別為BvSIRT2和BvSIRT1定位到染色體的中上端的下末端。在Chr-5染色體上分布有3個基因，其中BvHDAC7和BvHDAC5并未定位到染色體的具體位置。BvHDAC6則定位到了染色體Chr-5的下端。在Chr-6染色體上端分布有1個基因(BvHDAC4)。在Chr-7染色體上分布有2個基因BvHDT3和BvHDAC8，分別定位染色體的上端與下端。在Chr-9染色體上分布有3個基因，其中BvHDT1和BvHDT2在染色體中距離較近，可能由于串聯(lián)重復(fù)事件產(chǎn)生。

圖2 BvHDACs基因染色體定位

2.4 BvHDACs家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

為了更加詳細(xì)的了解甜菜HDAC家族成員特征，對BvHDACs外顯子和內(nèi)含子分布情況及蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進行分析見圖3。結(jié)構(gòu)表明，甜菜HDAC家族成員通常含有7 ～16個外顯子。BvHDAC3、BvHDAC8和BvSIRT4含有較少的外顯子，分別為4個、3個和1個。其中，BvHDT1和BvHDT2不僅在染色體中的位置相鄰，同時外顯子和內(nèi)含子分布相同，說明這2個基因為串聯(lián)重復(fù)基因。蛋白結(jié)構(gòu)域方面，各HDAC亞家族內(nèi)成員間domain分布具有較高的相似性。RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員分別僅含有hist_deacetyl和SIR2功能結(jié)構(gòu)域。HD2家族成員均在N末端含有一個NPL domain。

圖3 BvHDACs家族成員進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

2.5 BvHDACs家族成員在春化過程中的表達(dá)模式

春化處理后甜菜生長受到明顯抑制，但不會導(dǎo)致甜菜幼苗死亡。春化處理2周和6周后甜菜春化時間不充足，在后續(xù)長日照室溫條件下培養(yǎng)并不發(fā)生抽薹開花現(xiàn)象。約有67%的甜菜幼苗在春化10周后能夠抽薹開花。春化14周后，幾乎所有幼苗(96%)在后續(xù)長日照室溫培養(yǎng)中抽薹開花。通過檢測不同春化時間甜菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)（圖4），RPD3/HDA1亞家族成員在低溫處理后均出現(xiàn)上調(diào)變化。其中，BvHDAC1、BvHDAC2、BvHDAC5、BvHDAC6變化程度達(dá)到顯著水平。SIR2亞家族成員中僅有BvSIRT1在春化過程中顯著上調(diào)。值得注意的是，BvHDT1和BvHDT2在春化6 ～10周后顯著下調(diào)，基因表達(dá)量與春化后抽薹率的spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.824和-0.813。這暗示BvHDT1和BvHDT2可能與甜菜劑量春化時間相關(guān)。

圖4 BvHDACs基因家族在不同低溫脅迫下的基因表達(dá)

2.6 BvHDACs基因家族蛋白互作分析

通過檢索STRING數(shù)據(jù)庫，共發(fā)現(xiàn)10個蛋白主要與RPD3/HAD亞家族成員具有蛋白互作關(guān)系（圖5）。這些蛋白包括5個組蛋白結(jié)合蛋白（BvSYD、BvHMGB15、BvSIN3A、BvNCOR1和BvRB）、4個組蛋白修飾酶（BvJMJ11、BvJMJ12、BvHDAT3和BvFLD）和1個DNA甲基化酶（BvDMT）。其中，BvFLD、BvJMJ11和BvJMJ12在擬南芥中的同源基因參與春化和成花轉(zhuǎn)變過程[19-20]。BvJMJ11和BvJMJ12與BvHDAC1-9、BvSIN3A、BvNCOR1、BvRB具有構(gòu)成蛋白復(fù)合體的潛力。BvFLD則與BvHDAC5和BvHDAC6具有蛋白互作關(guān)系。此外，HD2家族成員可能與BvHDAC6具有蛋白互作關(guān)系，而SIR2亞家族成員與哪些蛋白存在互作關(guān)系仍未可知。

圖5 BvHDACs家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論與結(jié)論

組蛋白去乙?；?HDACs)是調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的關(guān)鍵表觀遺傳因子，在植物生長、發(fā)育和對冬性植物的春化機制反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。截至目前為止，前人已對擬南芥[4]、玉米[22]和水稻[23]等植物HDAC基因家族進行了功能分析。本研究通過生物信息學(xué)手段從甜菜基因組中共鑒定16個BvHDACs成員，利用進化樹分析BvHDAC與其他物種HDACs的親緣關(guān)系，基于春化過程表達(dá)模式和互作蛋白關(guān)系分析哪些BvHDACs可能參與甜菜春化作用。

系統(tǒng)發(fā)育樹將16個BvHDACs分為3個亞家族，即RPD3/HDA1、SIR2、HD2。甜菜RPD3/HDA1家族Class I和IV、SIR2家族成員與人類HDACs具有一定的同源性。推測，丙戊酸、苯甲酰胺類等人類Class I和Class IV HDAC抑制劑可能在植物中同樣具有抑制作用[24]。此外，煙酰胺也同樣對植物SIRT家族成員產(chǎn)生酶活性抑制作用[25]。植物Class II成員與其他成員分別位于不同亞枝，暗示其植物與動物Class II成員蛋白特性和功能可能存在一定差異。同時，HD2家族是植物特有的HDAC，BvHDT1和BvHDT2與AtHDT4、AtHDT1和AtHDT2親緣關(guān)系較近，BvHDT3則與單子葉植物HDT具有較高的同源性。甜菜BvHDACs與人類、擬南芥HDACs的親緣關(guān)系將有助于判斷組蛋白抑制劑可能對哪些BvHDACs具有抑制作用，為今后挑選特定組蛋白抑制劑開展甜菜春化作用機制研究提供基礎(chǔ)信息。

AtHDACs能夠與AtMSI1和AtMSI4形成復(fù)合體，調(diào)控組蛋白乙酰化修飾從而影響AtSOC1和AtFLC的轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)對擬南芥成花轉(zhuǎn)變的調(diào)控[26]。通過對擬南芥RPD3/HDA1亞家族成員進行沉默可以導(dǎo)致擬南芥晚花表型[27]。與擬南芥不同，筆者發(fā)現(xiàn)HD2家族成員BvHDT1和BvHDT2在春化過程中表達(dá)模式變化與抽薹率變化顯著相關(guān)，暗示其與參與甜菜春化時間劑量。此外，STRING分析表明BvHDT1和BvHDT2與BvHDAC6相互作用，可能與BvFLD、BvJMJ11和BvJMJ12形成蛋白復(fù)合體。在擬南芥中，AtJMJ11（又稱AtELF6）和AtJMJ12（又稱AtREF6）與植物抽薹開花密切相關(guān)，分別參與H3K4和H3K27甲基化修飾，調(diào)控開花整合基因AtFT和AtSOC1的表達(dá)[20]。AtFLD能夠調(diào)節(jié)H3K4的甲基化水平，參與AtFLC的表達(dá)[19]。這些結(jié)果表明BvHDT1和BvHDT2催化蛋白乙?；揎椏赡芘c甲基化修飾協(xié)同或拮抗決定甜菜抽薹開花。

綜上，本研究通過分析BvHDACs春化過程中的表達(dá)模式與蛋白互作關(guān)系發(fā)現(xiàn)甜菜HD2家族成員BvHDT1和BvHDT2可能與甜菜春化作用密切相關(guān)。根據(jù)染色體位置和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)BvHDT1和BvHDT2可能由單一基因串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生并與AtHDT1和AtHDT2直系同源。目前，暫未有HD2家族組蛋白抑制劑的相關(guān)報道。但是，有研究表明甜菜孢囊線蟲的32E03效應(yīng)蛋白可以抑制AtHDT1的活性[28]。今后可通過外源注射或轉(zhuǎn)化32E03效應(yīng)蛋白進一步驗證或分析BvHDT1和BvHDT2如何參與甜菜春化作用。