黃芪多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活化及其吞噬功能的影響

羅晶晶，王旭溟，計(jì)堅(jiān)，瞿浩，羅成龍，鄒嫻，舒鼎銘，王劼

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

黃芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS）是一種從黃芪中提取的植物多糖，具有抑菌、抗病毒、抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)活性，因其資源豐富、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)而逐漸受到關(guān)注并應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。APS 可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對(duì)H9N2 禽流感、口蹄疫、新城疫和傳染性法氏囊等多種疫病的抗病能力，顯著增加畜禽的T 淋巴細(xì)胞增殖，并增加抗體水平；還可以減輕脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的雞和仔豬免疫應(yīng)激反應(yīng)。由此可見，APS 在畜牧生產(chǎn)中具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景，但APS 的免疫作用機(jī)制尚未明確。

巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，它對(duì)細(xì)胞殘片、病原體以及抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行噬菌作用（吞噬和消化），并作為抗原呈遞細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APCs）?；罨木奘杉?xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體II（Major Histocompatibility Complex Class II，MHC-II）類分子、協(xié)調(diào)刺激分子CD80、CD86 等，在存在抗原依賴性炎癥反應(yīng)的情況下誘導(dǎo)有效的T 細(xì)胞反應(yīng)，在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活過程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)通過研究體外APS 對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性、活化和吞噬功能的影響，以進(jìn)一步加深A(yù)PS 對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，為其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 APS（純度>99%，國(guó)內(nèi)某生物股份有限公司）。完全培養(yǎng)基（DMEM）高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、青鏈霉素（上海生工生物有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）。6 孔板、96孔板（美國(guó)Thermo 公司）。CCK-8 試劑盒（杭州四清生物工程材料有限公司），抗小鼠CD80-FITC 抗體、抗小鼠CD86 Percp-cy-5.5 抗體、抗小鼠MHC-II PE 抗體（美國(guó)eBioscience 公司）。FITC-dextren（1 mg/mL，分子量40 000，美國(guó)Sigma 公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó)），低溫高速離心機(jī)（Thermo Fisher，美國(guó)），超凈工作臺(tái)702038（蘇凈安泰 SW-J-1FD），F(xiàn)ACS calibur 流式細(xì)胞儀（Becton-Dickinson，美國(guó)），酶聯(lián)檢測(cè)儀（Thermo Fisher，美國(guó)）。

1.2 APS 懸液制備 用電子天平精確稱取5 mg APS，用5 mL 無菌PBS 配成濃度為1 000 μg/mL 的懸浮液，在超凈臺(tái)內(nèi)用0.22 μm 孔徑的濾膜過濾以除去試劑中的細(xì)菌，再用1.5 mL 離心管分裝后，置于4℃冰箱中保存。使用時(shí)，用完全培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基、1%青霉素/鏈霉素、10% 胎牛血清配成不同濃度（0.1、1、10、50、100 μg/mL）的APS 懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1% 鏈霉素/青霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置37℃、飽和濕度、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d 傳代1 次。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 CCK-8 在細(xì)胞脫氫酶的作用下生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此用其表示細(xì)胞增殖活性。嚴(yán)格按照CCK-8 試劑盒說明書操作，將100 μL 初始濃度約為1×10個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液接種至96 孔板，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：以DMEM（含10% 胎牛血清，1% 青鏈霉素雙抗）為培養(yǎng)基的，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO、95%空氣。等到細(xì)胞完全粘附后，吸出上清液，分別添加100 μL 不同濃度的APS（0.1、1、10、50、100 μg/mL，對(duì)照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基于同一平板樣品孔中（每個(gè)處理組設(shè)8個(gè)復(fù)孔）培養(yǎng)12h；培養(yǎng)結(jié)束后，每處理孔加入10 μL CCK-8 溶液后，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h。1 h 后取出96 孔板并使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)每孔的光密度（在加入CCK-8 溶液后，所有操作均避光）。以對(duì)照組OD 值調(diào)零，巨噬細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：巨噬細(xì)胞增殖率=（As-Ac）/Ac ×100%，其中As 為實(shí)驗(yàn)組 OD值，Ac 為空白對(duì)照組 OD 值。

1.5 APS 對(duì)巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響

1.5.1 CD80 分子的表達(dá)檢測(cè) 巨噬細(xì)胞的CD80 分子的表達(dá)水平利用FITC 陽性細(xì)胞的百分比來表示。將細(xì)胞以5×10個(gè)/mL 接種于6 孔培養(yǎng)板中，用不同濃度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，對(duì)照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，洗脫收集細(xì)胞，將細(xì)胞與抗小鼠CD80-FITC 的抗體在冰上孵育30min 后，再用PBS 液洗滌兩次以去除多余抗體，然后在FACS calibur 流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5.2 CD86 分子的表達(dá)檢測(cè) 巨噬細(xì)胞的CD86 分子的表達(dá)水平利用Percp-cy-5.5 陽性細(xì)胞的百分比來表示。將細(xì)胞以5×10個(gè)/mL 接種在6 孔培養(yǎng)板中，用不同濃度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，對(duì)照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，洗脫收集細(xì)胞，為檢測(cè)CD80 的細(xì)胞表面表達(dá)，將細(xì)胞與抗小鼠CD86 Percp-cy-5.5 抗體在冰上孵育30 min 后，再用PBS 洗滌2 次以去除多余抗體，然后在FACS calibur 流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5.3 MHC-II 分子的表達(dá)檢測(cè) MHC-II 分子表達(dá)水平采用PE 陽性細(xì)胞的百分比來表示。將細(xì)胞以5×10個(gè)/mL接種于6 孔培養(yǎng)板中，用不同濃度APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100 μg/mL，對(duì)照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，洗脫收集細(xì)胞，將細(xì)胞與抗小鼠MHC-II PE 抗體在冰上孵育30 h，再用PBS 洗滌2 次以去除多余抗體，然后在FACS calibur 流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。

1.6 APS 對(duì)細(xì)胞吞噬活性的影響 巨噬細(xì)胞對(duì)FITCdextren 的攝取量反映其吞噬活性，其吞噬率由FITC陽性細(xì)胞的百分比表示，其吞噬能力由細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。通過流式細(xì)胞術(shù)定量，用FITC-dextren 陽性細(xì)胞的百分比來表示巨噬細(xì)胞的吞噬率，F(xiàn)ITC-dextren 陽性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（Mean Fluorescence Intensity，MFI) 則表示單個(gè)巨噬細(xì)胞細(xì)胞的吞噬能力。細(xì)胞以5×10個(gè)/mL 的濃度接種在12 孔培養(yǎng)板中，并用不同濃度的APS（0.1、1、10、50 μg/mL 和100μg/mL，對(duì)照組為0μg/mL）培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中孵育12 h，然后在FITCdextren 存在下孵育30 min。溫育后，將細(xì)胞在PBS中洗滌2 次以除去過量的FITC-dextren，洗脫收集細(xì)胞。FITC-dextren 陽性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度通過FACS calibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用Flowjo V10 分析來自FACS calibur流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并且采用SPASS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 APS 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組相比，低濃度的APS（0.1、1 和10 μg/mL）對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖無顯著影響，而高濃度的APS（50 和100 μg/mL）可提高巨噬細(xì)胞增殖能力（<0.001）。

圖1 不同濃度的APS 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 APS 對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組相比，50 μg/mL 以上的APS 能促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD80 分子的表達(dá)（<0.001）。如圖3 所示，與對(duì)照組相比，APS濃度達(dá)到100 μg/mL 能促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD86 分子的表達(dá)（<0.05)。如圖4 所示，與對(duì)照組相比，高濃度APS（50 μg/mL 和100 μg/mL）處理能促進(jìn)MHC-II 分子表達(dá)（<0.001）。由此表明添加高濃度APS（50 μg/mL 和100 μg/mL）可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力。

圖2 不同濃度APS 對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)CD80 分子的影響

圖3 不同濃度APS 對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)CD86 分子的影響

圖4 不同濃度APS 對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)MHC-II 分子的影響

2.3 APS 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響 如圖5 所示，APS 對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力具有一定的促進(jìn)作用，50 μg/mL 的APS 能夠提高巨噬細(xì)胞吞噬能力（<0.05），100 μg/mLAPS 對(duì)其吞噬能力有提高作用（<0.001）。如圖6 所示，與對(duì)照相比，APS 濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬率增加（<0.05）。

圖5 不同濃度APS 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

圖6 不同濃度APS 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

3 討 論

巨噬細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)非常重要，它在體內(nèi)發(fā)揮監(jiān)視、防御、抗原呈遞、調(diào)節(jié)以及清除凋亡細(xì)胞等功能，是機(jī)體免疫防御的第一道防線。巨噬細(xì)胞的激活是放大對(duì)病原體或其他應(yīng)激源的先天免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵步驟，可以通過測(cè)定體外巨噬細(xì)胞的增殖活性來評(píng)估巨噬細(xì)胞是否被激活。本試驗(yàn)參考其他多糖調(diào)節(jié)免疫活性的文獻(xiàn)，設(shè)置不同濃度（0～100 μg/mL）的APS 以研究其對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞增殖活性隨著APS 濃度（0.1～100 μg/mL）增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，其中50、100 μg/mL 的APS 能夠顯著提高巨噬細(xì)胞的增殖活性，表明一定濃度的APS 可以通過激活巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答。

MHC-II、CD80 和CD86 是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志分子。巨噬細(xì)胞吞噬抗原產(chǎn)生的多肽片段與MHC-II 結(jié)合被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，然后與CD4 輔助T 細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)抗原特異性的T 細(xì)胞活化、增殖、產(chǎn)生免疫記憶，并刺激多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌。當(dāng)巨噬細(xì)胞受抗原刺激活化后，共刺激分子CD80/86 開始高表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)激活T 細(xì)胞的作用。本試驗(yàn)中，100 μg/mL 的APS 可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD80、CD86 和MHC-II 分子表達(dá)，表明一定濃度的APS 有利于巨噬細(xì)胞在抗原刺激下快速活化，加速抗原呈遞。

吞噬率和吞噬能力的增強(qiáng)是活化的巨噬細(xì)胞最顯著的特征之一，這有助于宿主防御以及自身免疫。本研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞的吞噬率隨著APS 濃度（0.1～100 μg/mL）增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，其中100 μg/mL 的APS 能夠顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬率；50 μg/mL 和100 μg/mL 的APS 能顯 著提高 巨噬細(xì) 胞的吞噬能力。這可能是在日糧中添加APS 能顯著增強(qiáng)肉雞免疫能力的原因之一，也與白術(shù)、何首烏等中草藥多糖被證實(shí)能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性的結(jié)論一致。多糖的功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，APS 經(jīng)分離純化主要分為APS-1 和APS-22 種組分，APS-2 是主要的免疫活性成分，由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成。有研究表明APS-2 中的-1，4--葡萄糖單糖殘基能夠有效促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖，但-1，2，5--阿拉伯糖、-1，3，4--半乳糖、-1，2-L-鼠李糖等單糖殘基與APS-2 免疫活性之間的關(guān)系尚未有研究。

4 結(jié) 論

本研究中，APS 通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，上調(diào)巨噬細(xì)胞表面CD80、CD86、MHC-II 分子的表達(dá)，提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力，但其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。