乳酸菌和纖維素酶對(duì)馬鈴薯渣與玉米秸稈混合青貯發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性和體外發(fā)酵參數(shù)的影響

王嘯林，馮冠智，張城瑞，房新鵬，張廣寧，張永根

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

馬鈴薯渣作為馬鈴薯淀粉生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類較多、含量豐富。但由于馬鈴薯渣具有水分含量高和適口性差等特點(diǎn)，保存時(shí)易腐敗變質(zhì)。我國(guó)農(nóng)作物玉米秸稈產(chǎn)量較高，資源豐富，將玉米秸稈與馬鈴薯渣混合青貯可吸收后者含量較高的水分，但由于玉米秸稈木質(zhì)素含量較高，粗蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)含量較低；并且二者自身的乳酸菌附著量較少，活性較低，因此在混貯發(fā)酵飼料的品質(zhì)難以得到保證。乳酸菌（LAB）、纖維素酶（EN）是青貯過(guò)程中的常用添加劑。LAB 能有效改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和纖維消化率，使總氮比值、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和甲烷產(chǎn)量以及中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的濃度下降。此外，有研究表明，將植物乳桿菌與布氏乳桿菌合用可提高全株玉米青貯的有氧穩(wěn)定性。添加EN 可促進(jìn)青貯原料中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解為L(zhǎng)AB 能夠利用的水溶性碳水化合物，提供充足的發(fā)酵底物，使青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)得到改善。EN 還可以降低青貯飼料pH 和中性洗滌纖維含量，改善青貯飼料的飼用價(jià)值。因此，本試驗(yàn)擬將LAB 和EN 添加到不同比例馬鈴薯渣玉米秸稈混合青貯飼料中，探究其對(duì)混合青貯發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性和體外發(fā)酵參數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 馬鈴薯渣取自黑龍江省九三農(nóng)場(chǎng)；玉米秸稈取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)基地；LAB 添加劑的主要成分為植物乳桿菌（，活菌數(shù)為1×10CFU/g，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心）和布氏乳桿菌（，活菌數(shù)為1×10CFU/g，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）的比例為1:1；EN 活性為10 000 U/g（滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用雙因素（原料配比×添加劑）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置混合青貯中馬鈴薯渣和玉米秸稈（切割揉碎至1～2 cm）的鮮重（FM）質(zhì)量比分別為6:4（PC組）和8:2（PC組），2 種混合比例的青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分如表1 所示。每種青貯充分混勻后分為處理組和對(duì)照組，處理組分別添加LAB 1×10CFU/g、EN 100 U/g、LAB 1×10CFU/g+EN 100 U/g，對(duì)照組則不添加LAB 和EN。將經(jīng)過(guò)處理的各組混合料裝入聚乙烯青貯袋，24袋（4 處理×2 比例×3 重復(fù)）用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、發(fā)酵指標(biāo)和體外參數(shù)；另取72 袋（4 處理×2 比例×3 好氧暴露天數(shù)×3 重復(fù)）用于評(píng)定有氧穩(wěn)定性。壓實(shí)后用真空包裝機(jī)抽真空密封，在室溫條件下青貯。30 d 后開(kāi)封取樣，測(cè)定各種指標(biāo)含量。

表1 馬鈴薯渣和玉米秸稈混貯前的營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的測(cè)定 按照AOAC的方法分析測(cè)定DM 和CP 含量；根據(jù)van Soest 等的方法測(cè)定NDF、ADF 以及ADL 含量；采用硫酸-蒽酮法測(cè)定WSC含量。通過(guò)公式計(jì)算得出CE 和HE 含量：HE=NDFADF，CE=ADF－ADL。

1.4 發(fā)酵指標(biāo)的測(cè)定 pH 采用Sartorius PB-10 型酸度計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司） 測(cè)定；乳酸（LA）含量按照盧定強(qiáng)等的方法采用Waters-600 高效液相色譜儀測(cè)定；乙酸（AA）和丙酸（PA）含量采用氣相色譜法（島津GC-2010）測(cè)定；氨氮濃度（AN）采用靛酚藍(lán)法測(cè)定。微生物數(shù)量測(cè)定方法：取樣品10 g，加入90 mL 生理鹽水后放入搖床搖勻，取混勻后的菌液逐步稀釋，將稀釋后的菌液均勻涂布在MRS 瓊脂培養(yǎng)基的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)乳酸菌；均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板上，30℃恒溫培養(yǎng)48～72 h 后計(jì)數(shù)酵母菌和霉菌。

1.5 有氧穩(wěn)定性的評(píng)定 青貯30 d 后，各組取出9 袋進(jìn)行有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)。將每袋混合青貯料取出，充分混合，松散裝入10 L 塑料容器中，不壓實(shí)。容器在環(huán)境溫度（20～25℃）下儲(chǔ)存，用雙層粗棉布覆蓋以避免污染并保證青貯料的干燥，同時(shí)促進(jìn)空氣滲入青貯料團(tuán)塊。分別于有氧暴露后第3、5、7 天各取3 袋，進(jìn)行pH 和微生物數(shù)量的測(cè)定。

1.6 體外發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 選擇3 頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛為瘤胃液供體，于晨飼前通過(guò)瘺管采集瘤胃液并混勻，經(jīng)4 層紗布濾入提前裝有39℃熱水并通入CO的保溫瓶中，密封瓶口并帶回實(shí)驗(yàn)室，將瘤胃液與事先配置好的人工唾液（由微量元素溶液、緩沖溶液、常量元素溶液、0.1% 刃天青溶液和還原劑溶液組成）混合均勻。將稱量準(zhǔn)確的0.500 0 g 樣品用纖維袋封好，放入培養(yǎng)管中，排凈氣體，并立即轉(zhuǎn)入事先預(yù)熱的39℃人工瘤胃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。參考湯少勛等的方法測(cè)定并計(jì)算累計(jì)總產(chǎn)氣量（GP48）。將發(fā)酵液分裝出3 份，分別用于測(cè)定VFA 含量、氨態(tài)氮（NH-N）含量以及微生物蛋白（MCP）濃度，其中MCP 濃度根據(jù)蘇海涯的方法測(cè)定。管內(nèi)剩余發(fā)酵液用于測(cè)定pH。此外，從培養(yǎng)管里取出裝有樣品的纖維袋，通過(guò)培養(yǎng)前后樣品失重計(jì)算體外干物質(zhì)消失率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 的GLM 程序，在處理（LAB和EN）、原料比例和處理×原料比例的影響下，采用雙因素方差分析對(duì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和體外發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行研究；在處理（LAB 和EN）、有氧暴露天數(shù)和處理×有氧暴露天數(shù)的影響下，采用雙因素方差分析對(duì)有氧穩(wěn)定性進(jìn)行研究。多重比較采用Duncan's 法檢驗(yàn)，<0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響由表2 可見(jiàn)，在使用添加劑相同的條件下，PC組中DM、NDF、ADF 以及CE 含量高于PC組（<0.05），而CP 含量則低于PC組（<0.05）。在混合比例相同的條件下，PC組中，各添加劑處理組DM 含量低于對(duì)照組（<0.05）；LAB 組和LAB+EN 組ADF 含量低于對(duì)照組（<0.05）；與對(duì)照組相比，EN 組和LAB+EN組CP 含量分別提高15%和13%（<0.05）；各添加劑處理組的WSC 含量較對(duì)照組分別提高了26%、27%和48%（<0.05）。在PC組中，與對(duì)照組相比，EN 組和LAB+EN 組ADF 含量均降低（<0.05），而WSC含量增加（<0.05）；LAB+EN 組NDF 含量低于對(duì)照組（<0.05）。

表2 混合比例與添加劑對(duì)混合青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.2 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表3 可見(jiàn)，在使用添加劑相同的條件下，PC組pH 高于PC組（<0.05），但兩組內(nèi)所有處理的青貯料pH 都低于4.2，均符合優(yōu)良青貯的要求；PC組LA含量和乳酸菌數(shù)量高于PC組（<0.05），而AA、PA和AN 含量均低于PC組（<0.05）。在混合比例相同的條件下，在PC組和PC組中，LAB+EN 組pH 低于其他3 組（<0.05），而AN 含量低于對(duì)照組和EN 組（<0.05）。此外，PC組中，與對(duì)照組相比，LAB 組和LAB+EN 組LA 含量和乳酸菌數(shù)量增加（<0.05），AA 含量則降低（<0.05）。

表3 混合比例與添加劑對(duì)混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響 由表4 和表5 可見(jiàn)，在使用添加劑相同的條件下，隨著有氧暴露天數(shù)的增長(zhǎng)，各處理組的pH 升高（<0.05），乳酸菌數(shù)量減少（<0.05），酵母菌和霉菌數(shù)量增加（<0.05）。在混合比例相同的條件下，隨著有氧暴露的進(jìn)行，LAB 組和LAB+EN 組乳酸菌數(shù)量高于其他2 組（<0.05），酵母菌和霉菌數(shù)量低于其他兩組（<0.05）。PC組中，LAB 組和LAB+EN 組pH始終低于4.20，且LAB+EN 組pH 最低；對(duì)照組和EN組pH 在有氧暴露的第7 天分別升高到5.00 和4.63。在PC組中，LAB 組和LAB+EN 組pH 始終低于4.30，且LAB+EN 組pH 最低；對(duì)照組和EN 組pH 在有氧暴露的第7 天分別升高到5.11 和4.58。

表4 不同處理對(duì)PC1 組混合青貯飼料7 d 有氧條件下發(fā)酵品質(zhì)的影響

表5 不同處理對(duì)PC2 組混合青貯飼料7 d 有氧條件下發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.4 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料體外發(fā)酵參數(shù)的影響 由表6 可見(jiàn)，在使用添加劑相同的條件下，PC組的體外干物質(zhì)消失率低于PC組（<0.05）。在混合比例相同的條件下，PC組中，LAB+EN 組發(fā)酵液TVFA、乙酸和丙酸含量高于對(duì)照組（<0.05）；EN 組和LAB+EN 組體外干物質(zhì)消失率較對(duì)照組分別升高了7% 和18%（<0.05）。在PC組中，EN 組和LAB+EN 組的發(fā)酵液TVFA、乙酸和丙酸含量、體外干物質(zhì)消失率以及累計(jì)產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組（<0.05）。

表6 混合比例與添加劑對(duì)混合青貯飼料體外發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討 論

3.1 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)能通過(guò)比較其化學(xué)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中NDF、ADF 和CP 含量是主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，NDF 和ADF含量越低，CP 含量越高，飼料品質(zhì)越好。張朝陽(yáng)等研究結(jié)果表明，降低草木犀和玉米秸稈混合青貯中玉米秸稈的比例可以提高CP 含量，并降低NDF 和ADF 含量。本研究結(jié)果也表明，與PC組相比，PC組有較高的CP 含量以及較低的NDF 和ADF 含量，說(shuō)明PC組的青貯飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，這可能是由于玉米秸稈本身纖維含量較高，CP 含量較低，而PC組中玉米秸稈所占比例較低造成的。Zhang 等研究結(jié)果表明，LAB和EN 處理的濕玉米蛋白飼料和玉米秸稈全混合日糧中NDF 和ADF 含量降低，WSC 含量升高。本研究的結(jié)果也表明，LAB+EN 組的青貯飼料NDF 和ADF 含量較低，而WSC 含量較高。這可能是由于在青貯過(guò)程中，EN 可將青貯飼料細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維成分降解為水溶性碳水化合物，為乳酸菌發(fā)酵提供更多的底物，而添加LAB 則可以保留更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此外，由于發(fā)酵底物的增加，早期乳酸發(fā)酵取得優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致pH 降低，從而抑制不良微生物的新陳代謝，也減少了某些能夠分解蛋白質(zhì)并產(chǎn)生胺類化合物的厭氧微生物（如梭菌），改善了青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。王興剛在稻草秸稈中添加LAB 和EN 較好地保存了CP 等營(yíng)養(yǎng)成分。本試驗(yàn)中LAB+EN 組CP 含量亦較高。

3.2 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)主要是通過(guò)pH、AN 以及有機(jī)酸含量等指標(biāo)來(lái)反映，當(dāng)pH 與AN 含量低、有機(jī)酸含量多時(shí)，青貯飼料不僅可以較好保存，而且具有更高的品質(zhì)。在青貯期間，由乳酸菌產(chǎn)生的乳酸通常情況下是含量最高的酸，對(duì)于早期抑制不良微生物的生長(zhǎng)以及減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失有著重要意義。優(yōu)質(zhì)的青貯飼料應(yīng)該具有大量的乳酸、較少的乙酸和丙酸及AN 含量、pH 較低等特點(diǎn)。與PC組相比，PC組青貯的乳酸含量較高，因此pH 更低。這可能是由于玉米秸稈的增多能為乳酸菌發(fā)酵提供能量，產(chǎn)生更多的乳酸，使pH 迅速下降，同時(shí)抑制了乙酸和丙酸的生成。譚樹(shù)義等將復(fù)合酶制劑（主要成分是纖維素酶和木聚糖酶）和LAB 添加于玉米秸稈，增加乳酸含量的同時(shí)降低了pH和AN 濃度。本研究結(jié)果也表明，LAB+EN 處理的青貯飼料乳酸菌數(shù)量及乳酸含量增加，AN 濃度和pH 降低。這可能是由于LAB 與EN 之間存在協(xié)同作用，EN 能夠解開(kāi)纖維素鏈間和鏈內(nèi)的氫鍵，形成無(wú)序的非結(jié)晶纖維素，隨后玉米秸稈中的纖維成分被迅速降解為單糖或雙糖，促進(jìn)了LAB 的繁殖，而添加LAB 帶來(lái)更多的底物，會(huì)大量發(fā)酵生成乳酸，導(dǎo)致pH 的迅速下降，改善青貯飼料的品質(zhì)。除此之外，Sheperd 等研究結(jié)果表明，添加纖維素酶對(duì)青貯玉米的揮發(fā)性脂肪酸以及AN 濃度均無(wú)影響。本研究結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比，EN 組pH、乳酸和乙酸的含量以及AN 濃度差異并不顯著。這可能是由于原料自身的發(fā)酵底物足夠充分，所以添加EN 對(duì)于發(fā)酵品質(zhì)的影響不大。

3.3 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響 開(kāi)窖后的青貯飼料與氧氣充分接觸，導(dǎo)致酵母菌、霉菌以及梭菌等好氧微生物活動(dòng)性增強(qiáng)，這些好氧細(xì)菌的增殖會(huì)引起溫度和pH 的異常升高，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失以及青貯飼料的腐敗變質(zhì)。而青貯飼料的有氧穩(wěn)定性是指，與氧氣接觸后飼料的pH 和溫度均不升高，仍舊保持新鮮、氣味酸香的能力。通常情況下，抑制酵母菌的快速增殖以及降低青貯pH 對(duì)提高飼料的有氧穩(wěn)定性具有重要意義。Zhang 等研究結(jié)果表明，在濕玉米蛋白飼料和玉米秸稈全混合日糧中添加LAB和EN 后可降低pH、酵母菌以及霉菌數(shù)量。本研究的結(jié)果也表明，LAB 組和LAB+EN 組的混合青貯在好氧暴露后，酵母菌數(shù)量以及pH 顯著低于其他兩組。這是由于本試驗(yàn)所選用的乳酸菌制劑為復(fù)合乳酸菌，主要成分為植物乳桿菌和布氏乳桿菌，其中植物乳桿菌能提高青貯飼料中的乳酸含量，促進(jìn)飼料pH 的降低，使蛋白質(zhì)的損失率減少，同時(shí)抑制丁酸等有害物質(zhì)的發(fā)酵，其青貯品質(zhì)得到改善；而布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，除了生成乳酸之外，還可以產(chǎn)生較多的揮發(fā)性短鏈脂肪酸（如乙酸），對(duì)降低青貯發(fā)酵后期pH 有重要作用，進(jìn)而抑制霉菌、酵母菌等好氧微生物的生長(zhǎng)。

3.4 混合比例和添加劑對(duì)混合青貯飼料體外發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃液pH 在一定程度上反映了瘤胃消化代謝狀況，與微生物的活動(dòng)與繁殖息息相關(guān)，是評(píng)價(jià)瘤胃功能和生理狀況的重要指標(biāo)。通常情況下，瘤胃液pH 的正常范圍是6.2～6.8。在本試驗(yàn)中，體外發(fā)酵液的pH 在6.45～6.63，均在正常范圍內(nèi)。體外干物質(zhì)消失率可以反映體外發(fā)酵時(shí)底物的降解效果，其中CP 容易被降解，而NDF 則難以被利用。本試驗(yàn)中，PC組的體外干物質(zhì)消失率低于PC組，這是由于PC組中玉米秸稈的比例較高，導(dǎo)致其纖維含量較高，CP 含量較低，而NDF 的大量存在導(dǎo)致飼料不容易被降解，因此PC組飼料底物的降解效果變差。飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣的原料主要是非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，因此累計(jì)產(chǎn)氣量可以反映飼料的發(fā)酵程度，進(jìn)而評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵粗飼料的利用率。萬(wàn)江春等研究結(jié)果表明，纖維素酶和乳酸菌（主要成分是植物乳桿菌和干酪乳桿菌）同時(shí)應(yīng)用于棉花秸稈青貯中提高了產(chǎn)氣量。本研究的結(jié)果也表明，LAB+EN處理使青貯飼料的累計(jì)產(chǎn)氣量升高。這可能是由于EN能夠降解植物細(xì)胞壁中的纖維成分，本身難以利用的中性洗滌纖維在EN 的作用下迅速被降解并利用，提高了飼料利用率；在此基礎(chǔ)上添加LAB 可以促進(jìn)乳酸的生成，減少飼料中CP 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。

4 結(jié) 論

在本研究條件下，混合青貯原料馬鈴薯渣與玉米秸稈的比例為8:2（PC）時(shí)具有較好的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和體外消化率，而混合比例為6:4（PC）時(shí)具有較好的發(fā)酵品質(zhì)；在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合添加LAB 和EN 能使混合青貯具有更好的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性和體外消化率。