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    新西蘭白兔毛囊體外培養(yǎng)條件優(yōu)化及其增殖能力的研究

    2022-04-15 07:17:18孫少寧陳秋燃李佳麗張琛靳榮帥白少成姚凡陳陽吳信生
    中國畜牧雜志 2022年4期
    關鍵詞:生長血清實驗

    孫少寧,陳秋燃,李佳麗,張琛,靳榮帥,白少成,姚凡,陳陽,2,吳信生,2*

    (1.揚州大學動物科學技術學院,江蘇揚州 225009;2.農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇揚州 225009)

    新西蘭兔原產(chǎn)于美國,其早期生長快,毛皮質(zhì)地好,具有較高的飼養(yǎng)經(jīng)濟價值,并在醫(yī)藥學和生物學實驗中被廣泛應用。構建新西蘭白兔的毛囊體外培養(yǎng)模型對畜牧學、醫(yī)學和生物學研究都具有重要意義,也可為探究家兔毛囊發(fā)育機制提供研究素材。

    毛品質(zhì)是衡量毛兔經(jīng)濟價值的主要性狀,毛囊決定背毛質(zhì)量,探究毛囊生長因子調(diào)控及生長條件顯得尤為重要。隨著生物學技術的不斷發(fā)展,離體培養(yǎng)組織器官的可能性大大提高。麥躍等曾在血漿凝塊中嘗試種植胚胎鼠皮膚,進行懸滴培養(yǎng),順利獲得和普通毛囊相仿的毛囊構造,拓展毛囊重建培養(yǎng)研究領域。1990年Kaufman 等研究發(fā)現(xiàn),在William’s E 培養(yǎng)基中毛囊生長速度與體內(nèi)生長速度相近,成功建立人頭皮游離毛囊培養(yǎng)模型,但由于實驗所用人頭皮毛囊組織來源狹窄,實驗很難重復。范衛(wèi)新等將豬毛囊代替人毛囊展開無血清成分培養(yǎng)研究。如今,多數(shù)實驗以人、鼠、豬、羊等動物毛囊為模型,但兔作為常見的實驗動物,與之有關研究報道較少。本實驗通過體外分離毛囊,分析不同培養(yǎng)基對新西蘭白兔觸須毛囊生長、形態(tài)和增殖能力的影響,為研究毛囊生物學特征、生長調(diào)節(jié)機制提供重要參考。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    1.1.1 主要試劑 William’s E、DMEM、MEM 培養(yǎng)基來自Gibco 公司;胰島素、氫化可的松、轉鐵蛋白、亞硒酸鹽購于北京索萊寶科技有限公司;雙抗購自華北制藥有限公司;PCNA 增殖細胞核抗原(GB13010-1)購自賽維爾公司。其中,配制3 種培養(yǎng)基時,均添加10 μg/mL胰島素、10 ng/mL 氫化可的松、10 μg/mL 轉鐵蛋白、10 ng/mL 亞硒酸鹽和100×雙抗。

    1.1.2 主要儀器 解剖顯微鏡(OLYMPUS);熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS);CO培養(yǎng)箱(BINDER);DK-600 恒溫水槽;SW-CJ-1F 型無菌超凈工作臺。

    1.2 兔觸須毛囊的分離與培養(yǎng) 選擇2 月齡健康的新西蘭白兔,準備75%酒精的容器,將其完全浸泡,處理10 s,置于已消毒完成托盤中。準備好6個消毒容器,3個分別加酒精(75%),另3個分別加含雙抗的生理鹽水,將剪下的兔觸須部皮膚依次放入,浸泡。準備滅菌處理好的燒杯,加入4℃生理鹽水,將浸泡處理好的觸須部皮膚置入,備用,燒杯下放冰袋。把觸須部組織順毛囊平行方向分割成細條形狀,將細條狀毛囊用顯微器械進行分散處理,獲得獨立處于毛囊生長期的組織,去除大部分周圍組織,盡量避免兔毛囊損傷。挑選結構完整的毛囊進行體外培養(yǎng)實驗。

    取3個培養(yǎng)皿,依次加入William’s E 無血清培養(yǎng)液、DMEM 和MEM,將已處理兔觸須毛囊隨機分成3組置入。得到3 組兔觸須毛囊,各用3 種培養(yǎng)液洗滌2 遍,分為3 組置入 24 孔培養(yǎng)板中,標記好,再每孔分別加入無血清培養(yǎng)液1 mL,置入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),溫度保持37℃,2 d 更換培養(yǎng)液,持續(xù)6 d,注意控制溫度。

    1.3 組織HE 染色收集已由William’s E、DMEM 和MEM 培養(yǎng)基處理4 d 后的毛囊,4% 多聚甲醛固定。50%-70%-80%-90%梯度浸泡,乙醇處理沖洗包埋。乙醇、二甲苯透明處理,浸蠟,制作厚度約5 μm 切片。用二甲苯、乙醇和不同濃度酒精脫蠟,蘇木素和伊紅染色。經(jīng)透明脫水處理后,用中性樹膠封片,顯微鏡記錄毛囊形態(tài)。

    1.4 增殖細胞核抗原(PCNA)免疫熒光染色 切片順次置入二甲苯I、二甲苯II,經(jīng)無水乙醇、75%和85%酒精蒸餾洗滌,置于修復盒中,中低火間斷加熱,降溫后搖晃洗滌。微干,在組織外圍畫圈,由圈內(nèi)自發(fā)熒光淬滅劑等待處理5 min,BSA 孵育30 min。加一抗、二抗室溫避光孵育,加PBS 緩沖液洗滌5 min,DAPI 染色。取出微干,抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡觀察采集。

    1.5 統(tǒng)計分析 倒置顯微鏡下觀察,采用目鏡測微尺方式,每2 d 測量毛囊,觀察形態(tài)變化,記錄毛囊生長數(shù)據(jù)。軟件SPSS 20.0 開展單因子ANOVA 方差分析,結果以平均數(shù)± 標準差表示,<0.05 為差異顯著,<0.01 為差異極顯著。

    2 結果

    2.1 毛囊的體外培養(yǎng) 如圖1 所示,顯微鏡下毛囊未發(fā)生破損,且毛干正常生長,說明毛囊體外分離成功。在6 d的體外毛囊培養(yǎng)周期中,3 組毛囊均可長出毛干,不同組毛囊會隨著培養(yǎng)時間延長的毛干增長下降,4 d 后部分毛囊發(fā)生不同程度的彎曲甚至停止生長。

    圖1 體外分離毛囊0~6d 的生長形態(tài)

    2.2 不同培養(yǎng)基對毛囊毛干體外生長速度的影響 由表1可以看出,William’s E、DMEM、MEM 中毛囊毛干生長速度在不同時間均有不同,DMEM 組在2 d 和4 d 毛干生長速度高于6 d(<0.05),William’s E 組和MEM組在2 d 和4 d 的毛干生長速度也高于6 d(<0.01)。對比3 組毛囊毛干平均生長速度,William’s E 組的平均生長速度大于MEM 組(<0.05),DMEM 組與其他2 組沒有顯著差異。4 d 后各組毛干生長緩慢,MEM 組毛干生長基本停滯。

    表1 培養(yǎng)基類型對毛囊毛干生長速度的影響

    2.3 不同培養(yǎng)基對毛囊形態(tài)的影響 如圖2 所示,HE 染色表明3 組毛囊結構有所不同。培養(yǎng)4 d 時,Williams’E組毛囊結構完好,毛乳頭清晰,DMEM 和MEM 組毛乳頭消失。DMEM 組毛囊開始出現(xiàn)萎縮與結締組織開始分離,MEM 組毛囊結構明顯萎縮,外根鞘底部變圓,毛囊變形。

    圖2 HE 染色組織學分析(×40)

    2.4 體外培條件對毛囊基質(zhì)細胞增殖能力影響 PCNA染色熒光在毛囊底部出現(xiàn),其中,Williams’E 組PCNA陽性表達在毛乳頭清晰可見,DMEM 和MEM 組毛囊表達僅表達在外根鞘,說明Williams’E 組毛囊增殖能力比其他2 組強(圖3)。

    圖3 免疫熒光染色分析(×100)

    3 討 論

    毛發(fā)生長受許多因素控制,呈現(xiàn)周期變化,兔的年齡、毛囊大小、操作溫度等均可能成為影響因素。1 月齡以下兔的毛囊結構發(fā)育不完全或較嫩小,而2 月齡的兔毛囊形態(tài)大小理想、活性強,更適用于毛囊的分離。因此,本實驗選擇2 月齡兔觸須毛囊作為研究對象。苗勇研究表明毛囊在裸露分離時,如果完全暴露會影響其活性,其生長狀態(tài)會變差。本實驗在分離毛囊時也注意保持毛囊的完整性,防止影響毛囊活性,在不影響觀察的情況下,可以留一些組織保護毛囊。

    前人通過毛囊體外保存實驗發(fā)現(xiàn)William’s E 培養(yǎng)液優(yōu)于DMEM 培養(yǎng)液,且未添加血清的William’s E 培養(yǎng)液優(yōu)于添加血清的William’s E 培養(yǎng)液。有研究顯示毛囊更適合在無血清培養(yǎng)基中生長,因此血清在毛囊培養(yǎng)中成為無關緊要成分,所以試驗條件均未添加血清。本實驗發(fā)現(xiàn),在William’s E 中培養(yǎng)的毛囊可以生長6 d 以上,通過比較培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn),William’s E較DMEM 培養(yǎng)基含有更豐富的維生素、氨基酸及微量元素,有助于毛囊生長,William’s E 營養(yǎng)成分比另外兩個培養(yǎng)基更加豐足,更加接近體外觸須毛囊生長營養(yǎng)環(huán)境。總體來說,無血清William’s E 較其他培養(yǎng)基更貼近毛囊在新西蘭兔體內(nèi)生長的環(huán)境。Philpott 等研究發(fā)現(xiàn) William’s E 培養(yǎng)液中有NaSeO及氫化可的松,可以適當保持毛囊形態(tài)。DMEM 和William’s E、MEM 組的毛囊生長與時間成反比,與體內(nèi)生長相比差距很大,此現(xiàn)象可能與毛囊細胞的分裂能力下降有關。毛囊脫離內(nèi)環(huán)境后,雖然體外模擬出毛囊的生長環(huán)境,但缺乏在體內(nèi)存在的各種細胞因子,微環(huán)境異常,毛囊生長會受到不同程度的阻礙。本實驗發(fā)現(xiàn)毛囊在William’s E 培養(yǎng)基生長最佳,這和在人、絨山羊、蒙古綿羊、北京鴨、小鼠上的研究結論相同。通過石蠟切片結果可以得出William’s E 培養(yǎng)基能維持毛囊處在生長期,而另外2 種培養(yǎng)基不能。用 PCNA免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)DMEM 和MEM 組毛囊表達僅表達在外根鞘,William’s E 組在毛乳頭PCNA 陽性表達清楚透徹,說明 Williams’E 組更適合的囊增長,更好促進毛發(fā)生長。

    4 結 論

    本實驗結果顯示,在William’E 中培養(yǎng)的毛囊毛干的生長、形態(tài)以及增殖能力最佳。因此,William’s E培養(yǎng)基最適宜培養(yǎng)新西蘭白兔的觸須毛囊,可為開展動物毛囊生長發(fā)育的研究提供參考依據(jù)。

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