草原短尾羊TBXT基因RACE 克隆及胚胎各個時期表達量分析

楊 光，霍雨佳，智達夫，蘇紅，楊宏新，竇傲蕾，曹貴方*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

草原短尾羊是呼倫貝爾地區(qū)特有的綿羊品種，由于其肉質(zhì)鮮美、蛋白含量高和脂肪含量低，深受廣大消費者喜愛。有研究通過對草原短尾羊和巴爾虎羊尾部進行X 光觀察發(fā)現(xiàn)，相較于巴爾虎羊，草原短尾羊尾椎骨存在畸形；在基因組重測序結(jié)果和DNA 測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，短尾羊群體（T-box Transcription Factor T）基因發(fā)生c.G334T 錯義替換，推測草原短尾羊的短尾性狀主要由尾椎骨畸形引起，且與基因的突變相關(guān)。該處突變可能會引起B(yǎng)rachyury 蛋白功能上的改變，進而影響該蛋白與下游靶基因的結(jié)合，從而導致草原短尾羊尾椎骨畸形。草原短尾羊群體中也存在尾部長短差異，所以也有研究指出綿羊尾部長度的不同與Brachyury蛋白表達存在“劑量效應(yīng)”。是T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，也是中胚層發(fā)育的標志基因，在基因突變小鼠中出現(xiàn)尾部變短的表型；進一步對小鼠進行基因型檢測發(fā)現(xiàn)短尾鼠均為突變雜合子，純合突變小鼠胚胎發(fā)育第10 天由于尿囊無法正常合成導致死亡，并且在其他短尾表型動物中同樣發(fā)現(xiàn)基因突變會導致尾骨發(fā)育不良。mRNA 主要表達在小鼠胚胎發(fā)育時期，除在脊索細胞中能夠檢測到mRNA，在健康成年小鼠其他部位幾乎不表達；對綿羊的研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 主要在胚胎的脊索細胞和原條中表達，mRNA 表達部位隨著胚胎發(fā)育時間的推移而不斷變化。目前，綿羊胚胎發(fā)育過程中mRNA 具體的表達趨勢還鮮見報道。NCBI 數(shù)據(jù)庫中綿羊mRNA 序列共有3 種可變剪切體，長度分別為1 311 bp（登錄號：XM_027972732）、1 308 bp（登錄號：XM_027972733）、1 134 bp（登錄號：XM_004011450）;但在實驗過程中有時會出現(xiàn)與以上均不匹配的另一種mRNA 可變剪切體。為了更深入地研究形成綿羊短尾性狀的機制，本實驗獲取不同時期草原短尾羊胚胎，克隆cDNA全長序列并對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析，為研究草原短尾羊Brachyury蛋白質(zhì)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 草原短尾羊由呼倫貝爾鄂溫克錫尼河鎮(zhèn)蘇和巴特爾家庭牧場提供，公羊母羊自然交配當天記為短尾羊胚胎第0 天，分別在胚胎14、16、20 d 和25 d對母羊進行宰殺，從母體子宮內(nèi)解剖獲取草原短尾羊胚胎并迅速放入液氮中保存。

1.2 主要試劑 RNA fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SMARTer RACE 5'/3'Kit、DNA Markers、In-Fusion HD Cloning Kit 均購自TaKaRa 公司；Trans T1 Chemically Competent Cell 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）、質(zhì)粒小提試劑盒購自諾唯贊生物（南京）公司。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中所登記的綿羊（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase；登錄號：NM_001190390）和（登錄號：XM_027 972732）mRNA 序列設(shè)計qPCR、3'RACE 和5'RACE引物，引物序列發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，引物序列見表1。

表1 實驗用引物序列

1.4 草原短尾羊胚胎RNA 的提取及cDNA 合成 將草原短尾羊14、16、20 d 和25 d 胚胎剪碎后放入液氮中研磨，并按照RNA fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒說明書進行總RNA 提取。將提取后總RNA 按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）說明書進行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物于-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR 將草原短尾羊各個時期胚胎cDNA 統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL 作為模板，進行實時熒光定量PCR 檢測基因mRNA 表達量。反應(yīng)體系為：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 1 μL、ddHO 7.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃ 30 s、循環(huán)反應(yīng)95℃10 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s 共40個循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)60℃ 60 s、95℃ 15 s。每個時期的胚胎均設(shè)置3個重復(fù)孔檢測。反應(yīng)結(jié)束后使用Bio-Rad CFX 96 自帶軟件進行分析，將軟件中輸出的Ct 進行2計算，并將計算出的結(jié)果使用GraphPad Prism 9 軟件繪制柱形圖。使用軟件中的Independent-Samples T Test 進行F檢驗和T 檢驗。

1.6基因的RACE 克隆基因已知片段克隆：將草原短尾羊胚胎cDNA 作為模板，Brachyury 上、下游引物進行PCR 擴增。反應(yīng)體系如下：上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL、cDNA 1 μL、ddHO 20 μL、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）25 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃ 3 min；循環(huán)程序共30個循環(huán)包括變性95℃ 15 s、退火60℃ 15 s、延伸72℃ 3 s；徹底延伸72 ℃ 5 min。將擴增后的產(chǎn)物連接至pCE2 TA/Blunt-Zero 載體并轉(zhuǎn)化至Trans T1 大腸桿菌中，涂至具有氨芐抗性的固體LB 平板，挑取單克隆菌落用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。基因3'RACE 和5'RACE擴增按照SMARTer RACE 5'/3'Kit 說明書進行。3'RACE和5'RACE 產(chǎn)物無縫克隆連接至Lineareized pRACE vector，無縫克隆連接體系和連接條件按照In-Fusion HD Cloning Kit 說明書進行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans T1 大腸桿菌中，涂至具有氨芐抗性的固體LB 平板，挑取5個單克隆菌落，用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 草原短尾羊基因序列分析 將測序后的序列使用DNAMAN 軟件進行拼接后獲得基因cDNA全長序列，使用DNA star 軟件將基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）翻譯成氨基酸序列并輸入NCBI Blast進行序列比對，將比對后結(jié)果篩選并使用Mega 7 軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，方法使用鄰接法（Neighbor-Joining），自聚值為1000；使用SignalP 4.1（www.cbs.dtu.dk）網(wǎng)頁工具預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；使用Swiss modle（beta.swissmodel.expasy.org）網(wǎng)頁工具預(yù)測Brachyury蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；使用ProtScale（web.expasy.org）網(wǎng)頁工具預(yù)測Brachyury 蛋白質(zhì)親疏水性；使用PSIPRED v4.0（bioinf.cs.ucl.ac.uk） 和SOPMA（prabi.ibcp.fr）網(wǎng)頁工具預(yù)測Brachyury 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和計算各類二級結(jié)構(gòu)的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 草原短尾羊各個時期胚胎基因相對表達量鑒定 如圖1 所示，基因在草原短尾羊16 d 胚胎表達量高于其他胚胎時期，14 d 胚胎時期略低于16 d胚胎，20 d 胚胎mRNA 的表達量遠低于16 d 胚胎時期，在25 d 胚胎時期mRNA 幾乎不表達，說明14 d 至20 d 胚胎正處于中胚層細胞分化階段，在25 d 胚胎內(nèi)中胚層細胞分化已停止。

圖1 TBXTmRNA 在草原短尾羊各個時期胚胎中的相對表達量

2.2基因的RACE 克隆 如圖2 所示，以草原短尾羊16 d 胚胎cDNA 為模板進行基因cDNA全長克隆結(jié)果，其中第1 輪3’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果為涂帶，5’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶位置 在100 bp左右；將 第1 輪3’RACE 和5’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物稀釋后作為模板進行第2 輪巢式PCR，第2 輪3’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物電泳后顯示條帶在2 000 bp至1 000 bp之間，第2 輪5’RACE巢式PCR 產(chǎn)物電泳后顯示條帶在750 bp 至500 bp 之間，已知片段在2 000 bp 至1 000 bp 之間，條帶符合預(yù)期片段大小。

圖2 草原短尾羊TBXT基因電泳檢測

2.3 草原短尾羊基因序列分析 如圖3 所示，將測序后的序列使用DNAMAN 軟件進行序列拼接獲得草原短尾羊基因cDNA全長序列共2 426 bp，其中開放閱讀框1 335 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，通過軟件翻譯預(yù)測編碼444個氨基酸，等電點為6.912，分子量為48 328.56 道爾頓。并將拼接后的cDNA全長序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫（登錄號：MZ146381）；3’非編碼區(qū)（3’UTR）和ployA 尾長度為763 bp，5’非編碼區(qū)（5’UTR）長度為328 bp；對該基因進行核苷酸序列組成分析后發(fā)現(xiàn)腺嘌呤（A）含量為22.67%、鳥嘌呤（G）含量為28.44%、胞嘧啶（C）含量為30.05%和胸腺嘧啶（T）含量為18.76%。鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占比率為58.49%，高于腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）所占比率41.43%。

圖3 草原短尾羊TBXTcDNA全長序列和預(yù)測氨基酸序列

如圖4 所示，將預(yù)測后草原短尾羊氨基酸序列輸入NCBI 網(wǎng)站中Protein BLAST 進行序列比對，結(jié)果顯示草原短尾羊Brachyury 與山羊、羚羊、牛、鹿、海豚、豬、狗、豹、人、羊駝相似性分別為95%、94%、94%、94%、91%、90%、90%、90%、90%、90%；并將以上序列下載后使用Mega 7 軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，自舉值為1 000，結(jié)果顯示草原短尾羊與山羊?qū)偻贿M化分支，與人和羊駝進化距離較遠。

圖4 預(yù)測Brahcyury 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

如圖5A 所示，將預(yù)測后草原短尾羊氨基酸序列輸入Swiss modle 網(wǎng)頁工具使用同源建模法預(yù)測Brachyury 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，QMEAN 值為-1.04，可信值在-4～0 內(nèi)，表示該模型可信度較高，如圖5B 所示，使用ProtScale 網(wǎng)頁工具預(yù)測Brachyury 蛋白質(zhì)親疏水性，結(jié)果表示Brachyury 蛋白為疏水蛋白；如圖5C 和表2 所示，Brachyury 蛋白無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最多占整體結(jié)構(gòu)的56.53%，-螺旋、片層和-彎曲分別占總體的21.40%、16.22%和5.86%。

圖5 Brachyury 蛋白理化性質(zhì)分析

表2 各類二級結(jié)構(gòu)占Brachyury 蛋白的比例

3 討 論

在綿羊的早期胚胎發(fā)育過程中，伴隨著中胚層細胞的分化，mRNA 的表達量逐漸降低；最后該基因僅在脊索細胞中表達。mRNA 主要表達部位為胚胎中的原條，其功能為維持原條中表皮細胞的遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)草原短尾羊16 d 胚胎中mRNA 表達量最高，表明該時期的綿羊胚胎中胚層細胞分化較為旺盛，結(jié)合Michel 等人的研究可以發(fā)現(xiàn)，此時的mRNA 可能表達于胚胎原條中部和尾部。在16 d 后mRNA 的表達量逐漸降低，推測胚胎中原條逐漸退化成脊索細胞。在小鼠胚胎中的研究發(fā)現(xiàn)，Brachyury 是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子，許多參與上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的基因需要Brachyury 的激活才能促使體節(jié)的形成；由于基因突變，胚胎原條中的表皮細胞遷移能力受損，導致胚胎的后部沒有脊索細胞，即使胚胎前部有少部分脊索細胞但不能正常分化，導致小鼠體節(jié)的缺失或發(fā)育異常。在小鼠胚胎發(fā)育過程中mRNA 最高表達時期為第8.5 天，此時小鼠胚胎中原條向中胚層祖細胞分化，Brachyury作為轉(zhuǎn)錄激活劑調(diào)節(jié)這一過程，而小鼠胚胎8.5 d 可能與16 d 綿羊胚胎所處的發(fā)育階段相互對應(yīng)，推測胚胎所處時期同為中胚層細胞分化和胚胎體軸延伸時期，Clements 等認為在胚胎發(fā)育過程中mRNA 表達的梯度很可能與表皮生長因子的調(diào)控作用正相關(guān)，然而在綿羊胚胎發(fā)育過程中這一復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制亟待深入探究和證實。

本研究以16 d 胚胎cDNA 為模板，使用RACE 技術(shù)克隆草原短尾羊基因cDNA全長，所獲得的開放閱讀框長度均大于NCBI 和Ensmble 數(shù)據(jù)庫中所公開的序列，經(jīng)過序列對比后發(fā)現(xiàn)主要的Gaps 部位集中在第4 外顯子和第5 外顯子內(nèi)，在不同組織或者同一組織的不同發(fā)育階段，可變剪切的形式不是一成不變的，可變剪切形式的增多極大地豐富了真核動物的蛋白質(zhì)多樣性；在綿羊胚胎中得到mRNA 還具有哪些生物學意義需要進一步實驗證實。

既作為胚胎發(fā)育時期的重要轉(zhuǎn)錄因子，也作為對草原短尾羊短尾性狀成因研究中的候選基因，對其蛋白功能上的研究十分必要，對突變Brachyury 蛋白與野生Brachyury 蛋白在結(jié)構(gòu)上差異的認知，有助于深入討論突變后的Brachyury 蛋白如何影響下游靶基因的結(jié)合。有研究針對短尾羊和大尾羊的雜交實驗表明，由于綿羊中c.334G>T 錯義替換導致綿羊尾部變短，同時也有其他研究中指出，影響草原短尾羊和巴爾虎羊尾部長短差異的原因在于尾部的脂肪沉積，由此可以推測影響草原短尾羊尾部表型的原因可能不止一種。由于前人關(guān)于綿羊基因的研究較少，本實驗結(jié)果可作為參考并從草原短尾羊16 d 胚胎中獲取高豐度的mRNA，進一步體外制備Brachyury 蛋白，探究其突變位點對草原短尾羊尾椎骨發(fā)育的影響。

4 結(jié) 論

本研究對14、16、20 d 和25 d 草原短尾羊胚胎中mRNA 表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)16 d 胚胎中表達量最高并以其cDNA 為模板，成功克隆cDNA 序列全長序列，為研究綿羊短尾性狀的形成機制奠定理論基礎(chǔ)。