基于液相芯片的豬基因組選擇實施新策略

丁向東，王楚端，張勤

（1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，畜禽育種國家工程實驗室，農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018）

1 基因組選擇的意義

隨著分子生物學技術的突飛猛進，基因組選擇技術在奶牛、豬、雞、作物、林木和水產生物中開始大量研究和應用，是動物育種中繼BLUP 方法后，又一具有里程碑式意義的育種新技術、新方法。理論和育種實踐表明，基因組選擇的準確性高于傳統BLUP 方法，可加快遺傳進展，提高育種效益。以基因組選擇為核心的分子育種已帶來了畜禽育種的巨大變革，成為推動畜禽育種前進的強大動力?；蚪M選擇在豬上的優(yōu)勢主要體現在：①能夠進行早期選種，準確性與基于性能測定的常規(guī)育種相當，遠高于傳統的系譜指數準確性，對公豬去勢和仔豬斷奶分群具有重要價值；②對常規(guī)育種效率低和難以度量的性狀意義重大，如繁殖性狀、飼料報酬、肉質、抗病力等。因此，基因組選擇對我國豬育種具有重要的現實意義。目前，基因組選擇也是我國種業(yè)振興計劃中大力發(fā)展的育種技術。

2 我國豬基因組選擇實施痛點

我國自2017 年啟動豬基因組選擇計劃以來，全國30 多家優(yōu)秀育種企業(yè)積極參與，構建參考群，并制定基因組育種計劃。參考群體是基因組選擇的前提，雖然很多企業(yè)已建立了參考群體，但基因組選擇實施情況并不樂觀，很多育種企業(yè)仍停留在參考群體構建階段，一些企業(yè)即使實施了基因組選擇，規(guī)模也不大，影響了基因組選擇的效果。導致這一現象的原因有：①芯片價格高，影響了在早期選擇群體的廣泛應用。目前主流的基于Illumina 平臺的50K 芯片（紐勤50K 或中芯一號）檢測價格每頭平均180～200 元，如果大規(guī)模進行基因型檢測，育種成本太高，因此企業(yè)遲遲不敢開展基因組選擇育種應用；②由于基因型測定成本高，測定數量受到限制，發(fā)揮不了基因組選擇早期選種的優(yōu)勢，雖然選種準確性有所增加，但是沒有進行芯片檢測的個體會有遺珠之憾；③芯片檢測速度滿足不了育種需要。大多數企業(yè)一般在仔豬出生后10～14 d 閹割小公豬，因此要求能在14 d 前根據基因組育種值選出留下的個體，后期進行性能測定，較差的公豬進行閹割去勢。而當前的芯片檢測速度普遍偏慢，很難跟上企業(yè)的育種節(jié)奏，從技術上影響了基因組選擇的應用。

因此，為加大基因組選擇在我國豬育種中的應用，需要采用新的策略和技術。近年來，基于靶向捕獲測序技術的液相芯片由于定制靈活、可任意增刪SNP 位點，逐漸成為生物芯片的革命性技術。國內已相繼開發(fā)了多種動植物液相芯片，中國農業(yè)大學開發(fā)了豬50K 液相芯片（專利：一種基于靶向捕獲測序的豬50K 液相芯片及其應用；申請?zhí)枺篊N202110359470.7），根據育種場景需要，可分拆為1K、10K（專利：一種豬全基因組低密度SNP 芯片及其制作方法和應用；專利號：ZL201711190317.6）和40K，用于品種鑒定、系譜校正、基因定位和基因組選擇等。與我國自主研發(fā)的華大測序儀結合，7 d 可以完成芯片檢測。本文在已建立參考群體的基礎上（可以是紐勤50K、中芯一號或液相50K進行基因型測定），針對企業(yè)現狀和遠景規(guī)劃，充分利用液相芯片的檢測速度、靈活性和價格優(yōu)勢，制定基于液相芯片的基因組選擇實施方案，為基因組選擇在我國豬育種中的普遍應用提供參考。

3 核心思想與技術路線

3.1 核心思想 充分利用液相芯片的靈活性，將豬50K液相芯片拆分為10K 和40K 2 款芯片，早期利用10K低密度芯片對小豬進行大量基因型檢測，提高早期選擇（公豬去勢前）的準確性和選擇強度。經過早期選擇后，對進入性能測定的個體使用40K 芯片進行測定，與之前的10K 合并為50K，繼續(xù)進行基因組選種，根據個體表型信息、基因組信息和系譜信息，評估出最優(yōu)秀個體進入核心群。同時，具有性能測定成績和50K 芯片基因型的個體可作為參考個體，對參考群體進行擴大和更新，實現不增加分子育種成本的前提下，提高全程基因組選擇的準確性和育種效益。

3.2 技術路線 圖1 展示了基于液相芯片的基因組選擇的實施流程：

圖1 液相芯片基因組選擇實施流程

3.2.1 初選和小豬采樣（3 日齡） 剛出生的小豬進行初步篩選，淘汰弱仔、外貌不合格以及有遺傳缺陷的個體，剩余全部小公豬和母豬（可根據實際情況減少檢測頭數），采集尾部或打耳號組織樣。

3.2.2 SNP 芯片檢測（3 日齡） 對采集的所有小豬組織樣送至公司，進行10K 豬液相芯片檢測，仔豬10 日齡內完成芯片檢測。以周為批次或按公司生產節(jié)奏批次，將同一批次小豬送樣，獲得芯片基因型數據后，第一時間將芯片數據上傳至公司數據中心，通過基因型填充技術，將10K 填充至50K（10K 同時包含在紐勤50K和液相50K 芯片標記中），同時可利用10K 芯片進行系譜檢驗和校正，提高基因組遺傳評估的準確性。

3.2.3 基因組育種值（GEBV）計算（12 日齡） 利用已構建的參考群體，采用一步法GBLUP估計候選小豬GEBV。一步法GBLUP 能同時利用表型、系譜和基因組信息，基因組育種值估計更準確，并計算相應綜合多個性狀的基因組選擇指數。

3.2.4 實施第1 次基因組選種（14 日齡） 根據單性狀或綜合基因組選擇指數，在仔豬出生后14 d 內進行小豬的第1 次選種。根據群體公母豬年更新數量選擇優(yōu)秀種豬進入性能測定（具體數量與留種率有關），其余轉入育肥或者作為種豬銷售，出售的種豬可提供基因組信息及基因組育種值。

3.2.5 性能測定和40K 芯片檢測 與參考群體的性能測定性狀要求相同。聯系芯片公司，根據之前的DNA 樣，對進入測定的小豬進行40K 液相芯片測定，與其之前的10K 芯片合并為50K。一方面擴大了高質量的參考群體，另一方面提高第2 次基因組選擇的準確性。

3.2.6 實施第2 次基因組選擇和終選 將性能測定結束后的所有豬只個體測定信息上傳至公司數據中心，重新計算各性狀基因組育種值和基因組綜合指數。每個個體采2 份血樣，分別送疫控實驗室，檢測藍耳病、偽狂犬、PED、圓環(huán)病毒野毒抗體。

3.2.7 終選 根據單性狀或綜合基因組選擇指數，按需選留后備種豬，轉后備豬群。其中藍耳病、偽狂犬、PED、圓環(huán)病毒陽性個體獨立淘汰；體型外貌有明顯損征個體獨立淘汰。

3.2.8 選配 按系譜及基因組信息開展選配，記錄種公豬精子活力、實施AI 配種，記錄配種記錄。

4 具體案例分析

性能測定是現代豬科學育種的基石，以1 000 頭基礎母豬的種豬場為例，在常規(guī)育種方案下，按國家生豬遺傳改良計劃要求，核心場每窩最低需要開展一公兩母的性能測定。以母豬每年平均分娩2.2 窩計算，則該場年度性能測定頭數應為6 600 頭，其中公豬2 200 頭、母豬4 400 頭。目前非洲豬瘟疫情下很難完成這個要求。利用基因組選擇可以降低性能測定數量，結合參考群體更新、留種率等需求（表1），如果采用4 周批次化生產，根據場子的測定容量，每年可以表型測定2 600 頭，每個批次分娩窩數和表型測定量如表2 所示。

表1 群體生產參數

表2 批次化生產每批次分娩和性能測定數量

4.1 每年/每批次更新公、母豬數 1 000 頭基礎母豬按表1 的群體參數（可根據育種方案調整），每年需更新500 頭母豬，按后備豬淘汰比例10% 計，共需留后備556 頭。批次化生產每批次更新38 頭，需留后備42.73 頭。同樣，每年需更新50 頭公豬，共需留后備約56 頭。每批次4 頭，為簡單起見，公豬后備豬淘汰率也為10%，需留后備公豬4.3 頭。

4.2 第1 次基因組選種 每頭母豬年平均分娩2.2 窩，全場每年分娩2 200 窩。小豬出生后，經過遺傳缺陷等篩選后，每窩平均10 頭，則每批次初選后有1 700 頭（170×10=1 700 頭）合格仔豬，公母各半。每頭用10K 液相芯片檢測（公豬全部檢測，母豬視情況可適當減少，可以為40%～100% 比例），如果以母豬60%檢測計，則全年需檢測17 600 頭（2 200×8=17 600 頭），對于批次化生產，則每批次1 360 頭（170×8=1 360 頭）。第1 次基因組遺傳評估后，留下2 600 頭（867 公1 733 母，按1 公2 母比例，可調整）進行性能測定，并根據之前留存的DNA 對這2 600 頭豬進行40K 液相芯片檢測。對于批次化生產，則每批次留下200 頭進行測定（65 公135 母，按1 公2 母比例）。此階段留種率：2 600÷17 600=0.148，其中公豬留種率為：867÷11 000=0.079；母豬留種率：1 733÷6 600=0.263。

4.3 第2 次基因組選種 性能測定結束后，進行第2 次基因組遺傳評估，需選擇556 頭母豬和56 頭公豬共612頭留做后備。批次化生產則每批留公豬4.44 頭、母豬42.2 頭進入后備。此階段留種率：612÷2 600=0.235，公豬留種率：56÷867=0.065，母豬留種率 556÷1 733=0.321。結合整個育種流程，全年留種率為：612÷17 600=0.035，公豬留種率：56÷11 000=0.005，母豬留種率：556÷6 600=0.084，都遠低于常規(guī)育種公、母豬的留種率。

4.4 成本 主要是10K 和40K 液相芯片的檢測費用，10K 和40K 液相芯片檢測費用當前為每頭豬50～60 元和70～85 元，以10K 和40K 分別為50 元和85 元計，則全年10K 液相芯片檢測費用合計：50×17 600=880 000元。40K 液相芯片檢測費用：2 600×85=221 000 元，合計：1 101 000 萬元。根據育種方案不同，基因組育種成本也略有差異。

需要說明的是，進行測定的個體進行了10K 和40K 2 款芯片檢測，合并為50K 芯片，與參考群體相同。在進行基因組選擇的同時，每年參考群體擴大2 600 頭，為基因組選擇準確性不斷提高奠定了基礎。

4.5 與常規(guī)育種效果比較

4.5.1 減少了性能測定數量 新的基因組選擇實施方案充分利用10K 芯片的價格優(yōu)勢，加大了早期選擇的選擇強度（公母豬留種率分別為0.079 和0.263，如果進一步減少后期性能測定數量，公母豬留種率會繼續(xù)減小），降低了后期測定壓力，按國家每窩一公兩母的最低要求，每批次平均需測定510 頭，而基因組選擇可以降低性能測定數量，本案例減少到200 頭，每窩平均1.18頭，隨著參考群體擴大，后期測定可以繼續(xù)減少，大大降低了性能測定費用，尤其是飼料報酬、肉質等測定昂貴的性狀。雖然測定數量減少，但提高了全群選擇強度，公母豬留種率分別為0.005 和0.084，常規(guī)育種按2 600頭測定量計算，公母豬留種率僅為0.065 和0.321（表3）。按國家要求的6 600 頭最低測定量計算，公母豬留種率為0.026 和0.126。

表3 基因組選擇新策略與常規(guī)育種選擇強度和留種率比較

4.5.2 遺傳進展加快 衡量育種效果的主要指標是遺傳進展，其公式為：遺傳進展=（選擇強度× 選擇準確性×遺傳變異）/世代間隔。其中，遺傳進展與選擇強度、遺傳變異、選擇準確性成正比，與世代間隔成反比。雖然分子育種方案比常規(guī)育種成本有所增加，但是遺傳進展加快，選擇準確性提高。在世代間隔、遺傳變異不變的情況下，如表3 所示，基因組選擇方案整體選擇強度是常規(guī)育種的1.69 倍（2.208÷1.308=1.69）。根據之前研究，基因組選擇準確性是常規(guī)育種的1.5 倍。與常規(guī)育種相比，分子育種群體平均遺傳進展是常規(guī)育種的2.53 倍，公豬和母豬遺傳進展是常規(guī)育種的2.22倍和2.47 倍。根據育種方案，可以計算遺傳進展帶來的經濟收益。

新策略與以50K 芯片為主的基因組選擇實施策略比，如果性能測定個體數量不變，則新策略主要是第一次基因組選擇利用10K 芯片加大了檢測數量，如果原來每窩檢測3 頭，則同樣的費用可以利用10K 液相芯片檢測12 頭，包括了每窩所有經過初選的仔豬，原來策略每年檢測6 600 頭豬，用固相芯片和液相50K 的檢測成本分別是132 萬和89.1 萬元。而原來基因組選擇策略的留種率和選擇強度與常規(guī)育種沒有區(qū)別，只是選擇準確性得到了提高。而新策略由于基因型個體數量增加，不僅提高了選擇強度，而且選擇準確性進一步得到提升。因此，新策略可以做到不增加成本或降低成本的前提下，取得比原有基因組實施方案更好的效果。

4.5.3 種豬銷售收入增加 由于斷奶前增加了基因組選擇測定，沒進入測定的公母豬具有基因組信息和基因組成績，每頭作為種豬銷售時可以增加200 元，減去10K芯片每頭50 元檢測費用，可以帶來150 元額外收入，按40%的豬可以作為種豬賣掉（公豬較多，不容易賣，去勢育肥），每批次170×8×40%×150=81 600 元，新方案與常規(guī)育種相比，全年由于早期基因組選擇種豬銷售可增加收入約106 萬元，基本與全年基因組實施成本相當。由于基因組選擇可顯著加快群體遺傳進展，提高了種豬的經濟價值，因此按照本文所建議的基因組選擇策略，可以在基本不增加育種成本的情況下，為育種企業(yè)帶來更多的育種產出，增加育種效益。

5 建 議

本文根據我國豬基因組選擇在育種實踐中存在的瓶頸問題，充分利用自主知識產權的液相芯片優(yōu)勢，提出了“先低后高，先多后少”的基因組育種新策略，能夠有力推動基因組選擇技術在我國豬育種領域的落地。但同時有幾個事項值得注意和討論：

第一，性能測定數量。新策略通過加大早期基因組選擇的數量，提高基因組選擇效率，降低了后期性能測定的數量。所舉案例中，1 000 頭基礎母豬根據場子測定容量和非洲豬瘟對測定的影響，年測定量為2 600 頭，隨著基因組選擇的實施，參考群體不斷擴大，測定量還會繼續(xù)減少。這低于國家對核心場性能測定每年至少6 600 頭的最低要求。研究表明，生長性狀基因組選擇的早期選擇準確性與常規(guī)育種相當，而繁殖性狀由于常規(guī)育種結束測定時尚無記錄，其準確性與系譜指數一樣，遠低于基因組選擇準確性。基因組選擇更有價值的飼料報酬、肉質性狀等測定，常規(guī)測定顯然更難滿足每窩一公兩母的要求。因此對于開展基因組選擇的企業(yè)，建議綜合考慮性能測定量要求，從基因組檢測個體數量和性能測定量方面考察，不必按原來的標準一刀切。

同時也應看到，即使開展了大規(guī)模的基因組育種，并不是意味著不做測定了。如果不更新基因組選擇群體，隨著世代的增加，標記與基因間的連鎖不平衡程度會衰減，導致基因組選擇準確性下降。另外，有測定成績的個體基因組選擇準確性會繼續(xù)提升，更有助于選留最優(yōu)秀的個體。因此常規(guī)育種仍是基因組選擇的基石，仍需堅持。

第二，前期基因型檢測比例。利用10K 低密度芯片在早期進行大量基因型檢測，是新策略的核心，也是對新策略基因組育種成本影響最大的地方。由于公豬的重要性以及生產中閹割要求，因此本文建議初選合格的公豬全部送檢，PIC 公司對公豬也是全部基因組測定（私人交流），成本實際上并沒有增加多少，以5 頭計，10K 芯片成本僅比1 頭固態(tài)芯片檢測費略高。母豬可以設定比例40%～100%，太低則跟之前的策略沒有區(qū)別了，本文設置了60% 的比例，每窩3 頭，總體下來每年基因組選擇成本是110 萬元。如果設為40%、80%和100%，則總成本分別為99.1 萬、121 萬和132.1 萬元，變化幅度不是很大。這些需要根據各場情況自行調整。

此外，公母豬的留種率、性能測定公母數量等參數都可以根據各場情況調整，筆者團隊專門開發(fā)了相應的小程序，可以調整不同參數，并計算相應的成本和公母選擇強度，預測基因組遺傳進展，方便育種場制訂基因組選擇實施方案。

第三，不同芯片的兼容性。SNP 芯片是基因組選擇實施的前提，在豬上，多個大學、科研機構和公司開發(fā)了多款SNP 芯片，不同芯片的統一使用可以通過基因型填充加以解決。研究表明，豬液相50K 芯片與主流使用的紐勤50K 和中芯一號芯片之間的基因型填充是可行的。相同參考群體規(guī)模下，液相50K 作為基因型填充參考群體最理想，紐勤50K 和液相50K 2 款芯片由于相同位點最多，互相填充的基因型準確性更高。液相芯片基于靶向捕獲測序技術，由于其靈活性，可以隨時更新標記，容易定制新的芯片版本，但是如果不同芯片版本間相同的SNP 數量過少，則基因型填充效果很差，會影響2 款芯片的聯合使用。因此，需要考慮不同芯片的兼容性。

“國以農為本，農以種為先”，“豬糧安天下”，這些都凸顯了豬在國家糧食安全中的地位，也反映了種在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中的重要性。2021 年提出的種業(yè)振興行動方案（http://m.news.cctv.com/2021/07/09/ARTIKvt0P gpPCEm45a3uqcZR210709.shtml）更是把種源安全提升到關系國家安全的戰(zhàn)略高度。當前我國生豬育種從國家層面有中央到地方各級政府的支持，從技術層面有日益完善的新技術、新方法作為支撐，育種實踐也從以高校科研院所為主轉為企業(yè)主動育種，這些都表明我國生豬育種進入了黃金時期。雖然2018 年爆發(fā)的非洲豬瘟給養(yǎng)豬業(yè)帶來了災難，但其也促進了我國生豬業(yè)的轉型升級，首先增強了生物安全意識，加強了生物安全體系建設，為育種提供了健康環(huán)境；其次越來越多的企業(yè)意識到“手中有糧，心中不慌”，紛紛加大對育種的投入，溫氏集團、牧原集團、新希望、大北農、正邦等頭部企業(yè)紛紛成立育種事業(yè)部或育種公司，通過新技術、新手段提升育種水平，保障種的高水平供應。相信通過持續(xù)不斷的投入，我國定能培育出世界級的種豬公司。

我國雖然已建立了常規(guī)育種體系，取得了顯著成效，但與國外仍有差距，以基因組選擇為核心的分子育種為趕超世界生豬育種發(fā)達國家提供了機遇。但目前，豬上成熟的商用SNP 芯片主要來自國外公司，成為我國分子育種的卡脖子技術。液相芯片技術實現了從試劑到測序到基因分型的國產化，且能夠根據我國育種需要進行調整。本文提出的新策略充分利用液相芯片技術優(yōu)勢，通過兩階段實施，提升育種效益，尤其在非洲豬瘟常態(tài)化情況下，通過早期大規(guī)模、低成本基因型檢測可以精準篩選優(yōu)秀個體，減少后期性能測定壓力，既保證了生物安全，又提升了育種水平，使分子育種成為我國生豬育種的助推器。