動物疫病監(jiān)測抽樣技術(shù)規(guī)范

劉樞清

（山東省青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東 青島 266000）

動物疫病監(jiān)測工作中的抽樣又稱采樣，是從動物群體中抽取一部分樣本，根據(jù)對樣本的檢測來推斷群體疫病情況。抽樣是動物疫病監(jiān)測診斷工作中的重要環(huán)節(jié)，采集樣品的時機，樣品的處理、保存、運送等均影響到疫病監(jiān)測與診斷的準確性和可靠性。

1 抽樣方法

抽樣的效果取決于樣本是否有充分的代表性。一般采取隨機抽樣的方法，按照設(shè)計好的抽樣策略，從總體中抽取部分單元。隨機抽樣時，盡可能確保每個抽樣單元被抽到的概率相等且不為零。隨機抽樣方法包括簡單隨機抽樣、系統(tǒng)隨機抽樣和分層隨機抽樣。

簡單隨機抽樣前，對目標總?cè)褐械乃袉卧M行編號、記錄，形成完整列表。抽樣框可以是一份名單（名單抽樣框）、一張地圖（區(qū)域抽樣框）或數(shù)據(jù)包，具有目錄的性質(zhì)。分層隨機抽樣先將總?cè)焊鱾€單元依據(jù)抽樣目的分組，再在每一組內(nèi)進行隨機抽樣，這種方法規(guī)定了每一組提供樣本的百分比，避免了小組群代表性不足，在總?cè)簶?gòu)成復(fù)雜的情況下比隨機抽樣更精確。

2 抽樣器具

保溫箱或保溫瓶、酒精棉、碘酒棉、2～5 mL注射器及針頭，樣品容器（1.5 mL 塑料離心管、易封口樣品袋、塑料包裝袋等），塑料盒（1.5 mL小塑料離心管專用）、封條，冰袋，不干膠標簽、簽字筆、記號筆、采樣單、記錄本等，同時備好防護口罩、一次性手套、防護服、防護帽、腳套等。

3 抽樣范圍和時間

3.1 抽樣范圍 飼養(yǎng)場內(nèi)飼養(yǎng)的同日齡的畜禽為一個群體，散養(yǎng)的以自然村的畜禽為一個群體。

3.2 抽樣時間和數(shù)量 需檢測的群體應(yīng)在免疫后3～4周采樣，每個群體隨機抽樣。散養(yǎng)畜禽應(yīng)采自5個以上農(nóng)戶。

4 抽樣操作

4.1 雞翅靜脈采血 每只雞采血樣1.5 mL，盛于1.5 mL離心管中，待血清析出。氣溫低時，在保溫箱中放入熱水袋，再將盛血樣的離心管放入，以利血清析出。析出血清后，將血清移到其他塑料離心管中，封好口，貼好標簽。不同雞的血樣不能混合。

每只雞采集泄殖腔拭子和喉氣管拭子各1個，將樣品端剪下分別置于2 mL 離心管（離心管預(yù)裝含10%甘油的PBS），封好口，貼好標簽。泄殖腔拭子采集方法是將棉拭子插入雞泄殖腔約1.5～2 cm 旋轉(zhuǎn)后沾上糞便。喉氣管拭子采集方法是將棉拭子插入雞口腔至咽的后部，直達喉氣管后，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)，沾上氣管分泌物。

4.2 豬前腔靜脈采血 選取合適的針筒和針頭，針筒一般為5 mL 規(guī)格的一次性針筒。由于豬的大小不同，前腔靜脈的深淺不一樣，故使用的針頭也不同。公母豬宜選用16號50 mm針頭，30 kg以上的中大豬宜選用12號38 mm針頭，10～30 kg小豬可選用9 號25 mm 針頭，10 kg 以下乳豬應(yīng)選擇9 號20 mm 針頭。找準下針部位，豬的前腔靜脈越往頭部越淺，但也越細，越靠胸部越粗，越深。小豬取血的部位太靠前，血管小，很難扎中，而且扎中了也很難抽到血液，所以小豬的采血部位應(yīng)稍靠后。中大豬和公母豬血管較粗，往后太深，針頭夠不到血管，所以采血部位應(yīng)略靠前。20 kg以下的小豬應(yīng)采兩前肢與氣管交匯處，公母豬和20 kg以上中大豬可選頸部最低凹處。

4.3 牛尾靜脈采血向上抬舉牛尾，在尾部腹側(cè)距肛門10～15 cm處（即第4～5 或5～6尾椎交界處）常規(guī)消毒后，用牛用一次性連試管采血器（也可用5 mL的一次性塑料注射器）在尾腹側(cè)中部凹陷處垂直刺入1 cm 左右，待針頭輕微觸到尾骨時，再退回1 mm左右，見有回血即可進行抽血

4.4 羊頸靜脈采血 采血者用左手拇指（或食指與中指）在采血部位稍下方壓迫羊靜脈血管，使之充盈、怒張。采血者右手持采血針頭，與皮膚呈45°迅速刺入羊皮膚及血管內(nèi)，如見回血，證明已刺入，然后近似平行地將針頭刺入血管內(nèi)1～2cm，再放開壓迫脈管的左手后收集血液。采完血后，以干棉球壓迫局部并拔出針頭，再以5%碘酊進行局部消毒。

5 血液樣品分離

5.1 抗凝血 采血前在試管或注射器內(nèi)按比例加抗凝劑，運輸時減少震蕩,以免溶血。

5.2 非抗凝血 待血液凝固后，讓血清自然析出。析出血清選擇合適容器（玻璃試管優(yōu)于塑料離心管），擺成斜面，與空氣接觸面要大。要控制溫度，最佳溫度是體溫，夏天避免暴曬，冬天避免結(jié)冰。如果氣溫高于15 ℃，可室溫靜置最短2 h后放入冷藏箱過夜，第2 d 用離心機以8 000 轉(zhuǎn)離心1 min。如果氣溫偏低，要在保溫箱內(nèi)放置50～60 ℃的暖水袋，室溫靜置2 h 左右后放到37 ℃溫箱1 h，再放入冷藏箱過夜，第2 d離心分離血清。

6 樣品保存和運輸

6.1 樣品保存 血清4～8 ℃冷藏，不超過1 周；抗凝血4～8 ℃冷藏，不超過1 周；病毒檢驗材料短時間可冷藏，否則須-20 ℃或-70 ℃以下保存，無條件的可置滅菌50%甘油-PBS液中冷藏，不宜反復(fù)凍融；細菌檢驗病料冷藏，不宜冷凍，可置滅菌的30%甘油-PBS液（鹽水）中冷藏。

所有凍存樣品忌反復(fù)凍融。

6.2 樣品運輸

6.2.1 選擇符合運輸要求的容器裝樣，容器要密封、不滲漏，以免造成環(huán)境污染或疫情擴散。

6.2.2 樣品應(yīng)在低溫下保存和運輸。拭子樣品和組織樣品作暫時的冷藏或冷凍處理再運送。血清樣品24 h 內(nèi)運達則冷藏運輸，超過24 h 先冷凍再冷藏運輸，運輸不能超過48 h。

6.2.3 樣品若能在4 h 內(nèi)送到實驗室，可用冰袋冷藏運輸。如果超過4 h，應(yīng)置于-30 ℃冷凍處理，再在保溫箱內(nèi)加冰袋運輸，并于24 h內(nèi)送到。

7 注意事項

7.1 注意預(yù)防人畜共患病發(fā)生，采樣人員應(yīng)做好自身防護，不直接接觸采樣樣品。

7.2 防止人為傳播疫病，采樣工具和防護用品，隨身帶走，統(tǒng)一消毒。

7.3 抽樣前要調(diào)查動物的健康狀況（包括飲食、免疫、用藥等）。

7.4 采集的病料應(yīng)包裝完好，防止污染環(huán)境，同時做好環(huán)境消毒和病害肉的無害化處理。