理筋手法干預(yù)對頸后肌慢性損傷家兔β-EP、ENK、5-HT動態(tài)變化的影響

袁蘭英 馬惠昇,2* 穆 靜 李嫚嫚 李彥雙 孫文靜

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004

隨著工作和生活中電子設(shè)備的廣泛應(yīng)用，教師及職場工作者等人群持續(xù)長時間低頭伏案工作頻率大大增加[1]。頸部采取低頭位、頸前伸的姿勢，來代償頸部胸鎖乳突肌、斜方肌、頸后肌群高度緊張現(xiàn)象，造成出現(xiàn)頸部自覺不適、頸后肌群僵硬疼痛、頭痛等問題[2-3]。雖然在疼痛初期經(jīng)休息后可緩解，但是易復(fù)發(fā)，長期持續(xù)會誘發(fā)頸部疾病產(chǎn)生，增加了治療成本，又對人們的工作生活產(chǎn)生長期的影響[4-5]。唐代孫思邈在《備急千金要方·卷九》中指出：“凡人有少苦似不如平常，即須早道，當(dāng)若隱忍不治，希望自差，須臾之間，已成痼疾?！盵6]也認(rèn)為當(dāng)身體出現(xiàn)不適時，如果勉強(qiáng)忍受不進(jìn)行干預(yù)，過不了多久不適感就會形成頑疾。因此，當(dāng)處于未病的狀態(tài)時就要通過干預(yù)防止其進(jìn)一步發(fā)展成為疾病，實(shí)現(xiàn)“上醫(yī)醫(yī)未病之病”理念的同時解除患者的痛苦。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制中激活內(nèi)源性阿片肽ENK與β-EP能夠達(dá)到鎮(zhèn)痛的作用，外周中β-EP、5-HT作為經(jīng)典的致痛遞質(zhì)，也參與痛敏形成的過程。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)理筋手法干預(yù)治療頸后肌慢性損傷療效顯著[9]，但其如何發(fā)揮干預(yù)疾病形成的機(jī)制尚不明確。本研究通過建立家兔頸后肌慢性損傷模型，研究理筋手法對家兔頸后肌慢性損傷相關(guān)因子β-EP、ENK、5-HT含量的影響，探索理筋手法對人頸后肌慢性損傷的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用普通級健康日本大耳家兔63只，6月齡，雌雄各半，體重(2.0±0.5)kg，由陜西君行生物科技有限公司提供[許可證號：SCXK(陜)2017-001]，在寧夏醫(yī)科大學(xué)雙怡校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用家兔分籠飼養(yǎng)，食用標(biāo)準(zhǔn)兔飼料和水，自由飲食。室溫15～20 ℃，濕度50%～60%。

1.2 分組及造模方法 63只成年家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在觀察其飲食、糞便、活動均無異常后開始實(shí)驗(yàn)。按照標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)數(shù)字表法，將63只家兔隨機(jī)分為正常對照組組、模型組、干預(yù)組，每組21只。由專人定時定量喂養(yǎng)。根據(jù)前期課題組實(shí)驗(yàn)，參照劉志華等[10]所改良的頸部模型固定架建立兔頸后肌慢性損傷模型。根據(jù)前期課題組對兔慢性靜力性損傷造模方式、造模持續(xù)時間的反復(fù)研究，最終采用每日1次，一次5 h，固定60 d的方式進(jìn)行慢性靜力性損傷造模。

1.3 干預(yù)方法 正常對照組組家兔正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行造模與干預(yù)。模型組家兔在每天造模結(jié)束后不予任何處理。干預(yù)組家兔在每天造模結(jié)束后，立即給予理筋手法干預(yù)；由專業(yè)人員先在推拿手法測定儀上進(jìn)行手法力量、頻率等動力學(xué)參數(shù)訓(xùn)練，待松筋、順筋手法的動力學(xué)參數(shù)穩(wěn)定后對家兔頸后肌處施以松筋、撥筋、順筋的手法治療，治療時手法刺激量以家兔不躁動為宜。理筋手法干預(yù)每天1次，每次10～15 min。

1.4 組織標(biāo)本的采集 在造模后的第20天、40天、60天對各組家兔經(jīng)耳緣靜脈采集靜脈血10 mL，于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆??？諝馑ㄈㄌ幩栏鹘M家兔，剝離頸后皮膚充分暴露頸后肌，取1 cm×1 cm×0.5 cm頸后肌組織，生理鹽水沖洗后放入標(biāo)記好的包埋盒中，然后置于4%的多聚甲醛固定液中，用于HE染色。將頸段的肌肉與脊柱撥離，用咬骨剪小心剪下頸段脊柱，并用棉簽取出頸段脊髓快速置于EP管中。再取出兔的下丘腦置于EP管中。將取好的樣本快速放入-80 ℃低溫冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.5 HE染色觀察頸后肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化 將4%的多聚甲醛固定液中的肌組織，按照操作順序，依次脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后，再經(jīng)脫水、透明、封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核、胞漿、纖維組織染色情況，觀察炎癥、炎細(xì)胞浸潤情況。

1.6 ELISA分別檢測頸部中樞β-EP、ENK及外周β-EP與5-HT含量 檢測頸后肌組織、脊髓、下丘腦中β-EP、ENK與5-HT含量時，從-80°低溫冰箱中快速取出各類待測標(biāo)本，融化后維持在4 ℃左右，加入一定量PBS將標(biāo)本進(jìn)行勻漿處理，勻漿充分后，2000 r·min-1離心20 min，收集上清。按照β-EP、ENK、5-HT的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，于450 nm波長處在酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度(OD)值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測血漿中β-EP與5-HT含量，取出-80 ℃存放的血漿，恢復(fù)至4 ℃左右后添加抗凝劑EDTA混合15 min，2000 r/min離心20 min，收集上清。使用ELISA試劑盒檢測血漿中β-EP與5-HT含量，方法同上。

2 結(jié)果

2.1 家兔頸后肌局部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 在光學(xué)顯微鏡下觀察肌纖維如圖1所示，正常對照組處頸后肌肌纖維整齊排列，間隙大致相同。第20天時模型組出現(xiàn)肌原纖維排列紊亂、肌絲扭曲的現(xiàn)象；干預(yù)組相較于模型組，肌原纖維紊亂程度較輕；第40天模型組可見肌原纖維排列紊亂、疏松，肌間隙不規(guī)則增寬變窄，有少量炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)組可見局部肌原纖維排列紊亂、扭曲程度較輕，肌間隙增寬；第60天模型組可見肌原纖維排列紊亂、大幅度扭曲變形，間隙不規(guī)則變窄，大量炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)組肌纖維變化較模型組肌纖維排列紊亂、扭曲幅度小。

空白組(20 d) 模型組(20 d) 治療組(20 d)

空白組(40 d) 模型組(40 d) 治療組(40 d)

空白組(60 d) 模型組(40 d) 治療組(40 d)圖1 骨骼肌慢性靜力性損傷后組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)

2.2 各組家兔頸部中樞(脊髓與下丘腦)內(nèi)β-EP含量的比較 如表1所示，組間比較中，與正常對照組兔中樞β-EP含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處模型組β-EP含量均降低(P<0.05)；與模型組中樞β-EP含量相比，第40天時，干預(yù)組脊髓β-EP含量升高(P<0.05)；第60天時，干預(yù)組下丘腦β-EP 含量升高(P<0.05)。組內(nèi)比較中，與模型組第40天中樞β-EP含量相比，第60天脊髓β-EP含量升高(P<0.05)。與干預(yù)組第40天中樞β-EP含量比較，第20天下丘腦β-EP含量升高(P<0.05)。

表1 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中β-EP含量比較

表1 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中β-EP含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘腦脊髓下丘腦脊髓下丘腦正常對照組914.90±30.38909.62±38.34917.88±30.29921.16±27.95918.91±27.97910.73±29.55模型組838.01±59.95△826.14±29.64△817.56±33.39△839.82±40.48△865.56±46.89△▲812.52±45.12△干預(yù)組873.42±50.01867.96±45.92◆889.97±37.37☆805.39±39.98△914.90±30.38919.35±28.02☆

注：與同一時間點(diǎn)正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點(diǎn)模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較，▲P<0.05；與40 d干預(yù)組比較，◆P<0.05。

2.3 各組家兔頸部中樞(脊髓與下丘腦)內(nèi)ENK含量的比較 如表2所示，組間比較中，與正常對照組兔中樞ENK含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處模型組含量均降低(P<0.05)；與模型組中樞ENK 含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處，干預(yù)組ENK 含量升高(P<0.05)。組內(nèi)比較中，與模型組第40天中樞ENK含量相比，第60天ENK含量降低(P<0.05)。與干預(yù)組第40天比較，第20天、 60天下丘腦ENK含量均降低(P<0.05)。

表2 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中ENK含量比較

表2 各組家兔中樞(脊髓與下丘腦)中ENK含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 脊髓下丘腦脊髓下丘腦脊髓下丘腦正常對照組493.00±19.85512.11±16.86481.19±20.65509.01±20.68482.27±17.11505.58±21.04模型組393.94±26.71△433.13±20.16△393.47±18.45△433.42±24.56△382.32±11.00△▲404.46±8.42△▲干預(yù)組466.57±27.28☆ 481.42±23.56△☆◆461.61±13.85☆506.52±29.70☆ 425.06±9.51△☆◆ 398.42±16.67△◆

注：與同一時間點(diǎn)正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點(diǎn)模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較,▲P<0.05；與40 d干預(yù)組比較,◆P<0.05。

2.4 各組家兔頸部外周(頸后肌組織與血漿)內(nèi)β-EP含量的比較 如表3所示，組間比較中，與正常對照組兔外周β-EP含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處模型組含量均降低(P<0.05)；與模型組外周β-EP含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處，干預(yù)組頸后肌組織、血漿β-EP含量升高(P<0.05)。組內(nèi)比較中，與模型組、干預(yù)組第40天外周β-EP含量相比，第20天β-EP含量均升高(P<0.05)。

表3 各組家兔外周(頸后肌組織與血漿)中β-EP含量比較

表3 各組家兔外周(頸后肌組織與血漿)中β-EP含量比較

組別 20 d(n=7) 40 d(n=7) 60 d(n=7) 頸后肌組織血漿頸后肌組織血漿頸后肌組織血漿正常對照組877.00±36.27806.97±35.29876.24±37.65811.84±32.98881.94±35.80812.31±33.19模型組760.68±64.41△▲761.38±28.32△▲710.53±35.72△652.60±43.09△665.41±26.67△▲663.77±47.86△干預(yù)組827.56±19.73△☆◆785.63±39.78△☆◆797.46±42.46△☆720.55±49.34△☆834.28±25.29△☆◆811.15±33.81△☆

注：與同一時間點(diǎn)正常對照組比較，△P<0.05；與同一時間點(diǎn)模型組比較，☆P<0.05；與40 d模型組比較，▲P<0.05；與40 d干預(yù)組比較,◆P<0.05。

2.5 各組家兔頸部外周(頸后肌組織與血漿)中5-HT含量比較 如表4所示，組間比較中，與正常對照組兔外周5-HT含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處模型組頸后肌組織5-HT含量升高(P<0.05)，第40天、60天時，模型組血漿5-HT含量升高(P<0.05)；與模型組外周5-HT含量相比，同期三個觀察點(diǎn)處，干預(yù)組5-HT含量降低(P<0.05)。組內(nèi)比較中，與模型組第40天外周5-HT含量相比，第20天時頸后肌組織5-HT含量降低(P<0.05)，第60天時血漿中5-HT含量升高(P<0.05)。與干預(yù)組第40天外周5-HT含量相比，在第20天頸后肌組織5-HT含量升高(P<0.05)。

表4 各組家兔頸后肌組織及血漿內(nèi)5-HT含量比較

3 討論

慢性靜力性損傷是一種長期逐漸積累的細(xì)微損傷，國外學(xué)者[11]主要通過物理治療配合藥物治療來緩解局部疼痛不適，物理療法主要依據(jù)肌膜學(xué)、人體力學(xué)、人體解剖學(xué)理論進(jìn)行治療。理筋手法是國外損傷醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)肌膜理論的高度融合形成的專門針對筋傷類疾病的治療方法，針對性強(qiáng)，臨床療效顯著。課題組在長期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)理筋手法在治療頸椎病中能夠明顯緩解疼痛、提高人們的生活質(zhì)量,能夠治療頸部筋傷，明顯減輕頸部酸痛不適，改善患者頸部活動度(總治愈率>90%)[12]。本實(shí)驗(yàn)通過建立家兔頸后肌慢性靜力性損傷模型，采用理筋手法進(jìn)行，通過觀察中樞(脊髓、下丘腦)中β-EP、ENK和外周(頸后肌組織、血漿)中β-EP、5-HT含量的變化，探討采用理筋手法干預(yù)對慢性靜力性損傷的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)通過一般形態(tài)學(xué)觀察可觀察到干預(yù)組第40天時肌原纖維紊亂、扭曲程度較模型組有明顯改善，說明理筋手法在損傷中早期時就進(jìn)行干預(yù)，能夠減輕肌纖維的扭曲、變形，減緩炎性細(xì)胞浸潤的速度，從而縮短骨骼肌靜力性損傷后的修復(fù)時間。

β-EP亦稱安多芬或腦內(nèi)啡，是一種內(nèi)成性(腦下垂體分泌)的類嗎啡生物化學(xué)合成物激素。β-EP是存在于體內(nèi)鎮(zhèn)痛作用最重要的內(nèi)源性阿片肽，主要作用于β受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。由于β-EP肽鏈不易受酶裂解，故較其他種類內(nèi)源性阿片肽增多了與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，因此鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)而持久。陳艷偉[13]研究發(fā)現(xiàn)，手法鎮(zhèn)痛是刺激施術(shù)部位局部肌肉內(nèi)β-EP的含量增加而達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。尚坤等[14]通過背部推拿療法有效促進(jìn)β-EP 在體內(nèi)的合成、分泌與分布，從而發(fā)揮其預(yù)防疾病、保健身體的作用。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)理筋手法干預(yù)后，理筋手法干預(yù)組的β-EP含量均有不同程度的升高，說明理筋手法能夠通過調(diào)控β-EP含量的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；其中與模型組第40天脊髓β-EP含量相比，干預(yù)組第40天脊髓β-EP含量顯著升高，說明理筋手法在干預(yù)中期能夠通過合成或釋放脊髓中β-EP物質(zhì)，而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在干預(yù)組中期下丘腦中β-EP含量與模型組相比有所下降，可能是由于局部炎癥刺激所導(dǎo)致。與模型組相比，干預(yù)組早中晚三期外周(軟組織、血漿)中β-EP含量均有顯著差異(P<0.05)；說明理筋手法干預(yù)能夠激活內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)，促進(jìn)β-EP的升高，抑制痛覺信號的釋放和傳遞，實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。

ENK又稱腦啡肽，是一種內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì)，是中樞系統(tǒng)中主要參與機(jī)體內(nèi)疼痛反應(yīng)調(diào)節(jié)的主要內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)。ENK在脊髓中釋放能夠抑制傷害性P物質(zhì)的釋放[15]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組、模型組ENK的含量均降低，可能是慢性靜力性損傷導(dǎo)致的積累性損傷產(chǎn)生痛覺過敏，導(dǎo)致疼痛持續(xù)時間長，使表達(dá)量均有降低。但是經(jīng)理筋手法干預(yù)后，中早期干預(yù)組ENK的含量均顯著升高；晚期下丘腦ENK的含量降低；理筋手法干預(yù)40 d較干預(yù)60 d ENK的含量有所降低；說明在中期理筋手法干預(yù)能夠促進(jìn)中樞內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì)的釋放，鎮(zhèn)痛作用明顯。晚期下丘腦ENK的含量降低可能是由于在干預(yù)晚期ENK上行與內(nèi)源性阿片肽β-EP共同作用使下丘腦中ENK含量降低，共同抑制致痛性物質(zhì)釋放，從而達(dá)到減輕疼痛的目的。

5-HT又稱為血清素(Serotonin)，它既是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種血管活性物質(zhì)。5-HT作為目前已知的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在中樞和外周中均有分布，但是由于分布位置不同所以對疼痛的刺激性大不相同。其中外周5-HT主要由胃腸道的APUD細(xì)胞產(chǎn)生，釋放入血，由血小板提取并儲存在體內(nèi)，在一定條件下釋放入血，有較強(qiáng)的收縮血管與平滑肌的作用，還能夠促進(jìn)凝血，增加血管內(nèi)膜通透性。同時外周5-HT受體能夠形成下行的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與疼痛信號的傳導(dǎo)，在外周的局部能夠起到誘發(fā)甚至加重疼痛的作用[16]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同期三個觀察點(diǎn)處，模型組5-HT含量均升高，說明外周5-HT在痛覺傳輸中能夠發(fā)揮重要的致痛作用；同時實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在造模40 d時，模型組5-HT含量高于正常對照組5-HT含量、干預(yù)組。說明經(jīng)理筋手法干預(yù)后能夠降低外周5-HT的合成釋放，減少激活神經(jīng)末梢受體產(chǎn)生疼痛刺激。并且中早期就進(jìn)行理筋手法干預(yù)，降低5-HT的合成和釋放的效果顯著。在與前期課題組研究[17]中發(fā)現(xiàn)外周血中游離的5-HT 是強(qiáng)烈的致痛物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體受到傷害刺激時，游離的5-HT含量升高，引起疼痛刺激效應(yīng)的結(jié)論一致，再次印證了降低外周血漿中5-HT含量對降低疼痛刺激的重要性。

綜上所述，理筋手法可通過升高中樞(脊髓、下丘腦)β-EP、ENK、外周(頸后肌組織、血漿中)β-EP的表達(dá)量，降低外周(頸后肌組織、血漿中)5-HT的表達(dá)量，參與中樞、外周的鎮(zhèn)痛過程。但是其中影響疼痛遞質(zhì)的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，后期還將對這一問題進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。