基于多元統(tǒng)計(jì)分析的不同半夏種質(zhì)資源中5種成分含量的比較研究

劉建橋，朱曉花，李三要※，管秋山，李燕驕，江世高，劉海華

（1.湖南省邵陽市草地資源保護(hù)中心/邵陽市南方草業(yè)科學(xué)研究所，湖南 邵陽 422000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

半夏（Pinellia ternate）為多年生草本植物，塊莖入藥，已有2 000多年的藥用歷史。半夏為天南星科植物，具有燥濕化痰、降逆止嘔的功能[1]。半夏喜陰涼濕潤環(huán)境，多生于山坡、溪邊陰濕的草叢或疏林[2]。

現(xiàn)代研究表明半夏的主要化學(xué)成分有有機(jī)酸類、生物堿、揮發(fā)油類、凝聚素、脂肪酸、腦苷脂、黃酮類、甾醇類、氨基酸、半夏蛋白和無機(jī)元素以及苯丙素類等[3-5]。半夏的生物堿含量很低，但被認(rèn)為是具有藥理作用的主要成分之一，半夏生物堿的主要成分為L-麻黃堿、葫蘆巴堿、膽堿、鳥苷、胸苷、肌苷、尿苷和腺苷等[6]。核苷類成分是細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，具有改善人類健康和預(yù)防疾病的作用[7]。

主成分分析通過降維處理來達(dá)到簡化原始數(shù)據(jù)指標(biāo)的目的[8]。PLS-DA是一種無監(jiān)督的模型識(shí)別方法，可尋找引起樣品之間差異的變量[9]。聚類熱圖可從橫向和縱向兩個(gè)方面聚類反映樣品的關(guān)系，還通過熱圖顏色的深淺來反映樣品中相應(yīng)成分含量大小[10]?；疑P(guān)聯(lián)度分析和TOPSIS模型分析在中藥材資源的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)方面運(yùn)用廣泛，多元統(tǒng)計(jì)分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥質(zhì)量更準(zhǔn)確、更全面的分析。

因此，本實(shí)驗(yàn)以琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷為指標(biāo)成分，建立同時(shí)測(cè)定半夏中5個(gè)成分的HPLC法，通過多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)14批不同產(chǎn)地半夏進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)，以期為半夏的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（配備紫外分光檢測(cè)器）；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8；萬分之一電子天平CP224S；DHG-91012A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器；高速多功能粉碎機(jī)BJ-100型；紫外分光光度計(jì)UV-180；KQ-100TDE超聲波清洗器；himac CF 16RX離心機(jī)；0.22m PALL進(jìn)口濾頭，0.45m津騰有機(jī)濾膜、水系濾膜和泰寧一次性注射器。

1.2 材料

甲醇、磷酸均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純；琥珀酸（批號(hào)：Z18D6H7816）；鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201508）；尿苷（批號(hào)：TM0313XA13）；鳥苷（批號(hào)：111977-201501）；腺苷（批號(hào)：KM0529CA14）對(duì)照品均購于源葉生物公司。14批半夏樣品來源信息見表1，經(jīng)邵陽市草地資源保護(hù)中心李三要研究員鑒定為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。

表1 半夏樣品信息Table 1 The information of thesample

表1 半夏樣品信息Table 1 The information of thesample

編號(hào)Number來源Source生長狀態(tài)Growth state編號(hào)Number來源Source生長狀態(tài)Growth state X1 貴州威寧 栽培 X8 甘肅隴南 栽培X2 重慶豐都 栽培 X9 四川南充 野生X3 湖南張家界 野生 X10 四川遂寧 栽培X4 湖北襄陽 野生 X11 山西長治 栽培X5 河北安國 栽培 X12 山東臨沂 野生X6 河北保定 栽培 X13 山東臨沂 栽培X7 安徽滁州 栽培 X14 山東菏澤 栽培

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C1（8 250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱；流動(dòng)相：0.01 mol/L KH2PO（4 A）-甲醇（B），柱溫：30℃；進(jìn)樣量20L，流速：1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長：210 nm；在張嚴(yán)方的方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)[11]，梯度洗脫為（0～5 min，12%B；5～15 min，12%～35%B；15～20 min，35%～100%B）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別稱取琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品30 mg、10 mg、20 mg、24 mg和16 mg，用超純水溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，分別取2 mL制成濃度依次為240g/mL、80g/mL、160g/mL、192g/mL和128g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，作為儲(chǔ)備母液，放4℃冰箱備用。

2.2.2 樣品制備 將烘干的的半夏塊莖樣品打磨成粉后，取1.0 g半夏塊莖粉末用10 mL超純水超聲提取2 h，5 000 r/min離心10 min，取其上清液，重復(fù)1次，后定容至25 mL容量瓶，備用，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

按2.1項(xiàng)色譜條件下，半夏5種化學(xué)成分分離很好，出峰時(shí)間適宜，靈敏度高，信噪比和理論塔板數(shù)均符合定量要求，色譜圖見圖1（標(biāo)準(zhǔn)品）和圖2（樣品），圖中標(biāo)號(hào)1-5分別代表琥珀酸、腺苷、尿苷、鳥苷和鹽酸麻黃堿。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)色譜圖Fig.1 The chromatogram of the mixed standard

圖2 半夏樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of the sample

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將母液用超純水逐步稀釋制成1/2、1/4、1/8、1/16倍于混合母液的混合標(biāo)品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度作x軸，峰面積作y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equation

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)同一份半夏樣品在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)上樣檢測(cè)，結(jié)果（表3）表明半夏琥珀酸、腺苷、尿苷、鳥苷和鹽酸麻黃堿這5個(gè)成分保留時(shí)間RSD（t）和峰面積RSD（a）分別為0.23%～0.71%、1.11%～1.22%，均符合穩(wěn)定性要求，表明半夏樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取半夏樣品提取液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果（表3）表明半夏5種化學(xué)成分的保留時(shí)間RSD（t）為0.03%～0.10%，5種化學(xué)成分的峰面積RSD（a）為0.21%～0.62%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取半夏同一批次半夏樣品5份，按照2.2.2項(xiàng)方法處理半夏樣品后，上樣檢測(cè)，結(jié)果（表3）顯示5種化學(xué)成分的保留時(shí)間RSD（t）為1.05%～2.11%，5種化學(xué)成分的峰面積RSD（a）為0.11%～1.27%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取半夏樣品1.0 g，對(duì)已測(cè)得5種成分含量的同一批半夏供試品5份，分別精密加入一定量的各對(duì)照品母液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分加樣回收率，結(jié)果（表3）顯示加樣平均回收率在87.12%～95.43%，其RSD值為0.22%～2.21%，均符合要求，回收率優(yōu)良。

表3 方法學(xué)考察Table 3 The methodology verification

2.4.6 樣品測(cè)定 取14批半夏樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，計(jì)算樣品中5種成分含量，分析結(jié)果見表4。

2.5 差異顯著性分析

半夏5種成分含量測(cè)定結(jié)果見表4。從表4中可知半夏中琥珀酸含量為6.33～11.74 mg/g，鹽酸麻黃堿含量為0.403～0.910 mg/g，尿苷含量為0.578～0.824 mg/g，鳥苷含量為0.333～0.919 mg/g，腺苷含量為0.072～0.186 mg/g。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Table 4 Results of the content determination of various constituents(mg/g)

對(duì)14個(gè)不同產(chǎn)地半夏5種成分進(jìn)行單因素方差分析Tukey HSD檢驗(yàn)，從圖3～圖7中可以看出，5種成分含量差異均有極顯著差異，其中X12地區(qū)的半夏琥珀酸含量極顯著高于其他地區(qū)的半夏琥珀酸含量；X4-X11這7個(gè)地區(qū)的鹽酸麻黃堿含量相對(duì)較高，是X1-X3這3個(gè)地區(qū)半夏鹽酸麻黃堿含量的近2倍；X9地區(qū)的半夏尿苷含量最高，極顯著高于其他地區(qū)的半夏尿苷含量；X6地區(qū)的半夏鳥苷含量最高，極顯著高于其他地區(qū)的半夏尿苷含量；X3、X10-X13這5個(gè)地區(qū)的半夏腺苷含量相對(duì)較高。

圖3 不同居群半夏琥珀酸含量差異Fig.3 Differences in succinic acid content of in different populations

圖4 不同居群半夏鹽酸麻黃堿含量差異Fig.4 Differences in the content of ephedrine hydrochloride in from different populations

圖7 不同居群半夏腺苷含量差異Fig.7 Differences in adenosine content ofin different populations

圖5 不同居群半夏尿苷含量差異Fig.5 Differences in the content of uridine in different populations

圖6 不同居群半夏鳥甘含量差異Fig.6 Differences in guanosine content ofin different populations

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度與TOPSIS模型分析

灰色關(guān)聯(lián)度與TOPSIS模型分析適合用于中藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)，灰色關(guān)聯(lián)度可充分利用原始數(shù)據(jù)尋找整體上的規(guī)律性，TOPSIS法具有評(píng)估合理、應(yīng)用靈活等優(yōu)點(diǎn)[12,13]。參考孟杰等[12]對(duì)14個(gè)產(chǎn)地半夏的5種成分進(jìn)行兩種綜合分析對(duì)比，從表5可知，兩種不同參評(píng)方法的總體排序趨勢(shì)基本一致，灰色關(guān)聯(lián)度和DTOPSIS法的最大關(guān)聯(lián)度差異分別為51.10%和99.24%，說明不同地區(qū)的半夏質(zhì)量差異十分明顯，而DTOPSIS法分析的最大關(guān)聯(lián)度差異超過了95%，由此可以看出此處DTOPSIS法綜合評(píng)價(jià)效果更好。對(duì)不同地區(qū)半夏品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)的DTOPSIS法分析結(jié)果Ci排序?yàn)閄12＞X14＞X13＞X1＞X6＞X8＞X11＞X7＞X2＞X5＞X10＞X4＞X3＞X9，對(duì)比兩個(gè)排序，半夏質(zhì)量最好的是X12，半夏質(zhì)量最差的兩個(gè)是X9和X3。

表5 不同產(chǎn)地樣品灰色關(guān)聯(lián)度和CiTable 5 Grey correlations and Ci of samples from different growing areas

2.7 主成分分析

主成分析方法（PCA）是一種監(jiān)督模識(shí)別方法，可直觀地從多維空間上表現(xiàn)不同樣品間的成分差異。將14個(gè)不同居群半夏的5種成分構(gòu)成一個(gè)整體txt數(shù)據(jù)集，采用主成分分析方法，提取前3個(gè)主成分，并繪制各樣本的主成分得分圖，從圖8可知，不同居群半夏的PCA模型中84.6%變量被用來塑造3D模型的主要成分，PC1、PC2和PC3分別為43.3%、26.8%和14.5%，從PCA得分圖中看到不同居群半夏有明顯的品質(zhì)區(qū)別，并各自聚集成群，可將不同地區(qū)的半夏樣本明顯區(qū)分成4個(gè)類別，X11、X12和X13聚為一類，X4、X7、X8、X9、X10和X14聚為一類，X6、X5聚為一類，X1、X2和X3聚為一類，反映出各個(gè)產(chǎn)地半夏的質(zhì)量信息情況。

圖8 樣品主成分得分圖（14 5數(shù)據(jù)集）Fig.8 The score plot of principal component analysis based on 14 5 data set

2.8 偏最小二乘判別分析

為了進(jìn)一步發(fā)掘不同居群半夏樣品成分的輪廓特征，采用偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）進(jìn)行考察，該方法可以同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分類和特征提取。如下圖9所示，在PLS-DA得分圖上合計(jì)表征了原始變量65.4%的信息，主成分1為38.9%，主成分2為26.5%，從圖中可以看出不同居群半夏樣品位置分布較散，X8、X11、X12、X13和X14聚為一類，X9、X10聚為一類，X1、X3、X4、X6和X7聚為一類，X2、X5聚為一類，說明5種成分對(duì)不同居群半夏樣本的分類起了關(guān)鍵作用。

圖9 PLS-DA得分圖Fig.9 The loading plot of PLS-DA

2.9 聚類分析熱圖

通過在MetaAnalyst軟件中以平方Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，使用組間聯(lián)接法繪制半夏14個(gè)樣品的系統(tǒng)聚類樹狀圖和熱力圖（圖10），以直觀展示各成分在不同居群半夏中的含量差異，各居群半夏樣本的聚類分析顯示，可將不同居群半夏劃分為4個(gè)種類，X12、X11、X13、X10和X14聚為一類，X3、X1、和X2聚為一類，X4、X7和X8聚為一類、X9、X5和X6聚為一類。5種成分的聚類結(jié)果顯示可以明顯分為2個(gè)類群。類群（1）為琥珀酸和鹽酸麻黃堿，類群（2）為尿苷、鳥苷和腺苷。熱圖顏色深淺可以代表含量的高低，從熱圖可以明顯的看出X12顏色最深，X6、X14和X10顏色較深，琥珀酸中顏色最深的為X12，尿苷中顏色最深的為X9，即熱圖可以直觀地體現(xiàn)不同樣品各成分的差異。

圖10 不同居群半夏的聚類分析及含量熱圖Fig.10 The cluster analysis and content heat map ofin different populations

3 討論

3.1 提取工藝的選擇

試驗(yàn)前期分別將甲醇、純水和不同比例的甲醇-水作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用純水提取效率最高。對(duì)比提取時(shí)間（30 min、60 min和90 min）的效果，發(fā)現(xiàn)60 min和90 min的提取效率差異不顯著，但均優(yōu)于30 min，故選擇60 min提取。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了水-甲醇、水-乙腈、KH2PO4-甲醇、KH2PO4-乙腈等不同流動(dòng)相對(duì)色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)KH2PO4-甲醇梯度洗脫的分離效果最佳，且能在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離測(cè)定，時(shí)間遠(yuǎn)低于前人的研究[2,14]，大幅度節(jié)約了分析成本，優(yōu)化后的HPLC法簡便快捷，可同時(shí)測(cè)定半夏琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷5種重要成分，可用來對(duì)大批量的半夏種質(zhì)資源進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.3 成分測(cè)定結(jié)果分析

用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)生長環(huán)境的不同對(duì)半夏中5種成分含量影響極顯著，用MetaboAnalyst5.0軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA和聚類熱圖分析，14批半夏樣品均可聚為4類，用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析和TOPSIS模型分析，發(fā)現(xiàn)山東臨沂野生品種（X12）的綜合得分最高，而其他3種野生品種X3、X4和X9綜合評(píng)分較低；無論從單一成分還是整體來看，野生品種和栽培品種的5種含量差異沒有表現(xiàn)明顯差異性，說明半夏這5種成分含量與野生還是栽培無明顯相關(guān)性；研究還發(fā)現(xiàn)綜合評(píng)分較高的X12、X13、X14、X6和X8均為北方地區(qū)所產(chǎn)的半夏，這可能與南北地區(qū)的氣候條件、降水差異存在較大的關(guān)系，后續(xù)會(huì)進(jìn)行更深的一步試驗(yàn)來驗(yàn)證。

本研究建立的一測(cè)多評(píng)法可在12 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定半夏中琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷5種成分的含量，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)半夏樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，主成分分析、偏最小二乘判別分析和聚類分析，結(jié)果顯示，14組半夏樣品均可分為4大類，但3種分析的4大類有一定區(qū)別，且主成分分析、偏最小二乘判別分析的主成分綜合得分不能較好的體現(xiàn)出樣品質(zhì)量的優(yōu)異性，故在單因素方差分析基礎(chǔ)上，采用灰色關(guān)聯(lián)度與TOPSIS模型分析來計(jì)算半夏各樣品的綜合得分，可以明顯的顯示出各個(gè)產(chǎn)地半夏樣品的質(zhì)量差異。

綜上所述，本研究建立的一測(cè)多評(píng)法可同時(shí)測(cè)定半夏中5種活性成分的含量，這對(duì)半夏質(zhì)量更準(zhǔn)確全面的控制提供了參考依據(jù)；在對(duì)半夏種質(zhì)資源進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，建議采用單因素方差分析和TOPSIS模型分析，即可體現(xiàn)出半夏的單個(gè)成分含量高低和樣品的總體質(zhì)量水平。