基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究四逆胃痛顆粒治療萎縮性胃炎的作用機(jī)制

孫堯，王藝璇，張洪銘，徐雅娟，黃青，姜彩霞，解生旭，姜英子※

（1.延邊大學(xué)藥物分析教研室，吉林 延吉 133000；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院吉林省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012）

四逆胃痛顆粒由柴胡、白芍和枳實(shí)等9味中藥組成，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院的協(xié)議方劑。處方已臨床應(yīng)用5年以上，可追蹤病歷1 000例以上，總有效率達(dá)97.6%，但對(duì)其治療慢性萎縮性胃炎（CAG）的作用機(jī)制尚未深入探討?，F(xiàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究四逆胃痛顆粒的作用機(jī)制，分析方中重要活性成分及其治療萎縮性胃炎所作用的靶點(diǎn)及通路，為四逆胃痛顆粒后續(xù)的藥理研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 處方中藥材成分靶點(diǎn)收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）對(duì)四逆胃痛顆粒方中的柴胡、白芍、枳實(shí)、三棱、莪術(shù)、木香、黃芪、白花蛇舌草和甘草分別進(jìn)行活性成分靶點(diǎn)的收集，并通過限制口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18對(duì)所得的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，以保證獲得靶點(diǎn)的有效性；利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制四逆胃痛顆粒“中藥 成分 靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 萎縮性胃炎疾病靶點(diǎn)的收集

利用Genecards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞搜索獲得疾病的靶點(diǎn)，將獲得的靶點(diǎn)與獲得的藥材靶點(diǎn)利用在線作圖平臺(tái)Venn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）繪圖，篩選出活性成分的作用靶點(diǎn)與萎縮性胃炎疾病靶點(diǎn)的交集。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫平臺(tái)（https://string-db.org/），Organism設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分的篩選

將1.3獲得網(wǎng)絡(luò)利用Network Analyer功能進(jìn)行分析，以Betweenness Centrality和Degree兩個(gè)參數(shù)同時(shí)大于中位數(shù)作為條件篩選出四逆胃痛顆粒的核心靶點(diǎn)，將核心靶點(diǎn)映射到活性成分上，得到關(guān)鍵活性成分。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“核心靶點(diǎn) 關(guān)鍵活性成分”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 功能富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為“homo sapiens”，對(duì)1.4中得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG富集分析，得到的數(shù)據(jù)利用R語言進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接

利用MGL tools 1.5.6軟件將1.3構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的PTGS2、MAK1、AKT1與構(gòu)建的“中藥 成分 靶點(diǎn)”中度值前兩名的槲皮素、山柰酚進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 處方中活性成分的收集和“中藥 活性成分 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過數(shù)據(jù)庫檢索，共得到134個(gè)活性成分，其中柴胡13個(gè)，枳實(shí)17個(gè)，白芍9個(gè)，三棱4個(gè)，莪術(shù)有1個(gè)，黃芪18個(gè)，木香5個(gè)，白花蛇舌草5個(gè)，甘草91個(gè)，重復(fù)活性成分13個(gè)。利用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“中藥 活性成分 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 “中藥 活性成分 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 "Traditional Chinese Medicine active ingredients target"network

2.2 Venn圖的繪制

將活性成分靶點(diǎn)142個(gè)與疾病靶點(diǎn)594個(gè)，利用在線作圖平臺(tái)Venn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）繪圖，獲得交集靶點(diǎn)90個(gè)，如圖2。

圖2 四逆胃痛中藥材的成分靶點(diǎn)與慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of component targets of Sini Weitong Traditional Chinese Medicine and related targets of chronic atrophic gastritis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

數(shù)據(jù)庫分析的90個(gè)交集靶點(diǎn)，繪制四逆胃痛顆粒的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。越靠近中心的靶點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)的作用越強(qiáng)，degree值排名前3的分別為AKT1（namely Protein Kinase B）、TP53（Tumor Protein P53）、IL6（Interleukin 6），將這些靶點(diǎn)作為四逆胃痛顆粒治療萎縮性胃炎重要的潛在靶點(diǎn)。

圖3 四逆胃痛顆粒的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of Sini Weitong granule

2.4 核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分的分析

篩選得到四逆胃痛顆粒的21個(gè)核心靶點(diǎn)，將核心靶點(diǎn)映射到活性成分上，得到86個(gè)關(guān)鍵活性成分，排名靠前的有槲皮素、山柰酚、甘草查爾酮甲和柚皮素等。結(jié)果見圖4。

2.5 GO生物功能及KEGG通路富集分析

將篩選出的21個(gè)核心靶點(diǎn)利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為“homo sapiens”，進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG富集分析，得到了221條GO-BP，16條GO-CC，26條GOMF及100條KEGG通路。分別繪制了GO生物功能及KEGG通路的氣泡圖，見圖5、圖6和圖7。

圖6 GO富集分析柱狀圖Fig.6 Go enrichment analysis histogram

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 The KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取2.4網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn)PTGS2、MAK1和AKT1，分別與“核心靶點(diǎn) 關(guān)鍵活性成分”網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的活性成分槲皮素、山柰酚進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果見圖8和表1所示。一般認(rèn)為結(jié)合能小于0時(shí)化合物與蛋白可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能＜﹣17.79 kJ/mol時(shí)認(rèn)為配體和受體有一定的結(jié)合活性，當(dāng)結(jié)合能＜﹣20.93 kJ/mol時(shí)有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大。結(jié)果顯示，AKT1與槲皮素，PTGS2、MAK1、AKT1與山柰酚均有一定的結(jié)合，其中MAK1、AKT1與山柰酚的結(jié)合能均＜﹣20.93 kJ/mol，表明其具有較好的結(jié)合性。

圖8 分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking diagram

表1 關(guān)鍵活性分子與靶點(diǎn)對(duì)接表Table 1 Docking of key active molecules and targets

3 討論

慢性萎縮性胃炎以胃黏膜層慢性炎癥為特征，伴有胃腺細(xì)胞的喪失，被腸型上皮、幽門型腺體或纖維組織替代[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為此病的病位雖在胃，但導(dǎo)致患病的根本原因是肝脾功能失調(diào)，如肝氣橫逆，木旺乘土；或肝火亢盛，灼傷胃陰；肝血瘀阻，胃失滋養(yǎng)，均可致胃土壅滯，不通則痛[4]。四逆胃痛顆粒方中柴胡、枳實(shí)和白芍共為君藥。其中柴胡疏肝解郁，升提中氣；配伍枳實(shí)通降消滯，加強(qiáng)行氣解郁之功；配伍白芍酸甘化陰，柔肝和脾，緩急止痛；三棱、莪術(shù)共為臣藥，氣血雙施，活血化瘀，行氣止痛，化積消癥力彰；黃芪、木香和白花蛇舌草共為使藥，有健脾益氣，行氣解毒之效；甘草作為佐藥，既可瀉火安神又能調(diào)和藥性。

為了進(jìn)一步研究與探討四逆胃痛顆粒治療慢性萎縮性胃炎的藥效基礎(chǔ)及潛在的生物學(xué)機(jī)制，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出藥效靶點(diǎn)，并與疾病靶點(diǎn)交集，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用基因靶點(diǎn)富集分析及通路預(yù)測(cè)等手段，得到槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮甲等核心活性成分。KIMTW等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過降低胃酸，發(fā)揮抗?jié)兒臀葛つけＷo(hù)的作用，進(jìn)而抑制大鼠反流性食管炎和胃炎。亦有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可有效抑制幽門螺旋桿菌，而幽門螺旋桿菌與萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[6]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，增加甘草查爾酮甲的甘草提取物具有抗氧化、抗炎和抗誘變作用，同時(shí)甘草查爾酮甲可抑制Akt、ERK和NF-B等多種信號(hào)通路來抑制幽門螺桿菌引起的胃炎或腫瘤發(fā)生[7,8]。

PPI分析結(jié)果顯示，四逆胃痛顆粒可能是通過作用PTGS2、AKT1和MAK1等關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點(diǎn)來治療慢性萎縮性胃炎。其中PTGS2是一種誘導(dǎo)酶，通常由炎癥因子（Ifs）觸發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)PTGS2蛋白水平隨著胃黏膜病變的惡化而逐漸升高，尤其是在感染幽門螺旋桿菌的情況下，在胃癌前病變?cè)缙诟弑磉_(dá)[9-13]。因此，誘導(dǎo)PTGS2可能是胃癌早期發(fā)病的關(guān)鍵因素。AKT蛋白在大多數(shù)癌癥類型中都高度表達(dá)，包括HCC、肺癌、乳腺癌以及結(jié)腸癌，其中AKT1是治療癌癥的主要藥物靶點(diǎn)，在細(xì)胞增殖和抗凋亡的過程中發(fā)揮作用。與正常黏膜相比，CAG大鼠胃黏膜中AKT1的表達(dá)上調(diào)，結(jié)果提示這些蛋白可能參與了惡性轉(zhuǎn)化[14]。

GO生物富集分析結(jié)果顯示，四逆胃痛顆粒的21個(gè)核心靶點(diǎn)主要作用于促進(jìn)炎癥修復(fù)、延緩萎縮性胃炎引起的黏膜萎縮，延緩細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、趨化因子合成和生物合成調(diào)控的生物學(xué)過程，以及實(shí)現(xiàn)酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等分子功能的過程。

KEGG結(jié)果中分析發(fā)現(xiàn)四逆胃痛顆粒主要通過調(diào)控癌癥信號(hào)通路（Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Bladder cancer）、炎癥信號(hào)通路（TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway）和細(xì)胞增殖信號(hào)通路（MAPKsignaling pathway）等發(fā)揮其抗癌、抗炎和免疫抑制的作用。其中TNF信號(hào)通路與四逆胃痛顆粒治療萎縮性胃炎的15個(gè)靶點(diǎn)密切相關(guān)，其中IL-6是TNF信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)。目前已知TNF家族中有約30種生物活性因子，其中主要包括TNF-和TNF-，大量研究表明CAG胃黏膜中TNF-水平較正常顯著升高[15,16]，且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)攜帶TNF-等位基因的萎縮性胃炎患者中患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。PI3K/Akt通路能夠調(diào)控萎縮性胃炎和胃癌胃黏膜的損傷程度，當(dāng)PI3K激活后，在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸酯，該蛋白與信號(hào)蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性激酶1結(jié)合，后者在細(xì)胞中含有PH結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Akt激活，從而調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[18]。

綜上所述，四逆胃痛顆?？赡芡ㄟ^槲皮素、山柰酚等活性成分，作用于PTGS2、MAK1和AKT1等靶點(diǎn)，并通過調(diào)控TNF和PI3K/Akt等信號(hào)通路來治療萎縮性胃炎，這種作用機(jī)制體現(xiàn)了中藥復(fù)方治療疾病多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，可為探究四逆胃痛顆粒治療萎縮性胃炎提供理論依據(jù)。