不同品種水貂對(duì)阿留申病抗病性的聯(lián)合檢疫分析

趙永強(qiáng)，吳艷虹，章秀婷，韋韜，彭倩文，任二軍，叢麗，邵西群※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112；3.河北省毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050041）

水貂阿留申病（aleutian disease,AD）是由水貂阿留申病毒（aleutian mink disease virus,AMDV）感染引起的慢性消耗性疾病，在成年水貂體內(nèi)病毒呈持續(xù)性感染導(dǎo)致漿細(xì)胞彌漫性增生，產(chǎn)生的高水平病毒抗體與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積于腎臟，導(dǎo)致腎小球腎炎[1-3]，在我國(guó)感染率高，對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害[4]。中國(guó)長(zhǎng)期養(yǎng)殖水貂，阿留申病毒感染嚴(yán)重，CIEP檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)40%～80%[5,6]，高感染率貂場(chǎng)達(dá)100%。水貂阿留申病目前無(wú)有效疫苗，主要通過(guò)聯(lián)合檢疫來(lái)淘汰、凈化阿留申病貂群。常用的檢測(cè)方法有碘凝集反應(yīng)（IAT）、對(duì)流免疫電泳（CIEP）以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。IAT最早被用于阿留申病的診斷，通過(guò)檢測(cè)阿留申病貂血清中高濃度-球蛋白間接診斷阿留申病，由于導(dǎo)致高-球蛋白血癥不是阿留申病特有的特征，所以IAT檢測(cè)不具有特異性[7,8]。CIEP通過(guò)檢測(cè)水貂血清中病毒抗體來(lái)診斷阿留申病，特異性強(qiáng)，被廣泛用于阿留申病的診斷與凈化[9]，但針對(duì)感染初期未產(chǎn)生抗體的水貂容易造成漏檢，還容易忽略動(dòng)物的免疫力造成很大一部分抗體陽(yáng)性的非患病貂（CIEP+IAT PCR）被淘汰。PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，可直接檢測(cè)水貂體內(nèi)阿留申病毒，常被用于AMDV的核酸檢測(cè)[10-12]。

利用單一檢疫的方法不能全面判斷水貂ADV的感染狀態(tài)，經(jīng)聯(lián)合檢疫發(fā)現(xiàn)貂場(chǎng)中存在5種感染狀態(tài)的貂群，分別為CIEP IAT PCR、CIEP IAT PCR+、CIEP+IAT+PCR+、CIEP+IAT PCR+和CIEP+IAT PCR貂群。與CIEP IAT PCR無(wú)感染貂比較，阿留申病貂血液中形成阿留申病毒及其抗體免疫復(fù)合物，檢測(cè)呈現(xiàn)CIEP+IAT+PCR+感染狀態(tài)，產(chǎn)仔成活數(shù)明顯下降[3,13]?？贵w呈陽(yáng)性的CIEP+貂群中存在感染AMDV而無(wú)癥狀貂[14,15]，水貂血清-球蛋白正常，產(chǎn)仔成活數(shù)不受影響。養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)CIEP+IAT PCR和CIEP+IAT PCR+貂群對(duì)貂場(chǎng)留種具有很大價(jià)值，其中CIEP+IAT PCR貂群曾感染AMDV，抗體呈陽(yáng)性，但血清中-球蛋白含量正常，且外周血中檢測(cè)不到病毒，產(chǎn)仔性能好，這部分貂群中存在一定比例的AMDV抗性貂[16-19]；CIEP+IAT PCR+貂群感染AMDV，抗體呈陽(yáng)性，血清中-球蛋白含量正常，病毒僅低水平存在于淋巴組織，對(duì)繁殖性能影響較低，表現(xiàn)對(duì)AMDV耐受性[15,20]，留種這部分水貂對(duì)提高貂群整體的免疫力和對(duì)抗AMDV有很大幫助。若采用單一的抗體檢測(cè)留種CIEP貂群，而剔除CIEP+的抗性貂和耐受貂，強(qiáng)化了貂群對(duì)AMDV的易感性，環(huán)境中殘留的病毒或者外來(lái)病毒的入侵容易造成CIEP貂群暴發(fā)感染[18]。本研究利用多年來(lái)對(duì)遼寧、吉林不同貂場(chǎng)聯(lián)合檢疫數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析不同品種的貂感染狀態(tài)的動(dòng)態(tài)分布，不同貂種AMDV抗性貂（CIEP+IAT PCR）比例和變化規(guī)律，旨在研究不同貂種對(duì)水貂阿留申病的抗性差異，為實(shí)際生產(chǎn)中貂場(chǎng)留種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

從2017年12月至2020年12月，分別對(duì)吉林、遼寧省多個(gè)高感染率貂場(chǎng)不同品種水貂于11～12月份進(jìn)行檢疫。大連A場(chǎng)已連續(xù)開展多年的聯(lián)合檢疫淘汰的防控措施，2018年采集5 633只3個(gè)品種的水貂血液，其中金州黑貂3 941只，銀藍(lán)貂1 179只，咖啡貂513只；2019年采集2 388只，其中金州黑貂1 585只，銀藍(lán)貂219只，咖啡貂584只。吉林B場(chǎng)本地貂采集262只，其中長(zhǎng)毛褐貂119只，金州黑貂122只，銀藍(lán)貂21只。2020年沈陽(yáng)C場(chǎng)為丹麥引種貂在國(guó)內(nèi)已養(yǎng)殖3年，采集454只，其中銀藍(lán)貂117只，白貂165只，咖啡貂172只。2018年沈陽(yáng)D貂場(chǎng)為在國(guó)內(nèi)已養(yǎng)殖5年的引種貂，采集1 642只白貂血液。各貂場(chǎng)水貂為大于2年齡的經(jīng)產(chǎn)貂和7月齡的當(dāng)年貂。

采血操作：對(duì)水貂個(gè)體逐一編號(hào)，使用含促凝劑的采血管，采用剪趾法進(jìn)行血液采集，將采集的新鮮血液放4℃冰箱過(guò)夜自然沉降析出血清或于500 g（Eppendorf 5804/5804R，德國(guó)）離心10 min收集上層血清，將血清放于﹣20℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑和儀器

血液DNA直接PCR試劑盒購(gòu)自遼寧生物醫(yī)藥有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、DL1000 DNA Marker購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；分析純KI2和I2購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖購(gòu)自全式金（北京）生物技術(shù)有限公司。AMDV-G株CIEP抗原、AMDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存，AMDV-G株CIEP抗原、AMDV標(biāo)準(zhǔn)抗原和陰、陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI上公布的阿留申病毒的序列信息，在保守區(qū)域篩選引物，并通過(guò)Oligo 7.0進(jìn)行引物驗(yàn)證。上游引物AV3F為：5′-caccaacaagtaatgacaccttggt-3′，下游引物AV3R為：5′-ggttggtttggttgctctccaagga-3′，擴(kuò)增子長(zhǎng)度約為350 bp，引物由寶生物公司合成。

1.4 水貂阿留申病的IAT、CIEP檢測(cè)

水貂血清樣品進(jìn)行IAT檢測(cè)，按照參考文獻(xiàn)[11]配置碘試劑。取10L水貂血清與等量配置的碘試劑混勻，5 min內(nèi)出現(xiàn)沉淀則判定為IAT陽(yáng)性。

水貂血清樣品進(jìn)行CIEP檢測(cè)，試驗(yàn)參照《水貂阿留申病對(duì)流免疫電泳操作規(guī)程SN/T 1314-2003》進(jìn)行。使用本實(shí)驗(yàn)室保存的AMDV標(biāo)準(zhǔn)抗原和陰、陽(yáng)性血清作為陰、陽(yáng)性對(duì)照，按規(guī)程判定結(jié)果。若第1次檢測(cè)陰性，第2次檢測(cè)為陽(yáng)性，則補(bǔ)測(cè)1次，再次檢測(cè)出現(xiàn)沉淀線則判定CIEP陽(yáng)性，反之判定為陰性。

1.5 水貂血清中AMDV的PCR檢測(cè)

隨機(jī)選取不同貂場(chǎng)檢出的CIEP+IAT和CIEP+IAT+樣品，利用血液DNA直接PCR試劑盒，對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，將本實(shí)驗(yàn)室保存的AMDV陽(yáng)性和陰性血清樣本分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。PCR總反應(yīng)體系為40L，3.6L核酸釋放劑加入到2.0L血清樣本中裂解10 min。PCR反應(yīng)液由32L PCR reaction buffer，上下游引物各20 pmol，1L Taq酶，加無(wú)核酸的水至總反應(yīng)體系為40L。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min預(yù)變性，94℃40 s變性，55℃35 s退火，72℃30 s延伸，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳驗(yàn)證。

1.6 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)3種聯(lián)合檢疫方法對(duì)4個(gè)貂場(chǎng)不同貂種存在的不同感染狀態(tài)分類，并計(jì)算CIEP+IAT貂群、CIEP+IAT PCR貂群在不同品種水貂群中所占比例。利用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件分析每個(gè)貂場(chǎng)不同品種水貂群主要感染狀態(tài)的差異，利用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同貂種CIEP+IAT貂群的差異分析

經(jīng)檢疫發(fā)現(xiàn)，4個(gè)高感染率貂場(chǎng)的CIEP檢疫陽(yáng)性貂群中不同品種水貂IAT檢疫陰性率存在差異，4個(gè)貂場(chǎng)不同品種的經(jīng)產(chǎn)貂和當(dāng)年貂AD的CIEP、IAT檢疫結(jié)果見表1和表2。

A場(chǎng)2018年檢疫結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂58.4%＞銀藍(lán)貂46.1%＞咖啡貂38.6%（P＜0.01）；當(dāng)年貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂37%＞銀藍(lán)貂20.8%（P＜0.01）。A場(chǎng)經(jīng)2018年檢疫篩選保留CIEP+IAT貂，2019年檢疫結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂87.8%＞銀藍(lán)貂54.7%＞咖啡貂45.2%（P＜0.01）；當(dāng)年貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂64.7%＞銀藍(lán)貂53.1%＞咖啡貂44.6%（P＜0.01）。經(jīng)CIEP+IAT貂選種后，2019年貂群平均窩產(chǎn)仔成活數(shù)3.7只/窩，較2018年貂群平均產(chǎn)仔成活數(shù)3.2只/窩有所提高。

B場(chǎng)檢疫結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)貂CIEP+IAT群體占比排序，長(zhǎng)毛褐貂92.3%＞銀藍(lán)貂87.5%＞金州黑貂54.3%（P＜0.01）；當(dāng)年貂CIEP+IAT群體占比排序，長(zhǎng)毛褐貂80%＞銀藍(lán)貂53.8%＞金州黑貂50%（P＜0.01）。貂群平均產(chǎn)仔成活數(shù)，長(zhǎng)毛貂約4.5只/窩，銀藍(lán)貂約4.0只/窩，金州黑貂約3.5只/窩。

C場(chǎng)檢疫結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)貂CIEP+IAT群體占比排序，銀藍(lán)貂54.7%＞白貂42.5%＞咖啡貂37.2%（P＜0.05）；全場(chǎng)貂群平均產(chǎn)仔數(shù)約在2～3只/窩。

D場(chǎng)檢疫結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)白貂CIEP+IAT占比46.7%，經(jīng)CIEP+IAT選種后，白貂群平均產(chǎn)仔成活數(shù)提高約1只/窩。

綜合這4個(gè)貂場(chǎng)的檢疫結(jié)果表明，長(zhǎng)毛褐貂和金州黑貂的IAT檢疫陰性率較高，其次為銀藍(lán)貂、白貂和咖啡貂，經(jīng)產(chǎn)貂和當(dāng)年貂均呈現(xiàn)這種趨勢(shì)。其中A場(chǎng)金州黑貂、B場(chǎng)均為本地化貂、D場(chǎng)白貂為本地化貂，其他水貂均為引種貂，結(jié)果表明本地化貂群中CIEP+IAT群體占比明顯高于引種貂群（圖1），且D場(chǎng)經(jīng)本地化飼養(yǎng)選種后CIEP+IAT貂群的比例較C場(chǎng)白貂高出7.7%（表1），并且各貂場(chǎng)不同品種經(jīng)產(chǎn)貂CIEP+IAT群體占比普遍高于當(dāng)年貂（表1、表2）。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，在高感染率貂場(chǎng)，不同品種水貂中CIEP+IAT群體占比存在明顯差異，且經(jīng)過(guò)本地化飼養(yǎng)后的長(zhǎng)毛褐貂、金州黑貂群體中CIEP+IAT貂比例較高。

表1 經(jīng)產(chǎn)貂CIEP和IAT聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果Table 1 The combined detection result by CIEP and IAT in multiparous mink groups

表2 當(dāng)年貂CIEP和IAT聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果Table 2 The combined detection result by CIEP and IAT in yearling mink groups

圖1 不同貂種CIEP+IAT分布Fig.1 CIEP+IAT distribution of different mink species

2.2 CIEP+IAT-和CIEP+IAT+貂群的PCR檢測(cè)分析

隨機(jī)選取不同貂場(chǎng)部分CIEP+IAT血清樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。綜合2.1及本結(jié)果分析顯示，A場(chǎng)經(jīng)CIEP+IAT選擇留種后，CIEP+IAT貂群的PCR比例提高；不同貂場(chǎng)CIEP+IAT貂群中PCR比例較高，主要在59.6%～93.8%（表3）；而隨機(jī)抽取的CIEP+IAT+貂群PCR+比例普遍偏高，主要在52.5%～100%（表4、圖2），證實(shí)了CIEP+IAT貂群中PCR比例高，指示CIEP+IAT貂群的病毒檢出率低。例外的，經(jīng)CIEP+IAT留種選擇后檢測(cè)到的CIEP+IAT+貂的PCR+比例降低，如A場(chǎng)銀藍(lán)貂、金州黑貂CIEP+IAT+PCR+比例（表4），顯示貂群整體的病毒載量下降。檢疫結(jié)果表明，不同高感染率貂場(chǎng)的不同品種水貂CIEP+IAT PCR貂群的比例存在明顯差異，本地化貂種CIEP+IAT PCR占比較高，其中B場(chǎng)金州黑貂93.8%、長(zhǎng)毛褐貂占71.4%，D場(chǎng)白貂占71.9%（圖2）。C場(chǎng)檢疫結(jié)果顯示，不同貂種CIEP+IAT PCR占比排序?yàn)椋y藍(lán)貂80%＞白貂70.1%＞咖啡貂59.6%（P＜0.05）。結(jié)合多年生產(chǎn)實(shí)踐記錄發(fā)現(xiàn)，本地化長(zhǎng)毛褐貂產(chǎn)仔成活平均數(shù)約4.5只/窩，本地化金州黑貂約4只/窩；而丹麥引種貂在國(guó)外產(chǎn)仔成活數(shù)平均在5～6只/窩，引入國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖2～3年后由于阿留申病毒的感染增加，白貂產(chǎn)仔存活數(shù)在2～3只/窩、咖啡貂約2只/窩，在高感染場(chǎng)新引種母貂平均產(chǎn)仔成活數(shù)下降明顯。由此可見，經(jīng)本地化飼養(yǎng)的貂群生產(chǎn)性能普遍高于新引種貂群且貂群中抗性貂比例較高。綜合幾個(gè)貂場(chǎng)檢疫結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)踐表明，不同貂種中CIEP+IAT PCR貂群比例差異明顯，且比例越高，表現(xiàn)為該貂種對(duì)水貂阿留申病的抗性越強(qiáng)，長(zhǎng)毛褐貂和金州黑貂為本地化貂，貂場(chǎng)每年選取健康狀況良好、產(chǎn)仔＞4只/窩的母貂進(jìn)行留種，經(jīng)過(guò)連續(xù)多年的篩選留種貂抗性明顯高于引種貂，并且產(chǎn)仔存活數(shù)高。

圖2 CIEP+IAT和CIEP+IAT+貂群中PCR檢測(cè)分布Fig.2 The distribution of PCR detection to CIEP+IAT and CIEP+IAT+mink groups

表3 CIEP+IAT―貂群PCR檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of PCR detection to CIEP+IAT―mink group

表4 CIEP+IAT+貂群PCR檢測(cè)結(jié)果Table 4 The results of PCR detection to CIEP+IAT+mink group

3 討論

3.1 本研究通過(guò)對(duì)遼寧、吉林不同高感染率貂場(chǎng)的CIEP、IAT和PCR聯(lián)合檢疫數(shù)據(jù)分析，在高感染率貂場(chǎng)，聯(lián)合檢疫發(fā)現(xiàn)CIEP+IAT貂群中PCR比例高指示病毒檢出率低，通過(guò)CIEP+IAT選種留種，各貂種中CIEP+IAT和CIEP+IAT PCR貂的比例提高顯著[17]，且CIEP+IAT無(wú)癥狀貂的平均窩產(chǎn)仔成活數(shù)接近未感染貂。山東某貂場(chǎng)經(jīng)5年CIEP+IAT貂選種留種，其比例從25%提高到75%，CIEP+IAT貂群比例提高顯著，貂群平均產(chǎn)仔成活數(shù)從2～3只/窩提高到4～5只/窩，且CIEP+IAT無(wú)癥狀貂的平均窩產(chǎn)仔成活數(shù)接近未感染貂。因此血樣聯(lián)合檢疫呈現(xiàn)CIEP+IAT PCR狀態(tài)可作為抗病性貂的篩選指標(biāo)；通過(guò)聯(lián)合檢疫技術(shù)選擇阿留申抗病貂適合高感染貂場(chǎng)選種應(yīng)用。本地化貂群中AMDV抗性貂（CIEP+IAT PCR）比例為58.4%～92.3%。長(zhǎng)毛褐貂和金州黑貂為本地化水貂，經(jīng)過(guò)逐代選種，其CIEP+IAT PCR抗病貂比例高，貂群平均產(chǎn)仔成活數(shù)也提高。而國(guó)外引種貂采用抗體陽(yáng)性淘汰凈化選種，大量CIEP+的抗性貂和耐受貂被淘汰，導(dǎo)致群體對(duì)AMDV的易感性增強(qiáng)[18]；在高感染率貂場(chǎng)環(huán)境被病毒污染，引種貂群自然感染條件下符合抗病指標(biāo)的水貂比例低，且產(chǎn)仔成活數(shù)低。在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)耐受貂和抗性貂在生產(chǎn)性能、產(chǎn)仔存活數(shù)方面略低于無(wú)感染貂，對(duì)貂場(chǎng)具有留種意義。

3.2 A場(chǎng)有本地化的金州黑貂、國(guó)外引種的銀藍(lán)貂和咖啡貂，本地貂阿留申病抗病性優(yōu)于引種貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。A場(chǎng)經(jīng)過(guò)抗病貂CIEP+IAT初選留種，與2018比較，2019年金州黑貂CIEP+IAT PCR比例提高了8.7%，銀藍(lán)貂提高了31.7%，咖啡貂提高46.9%，表明抗病性篩選效果顯著。B場(chǎng)均為本地化貂，顯示抗病性金州黑貂＞長(zhǎng)毛褐貂＞銀藍(lán)貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。C場(chǎng)引種貂抗病性比較，銀藍(lán)貂＞白貂＞咖啡貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。與C場(chǎng)比較，D場(chǎng)經(jīng)本地化飼養(yǎng)選種的白貂CIEP+IAT PCR比例高出1.8%，抗病性增強(qiáng)。聯(lián)合檢疫還發(fā)現(xiàn)，在同種環(huán)境下每個(gè)貂場(chǎng)不同品種的經(jīng)產(chǎn)貂抗病性均高于當(dāng)年貂，CIEP+IAT高出比例為0.6%～33.7%。在檢疫中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CIEP+IAT選擇留種后檢測(cè)到的CIEP+IAT+貂的PCR+比例降低，見表4中A場(chǎng)銀藍(lán)貂、金州黑貂CIEP+IAT+PCR+比例，顯示貂群整體的病毒載量下降。在東北主養(yǎng)殖區(qū)高感染環(huán)境下，本地化貂抗病性強(qiáng)是經(jīng)歷長(zhǎng)期抗病表型篩選的積累結(jié)果，采用聯(lián)合檢疫選擇抗病貂對(duì)提高貂群阿留申病抗病性效果明顯。水貂感染AMDV后感染發(fā)展類型受多種因素的影響，主要與病毒的致病力、水貂自身的免疫力以及環(huán)境因素等相關(guān)。不同品種貂的抗病性差異除受選種方法影響外，各品種抗病性主要由控制抗病性的基因決定，具體抗病基因差異是深入研究的方向。

4 結(jié)論

綜上所述，針對(duì)高感染率的貂場(chǎng)，由于CIEP檢疫陽(yáng)性率高，所以僅利用CIEP檢疫淘汰阿留申病貂并不適合，容易淘汰大量的CIEP+無(wú)阿留申病貂，建議高感染貂場(chǎng)采用聯(lián)合檢疫的方法選擇CIEP+IAT PCR貂，并結(jié)合其生產(chǎn)性能留種。本地化的長(zhǎng)毛褐貂、金州黑貂和白貂中CIEP+IAT PCR貂群對(duì)阿留申病的抗性較強(qiáng)，建議貂場(chǎng)多篩選AMDV抗性貂進(jìn)行留種。對(duì)引種的銀藍(lán)、咖啡和白貂，加強(qiáng)CIEP+IAT PCR抗病貂選種，以此來(lái)提高貂群的整體健康狀況和生產(chǎn)性能。