肺氣腫動(dòng)物模型研究進(jìn)展

羅麗娟 陳燕

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以長(zhǎng)期肺通氣不足，持續(xù)慢性氣道炎癥導(dǎo)致肺組織破壞和肺功能下降為特點(diǎn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。COPD的高發(fā)病率及病亡率，給患者和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)[1-2]。COPD可由多種因素誘導(dǎo)，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫衰老異常等[3]。然而其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，通過(guò)建立有效的動(dòng)物模型，有助于我們進(jìn)一步了解和探索其生理和病理機(jī)制，為疾病的治療與預(yù)防提供新思路及科學(xué)理論依據(jù)。肺氣腫作為COPD的主要病理特征，一直是COPD發(fā)生機(jī)制的研究重點(diǎn)。為了探索COPD的病因和發(fā)病機(jī)制，許多學(xué)者對(duì)肺氣腫的動(dòng)物模型進(jìn)行了相關(guān)研究。盡管這些模型僅模仿了COPD的某些特征，但它們對(duì)于進(jìn)一步研究人類(lèi)COPD的發(fā)病機(jī)制非常有意義。因此，筆者將著重對(duì)肺氣腫動(dòng)物模型研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

肺氣腫動(dòng)物模型的選擇

目前，用于肺氣腫的動(dòng)物模型常見(jiàn)的有小鼠[4]與大鼠[5]，也有應(yīng)用綿羊[6]、狗[7]、兔[8]、豚鼠[9]等來(lái)建模。動(dòng)物模型可以在一定程度上反映人類(lèi)疾病的病理和生理學(xué)特征。肺氣腫的大多數(shù)特征，如炎性細(xì)胞聚集[10]、氧化應(yīng)激[11]、細(xì)胞因子和蛋白酶的產(chǎn)生[12]、小氣道和血管重塑[13]，以及肺功能下降[4]，可以在不同的模型中誘導(dǎo)。

小鼠用于構(gòu)建肺氣腫模型已被廣泛研究，小鼠的基因組較其他動(dòng)物與人類(lèi)更為接近[14]，并具有相對(duì)較為廣泛的基因、蛋白質(zhì)序列、抗體可用性，且小鼠用于建模的成本較低，最重要的是，目前存在許多小鼠種屬的可供研究選擇，并且根據(jù)研究目的不同可構(gòu)建特定的小鼠，從而更好地闡明某些特定基因在肺氣腫發(fā)病中的作用。因此，小鼠被認(rèn)為更適合肺氣腫的實(shí)驗(yàn)研究。

大鼠的體積相對(duì)小，建模成本低，建模周期短，且基因組與人類(lèi)相似。有研究指出，暴露于香煙煙霧(CS)僅2個(gè)月就可出現(xiàn)肺氣腫的表現(xiàn)，這比豚鼠和小鼠的煙熏建模時(shí)間相對(duì)較短[15]。但大鼠也有其自身的局限性。大鼠的支氣管分支很少，氣管內(nèi)纖毛分布較少，腺黏膜下腺體不成熟，氣管黏膜下沒(méi)有杯狀細(xì)胞，且大鼠支氣管炎癥介質(zhì)也與人類(lèi)不同[16]。此外，研究者認(rèn)為大鼠在建模過(guò)程會(huì)出現(xiàn)輕微的疾病，如果煙霧暴露過(guò)多，會(huì)產(chǎn)生非特異性顆粒過(guò)載效應(yīng)[17]。

豚鼠建模具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于識(shí)別的肺氣腫，比小鼠更明顯的小氣道重塑，以及氣道中相當(dāng)大的杯狀細(xì)胞化生的發(fā)展[18]。研究指出，長(zhǎng)期暴露于CS的豚鼠可出現(xiàn)肺部炎癥、肺動(dòng)脈血壓升高和肺血管肌肉化、小氣道重塑和肺氣腫，并與肺功能改變(如阻力增加)相關(guān)[19-20]。其主要的缺點(diǎn)是成本高，且缺乏進(jìn)行分子研究的工具，以及與豚鼠蛋白交叉反應(yīng)的商業(yè)抗體數(shù)量有限。

肺氣腫動(dòng)物模型的制備

一、CS暴露誘發(fā)的肺氣腫模型

根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，大約90%的COPD患者是吸煙者。吸煙是肺氣腫的最重要危險(xiǎn)因素之一[21]。長(zhǎng)期接觸CS的動(dòng)物可能導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)，其主要是由巨噬細(xì)胞刺激引起的，肺組織病理表現(xiàn)為支氣管腔變窄，支氣管軟骨組織受損，導(dǎo)致肺泡破裂和(或)融合以及肺氣腫的形成，這類(lèi)似于人類(lèi)對(duì)吸煙產(chǎn)生的反應(yīng)[22]。CS暴露誘發(fā)的肺氣腫可以盡可能模擬人類(lèi)肺氣腫的發(fā)病機(jī)理，為人類(lèi)肺氣腫的基礎(chǔ)和臨床研究提供基礎(chǔ)。CS暴露方法因其成本低、操作簡(jiǎn)單、成功率高而被廣大研究者接受，并且可以消除客觀環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)差異。肺氣腫動(dòng)物模型的CS暴露時(shí)間長(zhǎng)短由于香煙種類(lèi)不同，暴露方式、持續(xù)時(shí)間和頻率不同，煙氣密度不同，動(dòng)物的物種和年齡不同而有所不同。

1.部分(僅鼻子或頭部)暴露法：C57BL/6J小鼠通過(guò)鼻吸入CS， 2次/d，2支香煙/次，10支噴霧劑/香煙，5 d/周。暴露4個(gè)月后，小鼠肺組織病理結(jié)果表明肺泡隨著吸煙時(shí)間的增加而增大。同時(shí)，吸煙小鼠肺組織中的B淋巴細(xì)胞增加，與人類(lèi)肺氣腫相似[23]。

2.全身暴露法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為一個(gè)整體放置在吸煙盒(裝滿煙的盒子)中。C57BL/6J小鼠暴露于CS中，每天吸煙3次，3支香煙/次。8周后，觀察到肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化，并伴有肺泡巨噬細(xì)胞增多，細(xì)胞外基質(zhì)變化和MMP-12表達(dá)增加[24]；或C57BL/6J小鼠每天吸煙2次，5支香煙/次，每周6天，暴露12周，觀察小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡腔增大、肺泡間隔變窄等病理變化[25]。

二、香煙煙霧提取物(cigarette-smoke-extract，CSE)腹腔注射誘導(dǎo)的肺氣腫模型

既往研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔內(nèi)注射CSE可產(chǎn)生顯著的肺氣腫，假設(shè)CSE可以作為抗原，觸發(fā)免疫反應(yīng)引起肺氣腫樣改變，僅用了6周就成功建立肺氣腫模型[26]。此外，有研究指出，腹膜內(nèi)注射CSE構(gòu)建肺氣腫小鼠模型，建模結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行肺功能檢測(cè)、收集血液，支氣管肺泡灌洗液和肺組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，腹膜內(nèi)注射CSE可導(dǎo)致肺功能下降、肺泡間隙增大、肺泡壁破壞、肺組織細(xì)胞凋亡、慢性肺部炎癥、氧化應(yīng)激水平增加等[4, 25, 27-30]。這種建模方法的有效性與CS暴露誘發(fā)的肺氣腫動(dòng)物模型有效性相當(dāng)，相較于傳統(tǒng)的CS暴露建模，腹腔注射CSE建模明顯縮短了建模周期[25]。

在C57BL/6J或者BALB/c小鼠腹腔注射CSE(CSE制備：5支香煙溶于10 ml磷酸鹽緩沖液里，經(jīng)濾嘴過(guò)濾后使用，每次注射前現(xiàn)配現(xiàn)用)，建模為期4周。模型組在第1天、第11天、第22天進(jìn)行CSE腹腔注射，對(duì)照組則注射生理鹽水或磷酸鹽緩沖液；第29天，建模結(jié)束，根據(jù)研究目的對(duì)小鼠進(jìn)行相應(yīng)的處理及收集樣本[25]。

三、彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫模型

氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶破壞了肺組織中蛋白酶-抗蛋白酶之間的平衡，不僅破壞了保護(hù)肺組織免受損傷的主要因素，而且還產(chǎn)生了大量的炎癥因子，加速了肺泡壁的破裂與融合，從而誘發(fā)肺氣腫。常用的彈性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶(pig pancreatic elastinase，PPE)等。用彈性蛋白酶構(gòu)建肺氣腫動(dòng)物模型的方法具有操作簡(jiǎn)單和建模周期較短等優(yōu)點(diǎn)。因此，直接氣管內(nèi)滴入彈性蛋白酶是誘導(dǎo)肺氣腫動(dòng)物模型的常見(jiàn)有效方法之一。

木瓜蛋白酶是一種來(lái)自植物的蛋白水解酶，是最早用于誘導(dǎo)肺氣腫模型的彈性蛋白酶。2 mg/kg木瓜蛋白酶溶液一次性經(jīng)氣管滴入建立穩(wěn)定肺氣腫模型，為期1周[31]。

PPE不僅可以充當(dāng)?shù)鞍酌竵?lái)破壞蛋白酶-抗蛋白酶失衡，還可以作為氧化劑來(lái)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，在二者共同作用下，動(dòng)物模型中的肺泡顯著增大。因此，PPE常被用來(lái)誘發(fā)肺氣腫。PPE誘導(dǎo)途徑主要包括氣管內(nèi)滴注、氣管切開(kāi)注射、霧化吸入。PPE濃度為0.6 IU左右，為期4～6周[32-34]。

四、化學(xué)物質(zhì)刺激誘導(dǎo)的肺氣腫模型

許多化學(xué)物質(zhì)，包括NO2、脂多糖(LPS)、氯化鉻(CdCl2)等都可能引起炎癥和肺氣腫。小鼠長(zhǎng)期暴露于NO2(NO2體積分?jǐn)?shù)20×106，每天14 h，持續(xù)25 d)后，通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激可引起小鼠肺氣腫[35]；LPS(1 mg/kg的50 μl無(wú)菌生理鹽水溶液稀釋)主要通過(guò)刺激嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞引起氣道和肺組織炎癥，釋放出一系列炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等，引發(fā)蛋白酶-蛋白酶失衡，最終發(fā)生肺氣腫[36]。將0.5 ml 0.025% CdCl2溶液一次性滴入小鼠的氣管中可以誘導(dǎo)出肺氣腫的動(dòng)物模型[37]。

表1 各種動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)

五、與基因相關(guān)誘導(dǎo)的肺氣腫模型

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因敲除誘導(dǎo)的肺氣腫動(dòng)物模型已被廣泛用于肺氣腫的研究。利用基因靶向和(或)轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為研究不同疾病的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)的主要技術(shù)方法。有研究指出，Abhd2基因敲除小鼠由于炎性細(xì)胞因子和蛋白酶基因的過(guò)度表達(dá)、巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞凋亡異常，以及缺乏對(duì)蛋白酶抑制劑的抵抗力，導(dǎo)致小鼠肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化[38]。并且這些改變與臨床上肺氣腫發(fā)生發(fā)展具有相似之處。血小板源性生長(zhǎng)因子-β(PDGF-β)和TNF-α等可能干擾肺泡的正常發(fā)育，且既往研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的過(guò)度表達(dá)可能破壞肺泡受損和修復(fù)兩者之間的平衡，導(dǎo)致肺氣腫的形成[39]。

上述5種肺氣腫動(dòng)物模型制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)具體見(jiàn)表1。

肺氣腫動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

建立動(dòng)物模型之后，需要進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)估以判斷模型是否構(gòu)建成功。常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)包括肺功能指標(biāo)、氣道炎癥指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)和病理形態(tài)指標(biāo)。肺功能指標(biāo)包括記錄氣道阻力(Raw)、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)、呼氣峰流量(PEF)、吸氣時(shí)間/呼氣時(shí)間(Ti/Te)和血?dú)夥治鯷40-42]。氣道炎癥指標(biāo)包括肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)、TGF-β、IL-6、IL-8、TNF-α等[4, 43]，以及彈性蛋白酶、組織蛋白酶和單核細(xì)胞趨化性蛋白1[44-45]。氧化應(yīng)激指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)與活性氧(ROS)、核因子相關(guān)因子2[46-48]。病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括平均線性截距(MLI)、破壞性指數(shù)(DI)、凋亡指數(shù)(AI)和呼吸道的病理評(píng)分[27, 29, 49]。

肺氣腫是肺實(shí)質(zhì)的一種破壞性過(guò)程，其特征是終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的間隙永久性增大伴隨肺泡壁的破壞[50]。成功的肺氣腫動(dòng)物模型表現(xiàn)為肺功能降低、炎癥指標(biāo)升高、氧化應(yīng)激水平增加和肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯。然而，肺功能檢測(cè)被認(rèn)為不如形態(tài)學(xué)變化指標(biāo)敏感，可能只在嚴(yán)重的氣道重塑或肺實(shí)質(zhì)破壞中檢測(cè)到，而在輕度肺氣腫動(dòng)物模型中肺功能可能正常[18]。有研究者指出微觀結(jié)構(gòu)的定量評(píng)估是證明肺氣腫改變存在的一種有效方法[51]。目前，尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)判肺氣腫模型。但是考慮到各種參數(shù)的可及性、客觀性和穩(wěn)定性，我們認(rèn)為病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)(包括MLI、DI、AI)的變化是評(píng)估建立肺氣腫動(dòng)物模型的最重要參數(shù)。

總結(jié)與展望

吸煙是肺氣腫發(fā)病最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素。CS暴露被認(rèn)為是構(gòu)建肺氣腫動(dòng)物模型的傳統(tǒng)方法。CS暴露引起的肺氣腫可以模擬人類(lèi)相對(duì)復(fù)雜的病理變化，被認(rèn)為是目前最合理的肺氣腫動(dòng)物模型。但是，由于建模時(shí)間長(zhǎng)，研究人員一直在探索新的建模方法。

迄今為止，還沒(méi)有完美的實(shí)驗(yàn)性肺氣腫動(dòng)物模型與人類(lèi)肺氣腫的發(fā)病機(jī)理和特征完全一致。盡管小鼠和人類(lèi)具有許多相似的生理過(guò)程，但是考慮到人類(lèi)與小鼠之間在肺部結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)方面的特定差異，兩者之間也不盡相同。即使在小鼠體內(nèi)，不同的種屬對(duì)肺氣腫的發(fā)展也表現(xiàn)出不同的敏感性。隨著對(duì)肺氣腫的研究不斷深入，研究者提出了越來(lái)越多的替代誘導(dǎo)方法。因此，我們不僅應(yīng)根據(jù)研究目的建立相應(yīng)的肺氣腫動(dòng)物模型，還應(yīng)通過(guò)多種建模方法探討肺氣腫的發(fā)病機(jī)制。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來(lái)將會(huì)有更合理和更規(guī)范的肺氣腫動(dòng)物模型應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。

利益沖突聲明所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)羅麗娟：論文選題和設(shè)計(jì)、起草及修改論文；陳燕：指導(dǎo)論文選題和設(shè)計(jì)以及修改論文