結(jié)核分枝桿菌對(duì)德拉馬尼耐藥及其分子機(jī)制研究進(jìn)展

周明 劉皇容 唐柳生 劉桑 劉愛梅

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種慢性傳染病，也是目前全球傳染病致死的重要原因，一線抗結(jié)核藥物治療仍是治療結(jié)核病的主要手段[1]，但隨著耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，終止結(jié)核病仍然是一種愿望，耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)增加了結(jié)核病防治的難度[2]，并阻礙終止結(jié)核病目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，迫切需要具有安全性的新型抗結(jié)核藥物來扭轉(zhuǎn)局勢(shì)。

一、德拉馬尼(Delamanid，Dlm)的臨床應(yīng)用

2014年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)德拉馬尼用于MDR-TB患者的治療[3]，德拉馬尼治療結(jié)核病與其他二線抗結(jié)核藥物相比，不受肝微粒體酶活性的影響，主要通過血漿白蛋白代謝和小部分經(jīng)細(xì)胞色素P450酶參與的多種代謝途徑而非全部通過肝臟代謝，因此，德拉馬尼肝毒性較小[4-5]，并具有更好的耐受性及更高的安全性，是一種很有應(yīng)用前景的新型抗結(jié)核藥品。

臨床研究證實(shí)，德拉馬尼無論是在體內(nèi)還是在體外均具有較高的抗菌活性，可有效縮短MDR-TB患者療程，有可能在MDR-TB的治療方面發(fā)揮重要作用[6]。2012年，Skripconoka等[7]通過一項(xiàng)納入400余例MDR-TB和XDR-TB患者的德拉馬尼臨床研究發(fā)現(xiàn)，在使用德拉馬尼治療6個(gè)月，結(jié)合優(yōu)化的背景方案，可以改善治療結(jié)局，降低MDR-TB和XDR-TB患者的病亡率，Wells等[8]也表達(dá)了同樣的觀點(diǎn)。2015年，一篇有關(guān)德拉馬尼的綜述中，闡述德拉馬尼在MDR-TB患者中普遍耐受性良好，最常見的報(bào)道是胃腸道不良事件和失眠。雖然以德拉馬尼為基礎(chǔ)的治療QT間期延長(zhǎng)的發(fā)生率較高，但它與暈厥和心律失常等臨床癥狀無關(guān)[9]。2017年，一項(xiàng)關(guān)于德拉馬尼治療MDR-TB和XDR-TB患者進(jìn)行的回顧性隊(duì)列研究中顯示，用德拉馬尼治療的XDR-TB患者有良好的治療反應(yīng)，個(gè)別患者延長(zhǎng)QT延長(zhǎng)，心臟毒性罕見[10]。

德拉馬尼或者聯(lián)合其他藥物治療的MDR-TB和XDR-TB的研究報(bào)道中顯示，經(jīng)過痰培養(yǎng)，患者2個(gè)月末痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率提高[11-12]，說明德拉馬尼是目前提高治療MDR-TB患者治療效果的關(guān)鍵藥物，是對(duì)治療選擇的重要組成部分。2012年，一項(xiàng)德拉馬尼治療MDR-TB患者的研究中，痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率在2個(gè)月時(shí)增加[13]。2019年，一項(xiàng)評(píng)估德拉馬尼的療效和安全性的Ⅲ期臨床試驗(yàn)在7個(gè)國(guó)家13個(gè)研究現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，714例結(jié)核病患者參與，研究發(fā)現(xiàn)與安慰劑組相比，德拉馬尼組6個(gè)月內(nèi)痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時(shí)間并沒有顯著減少，說明短期應(yīng)用療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。對(duì)于這類差異性的研究結(jié)果的存在，需要進(jìn)一步研究以了解德拉馬尼在MDR-TB治療中的作用機(jī)制。

二、德拉馬尼的抗菌機(jī)理

德拉馬尼又稱OPC-67683，是一種新型抗結(jié)核藥品，它是一類雙環(huán)硝基咪唑化合物，能抑制分枝桿菌細(xì)胞壁成分甲氧基分枝桿菌酸和酮基分枝桿菌酸的合成[15-16]。與目前的抗結(jié)核藥品相比，對(duì)處于復(fù)制、休眠期的結(jié)核分枝桿菌及胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌均具有強(qiáng)效殺滅作用[17]。德拉馬尼是一種前藥，需要脫氮黃素(輔因子F420)依賴的硝酸還原酶ddn(Rv3547)代謝激活才能發(fā)揮抗結(jié)核作用[18]。

德拉馬尼應(yīng)用于臨床1年便出現(xiàn)了耐藥的現(xiàn)象，目前許多學(xué)者研究認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌對(duì)德拉馬尼耐藥主要與激活前體藥物所需酶功能喪失有關(guān)，激活德拉馬尼所需的輔因子F420是由fgd1基因編碼的一組酶合成并重新激活fbiA,fbiB和fbiC，因此，參與德拉馬尼發(fā)揮抗菌作用的任一基因的突變可能會(huì)引起結(jié)核分枝桿菌耐藥[19]。

三、德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)

對(duì)于德拉馬尼的藥物敏感性試驗(yàn)，已經(jīng)提出了幾種藥敏方法，但是目前沒有一種方法是標(biāo)準(zhǔn)化的，最近，世界衛(wèi)生組織確定了幾種方法的德拉馬尼藥敏的臨界濃度，Middle Brook 7H11瓊脂比例法測(cè)定的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定為0.016 mg/L,MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)測(cè)定的MIC為0.06 mg/L[20]，然而，藥敏試驗(yàn)?zāi)壳斑€沒有得到廣泛的實(shí)現(xiàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室還沒有或者只是最近才開始開發(fā)用于常規(guī)開展德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)項(xiàng)目。MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)是目前德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)中的參考方法。不同研究報(bào)告的MIC數(shù)據(jù)見表1，最初的MGIT 960檢測(cè)野生菌株德拉馬尼耐藥性結(jié)果表明，MDR和pre-XDR的敏感菌株MIC為0.005～0.04 mg/L，耐藥菌株的MIC為0.32 mg/L[21]，隨即有研究指出XDR菌株的MIC為0.32 mg/L[22]和MDR耐藥菌株的MIC為0.01 mg/L[23]， 使用刃天青微量稀釋法 (REMA) 建立德拉馬尼的藥敏方案，未經(jīng)治療的敏感株MIC為0.125 mg/L[22]，有關(guān)此方法的其他研究中結(jié)核分枝桿菌遺傳變異株的MIC為0.12～4 mg/L[24]，耐藥菌株MIC為0.23～2 mg/L之間不等[22-25]，在瓊脂比例法(7H10 或 7H11培養(yǎng)基)的研究中，敏感菌株MIC為0.125 mg/L[22]，有些研究為0.001～0.05 mg/L[26]，耐藥菌株的差異較大MIC在0.03 ～0.32 mg/L不等[27]，Yang等[28]用微量肉湯稀釋法(BMD)檢測(cè)420例XDR-TB和MDR-TB菌株，敏感菌株的MIC≤0.0125 mg/L，耐藥菌株的MIC>0.32 mg/L，此方法的另一項(xiàng)研究中未經(jīng)治療的結(jié)核病患者的突變株的MIC為0.015～0.03 mg/L，1例死亡患者的MIC>8 mg/L[29]。2018年，Rancoita等[30]用微量滴度平板試驗(yàn)UKMYC5檢測(cè)19株外部質(zhì)量評(píng)估(EQA)菌株，其菌株的MIC為0.06 mg/L。

表1 德拉馬尼的藥物敏感性試驗(yàn)方法及MIC濃度

續(xù)表1

這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為指導(dǎo)德拉馬尼治療MDR-TB提供了參考。然而，不管治療前耐藥情況如何，在治療前和治療期間對(duì)德拉馬尼進(jìn)行定期的藥敏試驗(yàn)將有助于提高耐藥結(jié)核病的早期診斷，降低耐藥結(jié)核病傳播的可能性，具有重要的公共衛(wèi)生價(jià)值。

四、德拉馬尼耐藥流行病學(xué)調(diào)查

德拉馬尼治療結(jié)核病的報(bào)道中，通過體外藥敏試驗(yàn)獲取了耐藥的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，原發(fā)耐藥的實(shí)驗(yàn)中，2017年，在MiddleBrook 7H9瓊脂培養(yǎng)基中檢測(cè)了來自中國(guó)的未經(jīng)德拉馬尼治療患者的90株XDR結(jié)核分枝桿菌的體外德拉馬尼敏感性，在4株(4.4%)分離株中發(fā)現(xiàn)MIC升高[27]。2019年，一項(xiàng)來對(duì)自中國(guó)的220株未接觸過德拉馬尼的耐藥菌株進(jìn)行體外檢測(cè)，共檢出7株(3.18%)[31]。另一項(xiàng)研究中瓊脂比例法對(duì)460株來自不同地域的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，只有2株獲得性耐藥[26]。有關(guān)德拉馬尼耐藥率的數(shù)據(jù)有限，還需要更多的研究更廣泛的人群，為德拉馬尼指導(dǎo)治療耐多藥結(jié)核提供參考。

五、德拉馬尼耐藥分子機(jī)制

有研究證明德拉馬尼與另一種硝基咪哩類藥物PA-824有類似的耐藥機(jī)制[32]。2011年，在一項(xiàng)有關(guān)fgd1和ddn多樣性對(duì)PA-824體外敏感性的研究中發(fā)現(xiàn)，fgd1和ddn這兩個(gè)基因的多態(tài)性是特定于幾個(gè)基因型或個(gè)別菌株的，沒有顯著影響PA-824的MIC，說明PA-824抗性基因存在較大的遺傳多樣性[33]。Haver等[18]報(bào)道了ddn有19種不同類型的突變，基因的多態(tài)性，氨基酸的插入，密碼子停止等，突變頻率最高的是Ser-Stop早期的終止密碼子，然而研究沒有MIC實(shí)驗(yàn)，無法判斷和表型的關(guān)系。2016年Schena等[22]對(duì)來自4個(gè)不同地區(qū)的159株未經(jīng)德拉馬尼治療的臨床菌株利用全基因組測(cè)序(WGS)遺傳分析顯示，具有ddn和fbiA基因終止密碼子突變，ddnTrp-88STOP和fbiALys-250STOP的菌株都對(duì)德拉馬尼耐藥，研究的155株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)基因突變。2018年韓國(guó)一項(xiàng)MIC和耐藥性相關(guān)基因突變的研究中，對(duì)未應(yīng)用過德拉馬尼的420個(gè)臨床結(jié)核菌株測(cè)定MIC，并對(duì)耐藥性相關(guān)基因PCR擴(kuò)增測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)41株(9.76%)對(duì)德拉馬尼產(chǎn)生耐藥性，41株耐藥菌株中，有33株具有fbiA或ddn的突變，在ddn基因的Gly81ser和Gly81Asp突變與德拉馬尼耐藥性相關(guān)[28]。研究未經(jīng)治療的631株分離株對(duì)德拉馬尼抗性的相關(guān)基因中通過WGS分析發(fā)現(xiàn)ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC的點(diǎn)突變、移碼突變、終止密碼子突變等形式，其中與最高M(jìn)IC值相關(guān)的是攜帶ddn或fbiA基因中移碼或停止密碼子突變的分離株，而ddn和fgd1的點(diǎn)突變可能在降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性中發(fā)揮作用，蛋白穩(wěn)定性的預(yù)測(cè)影響與MIC結(jié)果一致,通過ddn中N91T突變的分析還發(fā)現(xiàn)N91T參與了降低輔助因子f420-h2的結(jié)合親和力，但也參與了破壞ddn折疊的不穩(wěn)定[24]。

ddn可能只是對(duì)硝基咪唑前藥的活化很重要的一類酶之一，調(diào)解 PA-824 的新陳代謝導(dǎo)致活性氮物種的釋放[34]，但對(duì)它的活化機(jī)制和細(xì)胞功能特異性的了解還有很多的未知，需要更多的研究探索ddn的結(jié)構(gòu)及突變的方式與耐藥性具體相關(guān)性。

F420氧化還原循環(huán)需要依賴NADP的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(fgd1)來催化葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。兩項(xiàng)研究報(bào)道了兩種fgd1突變，一種是密碼子49移碼，另一種是密碼子320替換，這兩種突變都與其他靶基因的突變同時(shí)發(fā)生，分別是fbiA的D49T和ddn在nt59-101缺失，但是它們對(duì)MIC的影響無法確定[32-35]。

作為輔酶F420生物合成途徑的成員，fbiA編碼2-磷酸乳酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將2-二磷酸-5-鳥苷的磷酸乳酯部分轉(zhuǎn)移到FO中[36]，fbiB由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:F420連接酶的N端結(jié)構(gòu)域與硝基還原酶蛋白序列相似的C端結(jié)構(gòu)域[37]，是一種γ-谷氨酞連接酶，通過連續(xù)向F420-0添加L-谷氨酸殘基來催化F420生物合成途徑，產(chǎn)生聚γ-谷氨酸尾部。因此，fbiB突變體產(chǎn)生F420-0，這可能會(huì)降低ddn活性，從而可能會(huì)導(dǎo)致德拉馬尼活性減弱[38]，Hoffmann等[39]研究發(fā)現(xiàn)德拉馬尼敏感株MIC<0.06 mg/L，耐藥菌株的MIC>2.0 mg/L, 這兩個(gè)菌株也包含fbiA基因R175H變異,而耐藥菌株同時(shí)發(fā)生了D49Y突變，因此fbiA基因D49Y突變可能導(dǎo)致德拉馬尼耐藥的變異，另一篇全基因組測(cè)序分析結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的研究中發(fā)現(xiàn)在表型耐藥病例中出現(xiàn)ddn、fgd1、fbiA和fbiC基因突變，ddn過早發(fā)生終止密碼子突變(Trp88STOP)，僅出現(xiàn)在耐藥菌株中;而fbiA突變Arg175His存在于1個(gè)耐藥菌株和9個(gè)易感菌株中。而fbiB的所有突變均僅在德拉馬尼敏感株中報(bào)道，可能是fbiB突變頻率較低的原因[40]。Reichmuth等[29]在未治療的結(jié)核病患者的德拉馬尼的耐藥中發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，除了fbiB基因未突變，其他4個(gè)相關(guān)基因均有突變。

fbiC催化羥基芐基從4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)移到嘧啶二酮。Haver等[18]的研究顯示在自然產(chǎn)生的對(duì)PA-824耐藥的突變株中，fbiC中發(fā)現(xiàn)了較多的單核苷酸多態(tài)性(SNP)多樣性，這表明fbiC在硝基咪唑耐藥中可能發(fā)揮作用。2017年， Pang等[27]研究未經(jīng)德拉馬尼治療的90株XDR結(jié)核分枝菌的體外敏感性，4株耐藥菌株ddn、fgd1、fbiA和fbiB均未發(fā)生突變，而fbiC基因的318密碼子突變(Val318Ile)被鑒定為與德拉馬尼耐藥相關(guān)的唯一突變。

六、總結(jié)

在結(jié)核分枝桿菌對(duì)德拉馬尼耐藥及其分子機(jī)制的研究報(bào)道中，由于使用藥敏試驗(yàn)方法的不同，以及突變的多樣性，任何破壞這些基因功能的突變都可能導(dǎo)致MIC升高[19]。既往的研究只能推測(cè)出與耐藥的部分相關(guān)性。應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的藥敏試驗(yàn)并開展WGS檢測(cè)及分子機(jī)制的其他研究，進(jìn)一步了解F420生物合成在德拉馬尼耐藥中的作用，更好地理解耐藥機(jī)制和耐藥結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化和傳播之間的聯(lián)系，避免耐藥性的早期發(fā)展和耐藥菌株的傳播，對(duì)于在治療期間獲得性耐藥結(jié)核病患者，系統(tǒng)性的耐藥監(jiān)測(cè)，能為其提供更個(gè)性化的治療。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)周明：論文撰寫、數(shù)據(jù)整理和分析；劉皇容：研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析；唐柳生：研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析；劉桑: 研究指導(dǎo)、論文修改；劉愛梅：研究指導(dǎo)、論文修改