斑馬魚elovl8缺失對抗冷脅迫下存活率及脂肪代謝的影響

王玉梅 孫守向 何嘉欣 楊 剛 高 堅,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430072; 2. 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室, 武漢 430072; 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430072)

魚類是變溫動物, 溫度是影響魚類生長和繁殖等生命活動的關(guān)鍵環(huán)境因素[1—3]。當水溫過低時魚類產(chǎn)生應激反應, 導致魚類的大量死亡[1,4]。因此冷應激對魚類影響的研究已引起廣泛關(guān)注。

冷應激會抑制魚類的代謝效率和破壞細胞膜結(jié)構(gòu), 導致機體代謝紊亂和細胞損傷[5—7]。冷應激后的鯉(Cyprinus carpio)肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組分析表明, 參與能量代謝的基因發(fā)生了顯著變化, 并且編碼ATP轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平也顯著增加[8], 表明了能量代謝在魚類抵抗冷應激中的重要地位。魚類不能像哺乳動物一樣高效地利用碳水化合物供能抵抗冷應激[10,11]。研究表明脂質(zhì)分解代謝的增強可以有效減少低溫脅迫下魚類死亡, 脂質(zhì)可能是魚類在抵抗冷應激時更有效的能量來源[6]。Mininni等[9]在對低溫暴露海鯛(Sparus aurata)的肝臟進行轉(zhuǎn)錄組分析時觀察到過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(Peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)、長鏈脂酰輔酶A合成酶及甘油三酯生物合成相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào), 說明脂肪合成在魚類抵抗低溫應激中具有重要作用。另外, 在低溫條件下魚體內(nèi)的生物膜流動性和穩(wěn)定性會大大降低, 從而影響魚類的營養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫生理響應等生理過程[12—14]。而生物膜的流動性主要取決于膜的脂肪酸組成, 在冷應激條件下魚體內(nèi)細胞膜脂肪酸組成會發(fā)生適應性的變化, 尤其是不飽和脂肪酸比例會明顯上升, 使細胞膜保持穩(wěn)定性和流動性, 從而抵御寒冷[15—19]。

魚體中不飽和脂肪酸的合成需要脂肪?；ワ柡兔?Fatty acid desaturase, FADs)和脂肪酸延長酶(Elongation of very long chain fatty acids, ELOVLs)的協(xié)同作用[20]。硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-COA desaturase, SCD)、ELOVLs和FADs與維持膜流動性和提高魚類耐寒性密切相關(guān)。其中ELOVLs是參與脂肪酸延長過程中的關(guān)鍵限速酶, 在長鏈脂肪酸的合成過程中必不可少[21,22]。關(guān)于ELOVLs在抗冷應激中的作用已有相關(guān)報道, Elovl3在小鼠冷應激后的棕色脂肪組織中mRNA水平升高了200倍以上, 后續(xù)研究進一步表明Elovl3缺失的小鼠棕色脂肪組織早期發(fā)育和產(chǎn)熱能力受到限制[23,24]。冷馴化可以誘導小鼠棕色脂肪組織中elovl6的表達,而缺乏elovl6的小鼠的棕色脂肪組織的生熱能力較低, 表明elovl6可能在調(diào)節(jié)能量平衡中發(fā)揮作用[25,26]。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)冷脅迫后的泥鰍C18:0/C16:0脂肪酸比值升高, 同時肝臟和肌肉組織中的Elovl6的表達均發(fā)生顯著性變化, 這表明Elovl6對魚類適應低溫環(huán)境十分重要。elovl1也被報道在暴露于低溫的泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)和牛蛙(Rana catesbiana)的肝臟中被誘導表達, 以調(diào)節(jié)機體產(chǎn)熱從而適應環(huán)境[28,29]。綜上所述, ELOVLs在魚類抗冷應激過程脂肪酸重組中起到關(guān)鍵作用。

elovl8是在一些硬骨魚類中鑒定的脂肪酸延長酶, 包括大西洋鮭(Salmo salar)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和斑馬魚(Danio rerio)等, 在斑馬魚中elovl8還存在兩個亞型: “elovl8a”和“elovl8b”。Li等[30]在黃斑籃子魚(Siganus canaliculatus)中克隆出了elovl8a和elovl8b, 并通過體外酵母異源表達, 檢測到elovl8b對C18和C20的多不飽和脂肪酸的延長活性, 但elovl8a并沒有檢測到相應的作用。

本研究以斑馬魚為研究對象, 首先檢測了elovl8a和elovl8b在28℃和10℃下的表達水平, 同時利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO(elovl8a和elovl8b)純合子模型。通過冷脅迫后的存活率統(tǒng)計, 脂質(zhì)含量檢測, 肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察等比較突變體與野生型斑馬魚對低溫的耐受能力, 并對冷脅迫后的斑馬魚肝臟進行了脂肪酸組成分析。最后選取肝臟組織進行了脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的定量分析, 探究elovl8缺失對斑馬魚抗冷脅迫能力的影響。

1 材料與方法

1.1 靶序列的選擇和CRIPSR/Cas9 sgRNA的合成

根據(jù)CRISPR/Cas9靶序列設(shè)計網(wǎng)站http://zifit.partners.org/ZiFiT/選擇elovl8a和elovl8b基因的靶序列。在確定目的位點后, 在符合上述原則的外顯子中選擇合適的序列, 將T7啟動子序列添加到gRNA正向引物的5′端, 用于體內(nèi)合成gRNA。Cas9 RNA和gRNA的體外轉(zhuǎn)錄方法參照Moreno等[31]的方法, 用設(shè)計的正向引物gRNA-F和反向引物gRNA-R進行PCR擴增。上游引物的設(shè)計通式為5′-TGTAATACGACTCACTATA-靶點序列-GTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3′, 靶點序列一般為20 bp,因不同靶點而異, 本實驗中選擇的靶位序列分別為:elovl8a“5′-GAGGACAGATGGATGGCTG-3′”和elovl8b“5′-ATGGCTACTAGTCTACTCTC-3′”。下游引物為通用序列: 5′-AAAGCACCGACTCGGTG CCA-3′。采用LATaqDNA聚合酶(TaKaRa), 總體積50 μL, 反應程序為94℃/3min, 94℃×1min,60℃×1min, 72℃×5min, 共35個循環(huán), 最后延伸72℃×10min。用Axy Prep-96 PCR Clean-up Kit(Axygen)純化PCR擴增產(chǎn)物。用MAXIscript?T7試劑盒(美國Ambion)體外合成gRNA, 然后用MIRV Ana? miRNA分離試劑盒(Ambion)純化。使用pSP6-2sNLS-spCas9質(zhì)粒制備Cas9核酸酶mRNA,首先用XbaⅠ(NEB)將質(zhì)粒酶切, Axy Prep-96 PCR Clean-up Kit(Axygen)清洗。采用mMessage mMachine T3試劑盒(Ambion)制備Cas9 mRNA, 最后MIRV Ana? miRNA分離試劑盒(Ambion)純化Cas9 mRNA。采用凝膠電泳和分光光度法檢測合成的gRNA的質(zhì)量。

1.2 顯微注射和純合子的篩選

收集斑馬魚一細胞期的受精卵, 進行顯微注射操作。注射完成后置于28℃循環(huán)水中孵化。待胚胎出膜后提取仔魚DNA進行測序驗證。用動物基因組DNA提取試劑盒(Tsingke)提取DNA。用驗證引物(表 1)擴增得到包含靶位點的DNA片段, 送公司測序。確認存在“雙峰”突變后將仔魚養(yǎng)至性成熟, 篩選得到突變的F0代。將F0代與野生型魚雜交, 得到穩(wěn)定遺傳的F1代, 挑選相同基因型的F1代進行自交得到F2代。從F2代中篩選出elovl8a和elovl8b基因的純合突變體。將elovl8a-/-和elovl8b-/-進行雜交并篩選后得到elovl8a/8b雙敲除純合子DKO。得到elovl8a-/-和elovl8b-/-及DKO純合突變體模型后, 首先提取肝臟RNA, 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 在mRNA序列中設(shè)計出跨靶位點的熒光定量引物(表 1), 通過熒光定量PCR對elovl8a和elovl8b基因的表達水平進行檢測。

表1 PCR引物序列Tab. 1 PCR primers

1.3 實驗魚的飼養(yǎng)及樣品的收集

本實驗的斑馬魚在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng), 保持14h光照/10h黑暗交替循環(huán), 每天喂食3次新鮮孵化的豐年蟲。每個實驗組選擇兩月齡的體重體長相近的斑馬魚進行冷脅迫實驗。WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO各選擇60尾斑馬魚隨機分為兩組:常溫組和低溫組, 每組3個重復, 每個重復10尾魚。常溫組置于28℃培養(yǎng)箱, 暫養(yǎng)2d后對常溫組進行取樣。第3天對低溫組進行處理, 將恒溫箱溫度降至20℃并開始禁食, 按照圖 1的方法進行降溫。每組斑馬魚養(yǎng)殖在10 L的水體中, 每日換水, 按1/4體積加注預冷的新水。降至10℃時, 每6h觀察并記錄死亡情況。判定魚死亡的標準為鰓無煽動, 觸碰尾柄后無反應。在水溫保持10℃第4天時elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO存活率都低于50%時進行取樣。

圖1 冷暴露降溫流程圖Fig. 1 Flowchart of cold exposure在28℃、20℃、15℃、12℃和10℃條件下對斑馬魚進行分級冷應激, 分別在20℃、15℃和12℃下保溫24hZebrafish were subjected to a stepped cold stress at 28℃, 20℃, 15℃, 12℃ and 10℃, and were maintained at 20℃, 15℃ and 12℃ for 24h,respectively

取樣前將斑馬魚置于冰上使其休克。從每缸取3尾斑馬魚肝臟組織混合為一個樣品, 于–20℃冰箱保存?zhèn)溆? 進行脂肪酸分析; 另取3條斑馬魚肝臟于凍存管中, 凍存管置于液氮罐中處理8h之后轉(zhuǎn)移到–80℃冰箱中保存?zhèn)溆? 另外, 每缸取3條斑馬魚的肝臟置于福爾馬林固定液, 用于制作冰凍切片和石蠟切片。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO每組肝臟樣品20 mg, 根據(jù)RNA提取試劑盒RNAisoTMPlus(TaKaRa)操作說明書提取斑馬魚肝臟樣品總RNA。據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primscript Ⅲ Reverse transcriptase(TaKaRa)說明書, 將所提取的樣品總RNA進行反轉(zhuǎn)錄, 其反應體系為20 μL。反應程序為25℃, 5min; 42℃,30min; 85℃, 5min。轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA置于–20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR

以冷應激后斑馬魚肝臟組織的cDNA作為實時熒光定量的模板, 選用β-actin和gapdh作為內(nèi)參基因, 使用Primer 6.0軟件設(shè)計特異性引物(表 1)。反應體系采用Yeasen公司的qPCR SYBR Green Master 10 μL體系, SYBR Green Mix 5 μL, 上下游引物共0.4 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3.6 μL。反應設(shè)置程序為95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 1min; 共計35個循環(huán)。每個樣品有3個重復, 以保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。取β-actin和gapdh基因Ct值的幾何平均數(shù)作為Ct內(nèi)參, 采用2–??Ct方法計算elovl8a和elovl8b基因在常溫和低溫環(huán)境下的表達情況[38], 及脂肪代謝相關(guān)基因的相對表達水平。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(mean±SE)表示。

1.6 尼羅紅染色及蘇木精-伊紅(HE)染色

尼羅紅(N3013, Sigma)以1 mg/mL的濃度溶解于丙酮中作為儲備溶液。冷應激實驗后, 將實驗魚浸泡在含有0.1 μg/mL尼羅紅的系統(tǒng)水中, 在28℃黑暗中過夜。圖像使用Olympus SZX16FL立體顯微鏡在488 nm的激發(fā)波長下獲得。肝臟組織切片HE染色和冰凍切片委托武漢百仟度生物科技有限公司執(zhí)行。

油紅O染色方法: 取冰凍切片解凍后置于10%中性福爾馬林固定3min, 雙蒸水清洗; 取油紅O儲備液﹕雙蒸水=3﹕2混合后, 靜置10min; 將切片放入60%異丙醇清洗后置于配制好的油紅O染液10min; 60%異丙醇清洗多余染液, 雙蒸水清洗3次;蘇木精復染1min, 1%鹽酸乙醇流水返藍3min; 甘油明膠封固。

1.7 脂肪酸分析

取樣品10 mg左右, 在含有0.01%BHT(抗氧化劑)的三氯甲烷/甲醇(2:1,V/V)混合液中勻漿提取總脂[32]。按照Zhao等[33]的方法提取總脂肪酸。使用氣相色譜儀(GC-2010 Plus)檢測其組分。注射口和檢測器的溫度設(shè)定為230℃, 以40℃/min的速度從80℃升至230℃, 230℃保持19min。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(mean±SE)表示, 采用SPSS 19.0軟件進行T檢驗(T-text)和單因素方差分析(One way ANOVA)統(tǒng)計分析, 用Duncan’s多重比較法對實驗結(jié)果差異顯著性進行分析,P＜0.05認為是顯著的。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫誘導斑馬魚elovl8a和elovl8b的表達

首先采用實時熒光定量PCR, 檢測了野生型斑馬魚在常溫28℃和低溫10℃下,elovl8a和elovl8b的表達水平。結(jié)果顯示, 低溫顯著誘導肝臟elovl8a和elovl8b的表達, 在10℃低溫脅迫下, 相對于對照組,elovl8a表達量升高20倍左右(圖 2A),elovl8b的表達水平是常溫組的1.5倍左右(圖 2B)。

圖2 在28℃和10℃下WT 肝臟中elovl8a和elovl8b的相對mRNA表達水平Fig. 2 Relative mRNA expression levels of elovl8a and elovl8b in liver of wild type (WT) at 28℃ and 10℃A. 在28℃與10℃下WT斑馬魚elovl8a的表達水平; B. 在28℃與10℃下WT斑馬魚elovl8b的表達水平; 統(tǒng)計分析采用T檢驗。誤差線上方的星號表示顯著差異(*P<0.05), n=3; 下同A. Relative expression level of elovl8a at 28℃ and 10℃; B.Relative expression level of elovl8b at 28℃ and 10℃. The statistical analyses were conducted by T test. The asterisks labeled above the error bars indicated significant differences (*P<0.05),n=3. The same applies below

2.2 斑馬魚elovl8敲除模型的建立

為獲得斑馬魚elovl8a和elovl8b基因敲除純合突變體, 本研究應用CRISPR/Cas9技術(shù)對斑馬魚兩個基因的第二個外顯子進行基因編輯, 獲得了elovl8a和elovl8b的突變體, 經(jīng)過測序鑒定,elovl8a-/-缺失4個堿基, 突變后的堿基序列翻譯受到影響, 由正常的268個氨基酸減少至54個氨基酸(圖 3A)。elovl8b缺失7個堿基, 氨基酸個數(shù)由264個減少至25個(圖 3B)。DKO純合子由elovl8a和elovl8b純合子雜交并篩選后得到。

圖3 WT與elovl8a-/-和elovl8b-/-斑馬魚基因靶位點氨基酸序列的比較Fig. 3 Comparisons of genes and amino acid sequences between WT and elovl8a-/- and elovl8b-/- zebrafishA. WT與elovl8a-/-斑馬魚基因靶位點氨基酸序列的比較; B. WT與elovl8b-/-斑馬魚基因靶位點氨基酸序列的比較A. Comparison of amino acid sequences of WT and elovl8a-/- zebrafish; B. Comparison of amino acid sequences of WT and elovl8b-/-zebrafish

2.3 低溫脅迫下WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO的死亡率

將WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚按照圖 1的方法進行低溫處理后, 統(tǒng)計四組魚的死亡情況。結(jié)果顯示四組斑馬魚均在10℃時開始出現(xiàn)死亡(圖 4A)。DKO組在10℃下12h時開始出現(xiàn)死亡,24h時死亡率達到了50%(圖 4B)。在10℃下24h時elovl8b-/-開始出現(xiàn)死亡, 在72h時死亡率達到了50%。elovl8a-/-在48h出現(xiàn)死亡, 在96h死亡率達到50%。elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO三組斑馬魚最終的死亡率都顯著大于WT組(圖 4B)。

圖4 冷脅迫下WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚的存活率統(tǒng)計Fig. 4 Survival rate of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish during cold stressA. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚隨溫度變化的存活率; B. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚在10℃脅迫下的存活率A. The survival rate of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish under different temperatures; B. The survival rate of WT, elovl8a-/-,elovl8b-/- and DKO zebrafish at 10℃

2.4 低溫脅迫下脂質(zhì)含量及組織學分析

我們分別對常溫與低溫脅迫下的WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚進行了活體尼羅紅染色。結(jié)果顯示, 常溫下elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚較WT并無較大差異(圖 5A), 而在冷處理96h后的elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚相對WT出現(xiàn)了顯著的腹部脂肪沉積(圖 5B)。肝臟脂質(zhì)含量的結(jié)果顯示elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟的脂質(zhì)含量明顯高于WT(圖 5C)。

圖5 尼羅紅染色及肝臟脂質(zhì)含量分析Fig. 5 Nile red staining and analysis of liver lipid contentA. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚28℃尼羅紅染色圖像, n=5; B. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚冷應激后尼羅紅染色圖像, n=5; C. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚冷應激后肝臟脂質(zhì)含量A. Nile red staining images of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish at 28℃, n=5; B. Nile red staining images of WT, elovl8a-/-,elovl8b-/- and DKO zebrafish after cold stress, n=5; C. Lipid content in liver of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish after cold stress

同時常溫下elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟并無病變現(xiàn)象(圖 6A)。而elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟在冷脅迫后出現(xiàn)了不同程度的病變泛白的現(xiàn)象, 表明肝組織受到了損傷(圖 6B),其中elovl8b-/-的肝臟病變最為明顯, 病變的面積最大。HE染色結(jié)果顯示低溫組elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟切片出現(xiàn)不同程度的脂肪空泡,elovl8a-/-肝臟切片中脂肪空泡的數(shù)量較少,elovl8b-/-肝臟切片中脂肪空泡的數(shù)量最多, 分布比較密集(圖 6C)。肝臟冰凍切片油紅染色結(jié)果顯示elovl8b-/-斑馬魚的肝臟脂質(zhì)沉積最為明顯,elovl8a-/-次之,DKO肝臟顯示輕度的脂肪沉積(圖 6C)。

2.5 在28℃和10℃下脂肪代謝相關(guān)基因的表達水平

通過實時熒光定量測定出WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟在28℃和10℃下脂肪代謝相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果表明, 在10℃下elovl8a-/-和elovl8b-/-的脂肪合成相關(guān)基因,scd和acaca的表達均顯著升高, 而在28℃下elovl8a-/-和elovl8b-/-scd較WT顯著下降,acaca無顯著性變化(圖 7A—D)。在10℃下elovl8a-/-肝臟中fasn表達水平較WT下降,elovl8b-/-肝臟中fasn表達量在常溫和低溫表達均升高, 而DKO肝臟中fasn、scd、acaca和pparγ的表達顯著下降, 在28℃下DKO肝臟fasn和scd表達升高,acaca和pparγ表達無顯著變化(圖 7A—D)。在10℃下elovl8a-/-肝臟中脂肪分解基因pnpla2、lpl和lipea均顯著下調(diào), 而elovl8b-/-與之相反, 都呈現(xiàn)表達上調(diào)的趨勢。在DKO斑馬魚肝臟中pnpla2的表達水平較WT顯著升高,lpl和lipea的表達量顯著下降。在28℃下elovl8b-/-斑馬魚肝臟中pnpla2表達顯著升高。elovl8a-/-斑馬魚肝臟中l(wèi)pl表達顯著升高,lipea表達水平顯著下降。DKO斑馬魚中l(wèi)ipea表達水平顯著下降(圖 8A—C)。

圖7 在28℃ and 10℃下脂肪合成相關(guān)基因的表達水平Fig. 7 Relative expression levels of lipogenesis genes at 28℃ and 10℃

2.6 肝臟脂肪酸組成分析

提取常溫和冷脅迫的WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟進行脂肪酸組成分析。結(jié)果顯示, 低溫處理影響了肝臟的脂肪酸組成(表 2)。其中SFA變化最明顯, 在10℃下WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟C20:0較常溫組都顯著減少, 但比較低溫組內(nèi)C20:0的含量, 發(fā)現(xiàn)elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組的C20:0含量顯著高于WT組(圖 9A)。低溫組中WT的C22:0含量顯著高于常溫組的WT, 但elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組的C22:0含量并沒有顯著增多(圖 9B)。計算C22:0/C20:0及C20:0/C18:0,結(jié)果顯示, 在28℃下elovl8a-/-C22:0/C20:0含量顯著高于WT組,elovl8b-/-和DKO組C22:0/C20:0含量與WT組無顯著差異; 在10℃下,elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組C22:0/C20:0含量顯著低于WT組(圖 9C)。在28℃下elovl8a-/-和DKO組C20:0/C18:0含量顯著低于WT,elovl8b-/-與WT無顯著性差異, 而在10℃下elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組C20:0/C18:0含量都顯著高于WT組(圖 9D)。

表2 在28℃和10℃下WT、elovl8a-/-、elovl8b-/- 和DKO斑馬魚肝臟脂肪酸組成(%總脂肪酸)Tab. 2 Fatty acid composition (% of total fatty acids) in liver of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish (mean±SE, n=3)

3 討論

3.1 在低溫下肝臟的脂質(zhì)沉積降低了elovl8a-/-和elovl8b-/-的冷耐受能力

肝臟是脂肪代謝的主要組織, 在魚類抵抗低溫的過程中發(fā)揮重要作用[8,34]。魚類遭遇冷應激后的主要表型之一是肝臟損傷[9]。在8℃暴露的金頭鯛(S. aurata)中觀察到了肝臟蒼白、易碎和肝細胞脂肪變性的發(fā)生[35]。本實驗在對冷應激后的斑馬魚進行解剖時, 發(fā)現(xiàn)elovl8a-/-、elovl8a-/-和DKO肝臟較對照組出現(xiàn)更加明顯的泛白和易碎現(xiàn)象(圖 6A), 這表明在低溫脅迫下elovl8缺失導致斑馬魚肝臟進一步的損傷。肝臟中脂質(zhì)沉積是造成肝臟損傷的重要原因之一[36]。在冷脅迫的過程中, 內(nèi)臟周圍的脂肪儲備被調(diào)動, 脂肪酸被肝臟吸收, 從而導致了肝臟脂質(zhì)積累[9,34,38]。本研究中活體尼羅紅染色顯示,elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚在冷應激后出現(xiàn)不同程度的脂質(zhì)沉積。肝臟HE染色及油紅O染色結(jié)果進一步表明elovl8a-/-和elovl8b-/-的肝臟中有脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象(圖 6C), 并可見明顯的脂肪空泡, 因此本實驗結(jié)果充分表明elovl8a和elovl8b的缺失導致了肝臟的脂質(zhì)沉積, 造成肝組織損傷, 從而降低了斑馬魚抗冷應激能力。

圖6 肝臟組織觀察及肝臟切片(HE和油紅染色)Fig. 6 Observation of liver tissue (HE and oil red staining)A. 28℃ WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟組織觀察, n=3; B. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚冷應激后肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察, 紅色箭頭為肝組織損傷位置, n=3; C. WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚冷應激后肝臟組織HE和油紅染色圖像(標尺為100 μm), 紅色箭頭為肝組織損傷位置, n=3A. Observation of liver tissue of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish at 28℃, n=3; B. Observation on liver tissue structure of WT,elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish after cold stress. The red arrow in Fig. B showed where liver tissue was damaged, n=3; C. HE and oil red staining images of liver tissues of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish after cold stress (the bar is 100 μm). The red arrow in Fig.C showed the location of fat vacuoles, n=3

3.2 在低溫下脂質(zhì)分解異常降低了elovl8a-/-和elovl8b-/-的冷耐受能力

脂肪分解代謝是魚類抗寒的必要條件, 在低溫下鯉(C. carpio)肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達增加[8]。在低溫處理斑馬魚的前48h, 魚體首先利用碳水化合物來提供能量; 但在48h以后, 脂肪的利用明顯增加[6]。魚體內(nèi)的甘油三酯(Triglyceride, TG)通過pnpla2和lipea水解生成游離脂肪酸(FFA)和甘油,并釋放到血液中提供能量[40]。有研究發(fā)現(xiàn), 大黃魚(Larimichthys crocea)[41]和鯉(C. carpio)[8]在冷應激后, 血液中的TG含量降低, 表明TG在低溫脅迫下被動員和分解, 為機體提供能量來抵抗低溫。在本研究中, 低溫脅迫后elovl8a-/-和DKO肝臟中l(wèi)pl和lipea的表達水平顯著下降, 而在常溫下elovl8a-/-肝臟中l(wèi)pl的表達水平上升(圖 8B、8C), 這表明elovl8a的缺失影響了低溫脅迫下斑馬魚脂質(zhì)分解代謝過程, 導致能量供應不足, 無法抵抗低溫脅迫而死亡。而elovl8b-/-中的pnpla2、lpl和lipea的表達水平顯著升高(圖 8A—C)。研究表明低溫脅迫誘導的氧化應激會使脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量增加[6],elovl8b-/-脂肪分解代謝相關(guān)基因的高表達可能是脂質(zhì)氧化活動增強導致的, 而elovl8b-/-的高死亡率可能存在其他原因。

圖8 在28℃和10℃下脂肪分解相關(guān)基因的表達水平Fig. 8 Expression levels of lipolysis genes at 28℃ and 10℃

3.3 在低溫下scd補償 elovl8缺失造成的冷耐受能力下降

SCD能夠在低溫脅迫下參與脂肪酸代謝, 調(diào)節(jié)膜的流動性[42], 大量研究發(fā)現(xiàn)scd在魚類應對低溫脅迫中具有關(guān)鍵作用。鯉在10℃環(huán)境下,scd的表達水平上升了8—10倍[43], 同樣的尼羅羅非魚(O.niloticus)冷誘導7d后scdmRNA水平上升了16倍[44]。本實驗中elovl8a-/-和elovl8b-/-肝臟中的scd水平在冷刺激后同樣出現(xiàn)顯著升高的現(xiàn)象(圖 7B)。scd對16:0和18:0脂肪酸有強烈的去飽和作用[45], 與其一致的是elovl8a-/-和elovl8b-/-肝臟中C18:1n-9的含量顯著高于WT。elovl8a-/-肝臟脂肪酸組成顯示,elovl8a-/-肝臟中n-3PUFA顯著低于WT, 低溫脅迫下scd表達水平上升, 以提高不飽和脂肪酸比例, 這些變化的適應性意義可能是為冷暴露魚體中的生物膜的廣泛重組提供必需的脂肪酸成分[14], 以維持膜流動性抵抗寒冷。elovl8b-/-肝臟中C18:0顯著高于WT,scd的高表達可能是為了促進C18:0到C18:1的去飽和過程, 為了挽救elovl8缺失造成的長鏈飽和脂肪酸的累積。

3.4 C20:0的累積降低了elovl8a-/-和elovl8b-/-的冷耐受能力

低溫會抑制機體代謝, 使線粒體中活性氧的產(chǎn)生增加[46], 導致氧化應激。有研究表明, 急性或慢性的冷應激都會誘導魚體組織產(chǎn)生氧化應激[47,48]。將斑馬魚和北海鰻(Muraenesox cinereus)置于低溫環(huán)境時, 會誘發(fā)大腦和肝臟氧化應激[47,49]。除此之外, 有報道稱極長鏈飽和脂肪酸具有較高的脂毒性, 會增加過氧化物酶體和線粒體中過氧化氫的生成, 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激造成細胞死亡[50]。Pl?tz等[50]的研究表明, C20:0具有較強的脂毒性。本實驗發(fā)現(xiàn)冷應激后elovl8b-/-和DKO組斑馬魚肝臟C20:0含量均高于WT組,elovl8a-/-的C20:0含量也有累積的趨勢(圖 9A)。C20:0的累積可能進一步加劇了低溫脅迫下的氧化應激[50], 這可能是elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組斑馬魚死亡率高于WT組的原因之一。冷應激后elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組C22:0含量較WT組下降(圖 9B), 表明elovl8的缺失可能影響了C20:0到C22:0的延長過程。而Li等[30]在對黃斑籃子魚elovl8的研究中檢測到了elovl8b對C18多不飽和脂肪酸的延長活性,沒有檢測到elovl8a對多不飽和脂肪酸的活性。與其研究結(jié)果相悖的是, 本實驗28℃的脂肪酸分析結(jié)果顯示,elovl8a-/-較WT肝臟的C20:2n-6與C20:3n-6的含量顯著減少, 而elovl8b-/-較WT多不飽和脂肪酸并無較大差異, 這表明斑馬魚elovl8a可能在不飽和脂肪酸的合成中發(fā)揮作用。與Li等[30]的結(jié)果不同可能是物種間基因功能的差異造成的。目前還沒有關(guān)于斑馬魚elovl8a和elovl8b基因功能的研究的報道。根據(jù)本實驗的結(jié)果,elovl8a和elovl8b在脂肪酸合成過程中的作用可能存在差異, 這兩個亞型在脂代謝過程中的功能也有不同。這可能是DKO斑馬魚在冷應激下的表型與單敲除不同的原因。

圖9 28℃和10℃下WT、elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO斑馬魚肝臟脂肪酸組成分析Fig. 9 Fatty acid composition in liver of WT, elovl8a-/-, elovl8b-/- and DKO zebrafish at 28℃ and 10℃A. C20:0/SFA比值; B. C22:0/SFA比值; C. C22:0/SC20:0比值; D. C20:0/C18:0比值(**P<0.01; ***P<0.001)A. C20:0/SFA ratio; B. C22:0/SFA ratio; C. C22:0/C20:0 ratio; D. C20:0/C18:0 ratio(**P<0.01; ***P<0.001)

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果說明了elovl8與斑馬魚耐寒性緊密相關(guān)。elovl8缺失會減弱斑馬魚的耐低溫能力。elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO組斑馬魚在冷應激下脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂, 造成脂質(zhì)沉積和脂肪酸組成的改變, 從而加劇了斑馬魚的死亡。elovl8a、elovl8b的缺失使低溫脅迫下斑馬魚C20:0的含量累積, C22:0的合成受阻。本研究結(jié)果證明了elovl8對斑馬魚抗冷脅迫過程中起到重要作用,elovl8的缺失會減弱斑馬魚的抗冷脅迫能力。