鱖plin2生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)及其在肝臟脂肪蓄積中的作用

高俊杰 梁旭方 蔡文靜 莊武元

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心, 武漢 430070; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

細(xì)胞內(nèi)脂滴(Lipid droplet, LD)在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)、新陳代謝和信號傳導(dǎo)中起著不同的作用[1,2]。最近研究揭示了脂滴包被蛋白(Perilipin, PLIN)在LD的發(fā)生和調(diào)節(jié)LD上的蛋白質(zhì)運(yùn)輸中的重要性[3,4]。PLINs是最豐富的脂滴包被蛋白, 在中性脂質(zhì)代謝中起著核心作用[5]。哺乳動物的PLIN蛋白質(zhì)N端具有一個保守的PAT結(jié)構(gòu)域, 最近一些研究表明, PLIN家族蛋白參與了中性脂質(zhì)儲存和利用的調(diào)控[6,7]。在哺乳動物中, 具有組織特異性的脂滴包被蛋白已經(jīng)進(jìn)化并賦予其不同的功能[8,9]。然而, 大多數(shù)關(guān)于PLIN蛋白功能的研究都是在哺乳動物系統(tǒng)中進(jìn)行的, 主要集中在中性脂質(zhì)代謝上, 而對非哺乳動物脊椎動物的研究相對較少。

在PLIN家族的5個成員中,plin2是一個在大多數(shù)組織中普遍表達(dá)的50 kD的蛋白質(zhì), 在脂滴的形成和穩(wěn)定, 長鏈脂肪酸的吸收和脂質(zhì)積累中起著關(guān)鍵作用[10—12]。Plin2水平受細(xì)胞內(nèi)脂滴和三酰甘油含量的正調(diào)節(jié)[12]。隨著脂肪組織中的脂肪細(xì)胞成熟,plin2逐漸被plin1取代, 但在其他組織中plin2仍然作為主要脂滴相關(guān)蛋白發(fā)揮作用[7]。此外, 一些證據(jù)表明plin2在脂肪肝的誘發(fā)中起著重要作用[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)plin2基因缺失可防止肥胖和胰島素抵抗,并顯著降低肝臟甘油三酯和膽固醇水平[15]。因此,plin2蛋白被認(rèn)為是治療哺乳動物脂肪肝形成的潛在靶點(diǎn)。

脂肪肝是目前養(yǎng)殖魚類普遍存在的一種生理病理現(xiàn)象。鱖(Siniperca chuatsi)是主要原產(chǎn)湖北的我國傳統(tǒng)名貴肉食性魚, 肉質(zhì)豐腴細(xì)嫩, 營養(yǎng)價值高, 是我國淡水養(yǎng)殖的理想選擇[16]。但是鱖等肉食性魚類對糖類利用能力較差, 飼料中碳水化合物過多會使其營養(yǎng)成分不平衡和能量攝入過多, 最終導(dǎo)致脂肪肝形成及生長速度下降[17]。對于魚類plin2的功能及plin2是否可以作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防脂肪肝的潛在靶點(diǎn), 目前還沒有系統(tǒng)的研究。本研究對鱖plin2基因進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)分析和表達(dá)特征進(jìn)行了研究。此外, 我們還探究了在鱖肝臟脂肪蓄積狀態(tài)下plin2基因表達(dá)情況。本研究將有助于進(jìn)一步了解plin2在魚類肝臟中發(fā)揮的作用, 并為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的脂肪肝問題提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及飼養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用魚來自湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖研究中心。120尾鱖(80±5) g隨機(jī)分為2組, 每組設(shè)置3個平行, 每缸(350 L)20尾并暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)循環(huán)水系統(tǒng)2周, 水溫維持在(23.0±0.5)℃, pH 7.1—7.5,溶氧為7.5—7.8 mg/L, 光照周期為自然光照周期。所有的魚在馴化后投喂人工飼料。分別投喂含不同碳水化合物飼料, 對照組和實(shí)驗(yàn)組分別含0淀粉和20%淀粉, 飼料配方在本實(shí)驗(yàn)室先前研究中已描述[18], 所有飼料成分均購自武漢高龍飼料有限公司。在為期8周養(yǎng)殖期間每天早上9:00和下午17:30喂食2次。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束饑餓6h后每缸隨機(jī)捕獲6尾魚, 用MS222(50 mg/L)進(jìn)行麻醉。獲取肝臟組織并在液氮中冷凍后保存于–80℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 不同亞型plin2基因序列分析

根據(jù)已公開的鱖基因組數(shù)據(jù)庫(http://genomes.igb-berlin.de/cgi-bin/hgGateway?db=sinChu7)獲得plin2a和plin2b序列, 通過Editseq[19]和Clustal W2[20]軟件將鱖CDS(Coding sequence)序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列并將鱖和刺魚(Gasterosteus aculeatus)其他物種的plin2基因進(jìn)行氨基酸多重序列比對(表 1)。通過對哺乳動物plin2氨基酸序列比對鱖PAT結(jié)構(gòu)域和11-mer重復(fù)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定, 通過Expert Protein Analysis System (https://web.expasy.org/protscale/) 預(yù)測鱖plin2的親水性。通過GenBank和ENSEMBL數(shù)據(jù)庫調(diào)取了人、斑馬魚和刺魚等3個物種的plin2氨基酸序列, 進(jìn)行鱖plin2基因共線性分析。

表1 不同物種plin2氨基酸序列信息Tab. 1 Amino acid sequence information of plin2 in different species

1.3 PLIN家族進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹重建使用了人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、斑馬魚(Danio rerio)、刺魚(Gasterosteus aculeatus)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteus oculatus)、腔棘魚(Latimeria chalumnae)、日本青鳉(Oryzias latipes)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、攀鱸(Anabas testudineus)、亞馬遜帆魚(Poecilia formosa)和綠河豚(Tetraodon nigroviridis)等其他物種的PLIN家族氨基酸序列,且均從GenBank和ENSEMBL數(shù)據(jù)庫中獲得。用ClustalW2對鱖與上述物種的PLIN家族進(jìn)行氨基酸序列多重比對后, 通過GBLOCKs選取合適的保守區(qū)序列用于后續(xù)分析。利用ModelFinder尋找最佳的核苷酸替代模型: JTT+G4(BIC), 再通過Phylo-Suite[21]軟件使用貝葉斯法重建系統(tǒng)進(jìn)化樹。貝葉斯法分析同時運(yùn)行2個獨(dú)立的反應(yīng), 每個反應(yīng)4條馬爾科夫鏈, 共運(yùn)行100萬代。

1.4 鱖plin2基因組織表達(dá)檢測

從暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心循環(huán)水系統(tǒng)中隨機(jī)抽取6尾鱖, 用MS222(50 mg/L)進(jìn)行麻醉后采集鱖脾臟、腦、肝臟、脂肪、肌肉、腸道、胃、腎臟和心臟等組織樣本, 使用RNAiso Plus(TaKaRa)抽提鱖不同組織和肝臟細(xì)胞總RNA,通過多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的純度和濃度。采用HiScript?ⅡReverse Transcriptase(Vazyme)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RT-qPCR, 所用引物見表 2。RT-qPCR反應(yīng)體系: ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)10 μL,上游引物和下游引物各0.4 μL, 模板cDNA 1 μL, 用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃,預(yù)變性5min, 然后40個循環(huán): 95℃變性15s, 57℃退火30s, 72℃延伸45s, 溶解曲線以0.5℃/s速率從95℃降到65℃, 每隔6s采集1次數(shù)據(jù)信號。

表2 鱖組織表達(dá)引物列表Tab. 2 Primers used for the study

1.5 鱖肝臟細(xì)胞分離與培養(yǎng)

用麻醉劑MS222(50 mg/L)將鱖麻醉, 剪斷尾鰭放血完全后, 用75%的酒精擦拭魚體。以下操作均在無菌條件下進(jìn)行, 從腹腔內(nèi)小心取出肝臟, 并轉(zhuǎn)移至含有DPBS的細(xì)胞培養(yǎng)皿中, 清洗血塊后用解剖刀將肝組織剪成1—2 mm3左右的組織塊, 放入AIM試劑中浸泡1h, 且隔30min換一次試劑。吸走AIM并將肝組織剪碎后轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管中,用0.25%胰蛋白酶28℃恒溫消化30min, 每5—7min用含10% FBS的M199培養(yǎng)基中和消化收集細(xì)胞1次。細(xì)胞懸液經(jīng)100 mm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾, 以去除組織碎片, 1000 r/min, 5min收集細(xì)胞于15 mL無菌離心管, 并用紅細(xì)胞裂解液和DPBS清洗2遍以去除血液紅細(xì)胞。隨后1000 r/min, 5min用M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗1次, 最后將收集的鱖肝細(xì)胞重懸于M199完全培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板, 接種密度約為2×106個細(xì)胞/mL, 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室先前研究結(jié)果, 選用0.1 mmol/L濃度的棕櫚酸鈉處理肝細(xì)胞構(gòu)建高脂模型[22], 并將處理好的細(xì)胞放于28℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)48h, 在倒置相差顯微鏡下觀察鱖肝臟原代細(xì)胞的生長情況。之后提取鱖肝細(xì)胞總RNA, 進(jìn)行RT-qPCR相關(guān)檢測。

1.6 統(tǒng)計分析

用SPSS Statistics 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以鱖核糖體蛋白L13a (Ribosomal protein L13a,rpl13a)作為內(nèi)參基因, 采用2–??Ct方法計算相對基因表達(dá)水平[23]。單樣本t檢驗(yàn)(One samplet-test)用來檢測數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性; 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent samplet-test)用來分析2個樣本之間的差異; 單因素方差分析(One-way ANOVA)用來檢驗(yàn)多個樣本之間的差異性; 數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示, 差異顯著度為顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 鱖plin2基因序列分析

將鱖plin2a和plin2b目的序列進(jìn)行生物學(xué)信息比對分析, 其中plin2a基因包含一個1344 bp的ORF(Open Reading Frame), 編碼447個氨基酸;plin2b基因包括一個1011 bp的ORF, 編碼336個氨基酸。鱖plin2基因序列與其他物種進(jìn)行氨基酸多重比對顯示, 鱖plin2a與刺魚plin2a具有高度一致性(75%), 與哺乳動物和斑馬魚中報道的plin2相比, 序列同源性為57%—59%。鱖plin2b與刺魚plin2b同源性下降到55%左右, 而與斑馬魚和哺乳動物plin2報道的氨基酸序列相比同源性處于相對較低水平(34%—40%)。通過分析發(fā)現(xiàn)鱖plin2具有與其他同源基因一樣的結(jié)構(gòu)域, 表現(xiàn)出一個N-末端PAT結(jié)構(gòu)域和一個11-mer重復(fù)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)哺乳動物plin2的疏水特性, 鱖plin2a和plin2b均沒有預(yù)測到有助于膜定位的疏水序列的大區(qū)域, 這表明鱖plin2內(nèi)的區(qū)域可能在空間上聚集在一起形成疏水分子的識別表面。

2.2 plin2基因共線性分析

對Plin2基因進(jìn)行共線性分析表明, 鱖plin2a和plin2b分別位于6號和9號染色體, 人類plin2基因位于9號染色體(圖 1)。人與鱖plin2a具有共線性的基因共有12個, 但臨近基因dennd4c、haus6和zdhhc21排列順序不同; 人與鱖plin2b具有共線性的基因共有14個, 但臨近基因acer2、smu1b、dnajal和aptx排列順序不同(圖 1)。Plin2在斑馬魚中位于15號染色體, 而刺魚與鱖表現(xiàn)一致, 分化為plin2a和plin2b兩個亞型, 分別位于7號和9號染色體(圖 2)。斑馬魚與鱖plin2兩個亞型都表現(xiàn)為沒有臨近基因,然而刺魚plin2兩個亞型與鱖的上下游基因則表現(xiàn)出高度的一致性(圖 2)。

圖1 鱖和人plin2基因共線性Fig. 1 Syntenic analysis for plin2 genes in S. chuatsi and H. sapiens

圖2 鱖和其他硬骨魚類plin2基因共線性Fig. 2 Syntenic analysis for plin2 genes in S. chuatsi and other teleost species

2.3 plin2進(jìn)化分析

使用貝葉斯法重建鱖與其他物種PLIN家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 3), 聚類關(guān)系主要分為硬骨魚plin2,哺乳類plin2、plin1、plin3和plin6五個部分, 哺乳動物plin3-plin5分布于其中(圖 3a)。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示PLIN家族可以分為兩大支, 其中分支Ⅰ包括plin1-plin5, 分支Ⅱ只包括plin6(圖 3b)。分支Ⅰ又可以分為plin5、plin1/plin3/plin4及plin2三個分支。其中鱖plin2a與刺魚、紅鰭東方鲀和綠河豚在進(jìn)化距離上較為接近, 鱖plin2b則與攀鱸最為接近。

圖3 根據(jù)PLIN家族氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 The phylogenetic tree derived from the amino acid sequences of PLIN genesa. PLIN家族聚類關(guān)系; b. 鱖和其他物種plin2系統(tǒng)發(fā)育分析a. Clustering analysis based on PLIN family; b. Phylognentic tree of S. chuatsi and other species plin2

2.4 鱖plin2基因表達(dá)分布

分別對鱖的脾、腦、脂肪、肌、腸、胃、腎和心等9個組織進(jìn)行plin2a和plin2b基因相對表達(dá)分析(圖 4)。Plin2a基因在鱖的肝臟中表達(dá)最高, 其次是脂肪和脾臟組織, 在其他組織中相對表達(dá)較低(圖 4A)。相反plin2b基因在鱖的肝臟中幾乎不表達(dá), 在腎臟組織中表達(dá)最高, 其次是胃、脂肪和腦組織, 在其他組織中相對表達(dá)較低(圖 4B)。

圖4 鱖plin2a和plin2b在不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of plin2a (A) and plin2b (B) genes in different tissues of S. chuatsi標(biāo)準(zhǔn)差上方不同字母表示差異顯著(P<0.05); 下同Different letters above the error bars indicate significant differences(P<0.05). The same applies below

2.5 高碳水化合物對plin2基因表達(dá)影響

我們先前的研究表明, 隨著飼料碳水化合物含量增加到20%, 魚體脂質(zhì)含量逐漸升高, 同時組織學(xué)分析顯示, 碳水化合物含量添加20%組肝臟組織中出現(xiàn)大量脂滴, 進(jìn)而誘發(fā)了肝臟脂肪變性。如圖 5所示, 與對照組相比, 高糖組肝臟中的plin2a基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖5 高糖飼料對鱖肝臟 plin2a mRNA 水平的影響Fig. 5 Effects of high-carbohydrate diet on plin2a mRNA of S.chuatsi liver標(biāo)準(zhǔn)差上方**表示差異極顯著(P<0.01)**. extremely significant differences (P<0.01)

2.6 棕櫚酸鈉刺激鱖肝臟細(xì)胞對plin2表達(dá)影響

用0.1 mmol/L棕櫚酸鈉構(gòu)建的鱖肝臟原代細(xì)胞其細(xì)胞生長狀態(tài)和形態(tài)與正常培養(yǎng)的鱖肝臟原代細(xì)胞相比, 沒有受到顯著影響(圖 6)。

圖6 倒置相差顯微鏡下觀察的鱖肝臟原代細(xì)胞形態(tài)Fig. 6 Observation of S. chuatsi hepatocytes under inverted phase contrast microscopea. 鱖肝臟原代細(xì)胞正常培養(yǎng)24h (40×); b. 鱖肝臟原代細(xì)胞正常培養(yǎng)48h (100×); c. 鱖肝臟原代細(xì)胞經(jīng)0.1 mmol/L PA刺激培養(yǎng)48h(100×)a. Morphology of hepatocytes cultured for 24h (40×); b. Morphology of hepatocytes cultured for 48h (100×); c. Morphology of hepatocytes cultured with 0.1 mmol/L PA for 48h (100×)

與正常鱖肝細(xì)胞相比, 用0.1 mmol/L棕櫚酸鈉構(gòu)建的鱖肝臟原代細(xì)胞高脂模型中plin2a表達(dá)水平顯著增加(P<0.05; 圖 7)。

圖7 棕櫚酸鈉刺激鱖肝細(xì)胞 plin2a mRNA 水平的影響Fig. 7 Effects of palmitate on plin2a mRNA of S. chuatsi hepatocytes

3 討論

3.1 鱖plin2的分子特征

脂滴包被蛋白PLIN家族是主要的脂滴蛋白, 在脂滴形成和甘油三酯代謝中起重要作用。與哺乳動物PLIN基因家族相比, 硬骨魚類PLIN家族的組成更具物種特異性和復(fù)雜性[24]。然而, 對于PLIN家族研究主要集中在哺乳動物中, 而在硬骨魚中對PLIN家族的研究較少[25]。在PLIN家族中,plin2一般位于中性脂滴的多種組織和培養(yǎng)細(xì)胞系中, 被認(rèn)為在哺乳動物脂肪肝的形成中起到至關(guān)重要的作用[26]。本研究對鱖plin2基因的序列和組織表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定和分析。此外, 本研究探究了在鱖肝臟脂肪處于蓄積狀態(tài)下plin2的表達(dá)變化情況。

先前研究表明, 斑馬魚和穴居魚保持著plin2的一個拷貝, 與人類的plin2同源[27]。而在硬骨魚基因組復(fù)制過程中產(chǎn)生的plin2基因, 如刺魚和亞馬遜帆魚保留了兩個亞型, 分別命名為plin2a和plin2b[24]。在鱖基因組中, 經(jīng)過分析比對發(fā)現(xiàn)與刺魚和亞馬遜帆魚相同, 產(chǎn)生了plin2a和plin2b兩個亞型, 而plin2的加倍現(xiàn)象, 可能會導(dǎo)致其在鱖糖脂代謝中的作用更加復(fù)雜。同源性分析還表明, 鱖plin2a基因與刺魚plin2a基因具有高度的同源性, 但鱖plin2b與刺魚plin2b基因同源性并不是很高。在鱖plin2a和plin2b中發(fā)現(xiàn)了包括PAT結(jié)構(gòu)域和11-mer重復(fù)結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的人類PLIN蛋白的定義特性。高度保守的N-末端PAT結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為參與了plin2的脂滴穩(wěn)定和蛋白酶體降解; 11-mer重復(fù)結(jié)構(gòu)域可能與C-末端結(jié)構(gòu)域協(xié)同調(diào)節(jié)乳脂分泌有關(guān)[5,27]。這些結(jié)構(gòu)域的保守性表明, 鱖plin2可能是針對脂滴, 其功能可能與甘油三酯的儲存和動員有關(guān)。蛋白質(zhì)的親疏水性對于其折疊具有重要作用, 在我們對鱖plin2蛋白親疏水性預(yù)測后, 發(fā)現(xiàn)鱖plin2兩個亞型都不具有大面積疏水或親水域。有研究發(fā)現(xiàn)在對小鼠plin2以及plin3蛋白序列進(jìn)行疏水預(yù)測中, 其N端PAT結(jié)構(gòu)域和11-mer重復(fù)區(qū)域中觀察到疏水性/親水性片段的交替模式[7,12]。同時2種蛋白質(zhì)未預(yù)測到大段的疏水序列, 這表明在空間上, 其蛋白質(zhì)中的區(qū)域可能匯聚在一起從而形成了較大的疏水性配體識別表面發(fā)揮功能。

3.2 鱖plin2的系統(tǒng)發(fā)育分析

聚類分析將PLIN家族大致分為5類,plin2明顯地分為硬骨魚和哺乳動物兩部分, 其余PLIN家族分類并不十分明顯, 這可能是由于物種選擇數(shù)目不多的問題。系統(tǒng)發(fā)育分析主要將PLIN家族分為兩大支, 其中分支Ⅰ包括plin1-plin5, 分支Ⅱ只包括plin6。分支Ⅰ進(jìn)化分析顯示鱖plin2a與刺魚、紅鰭東方鲀和綠河豚在進(jìn)化距離上較為接近, 鱖plin2b則與攀鱸最為接近。脊椎動物PLIN基因家族是在脊椎動物輻射的基礎(chǔ)上進(jìn)行了兩輪全基因組復(fù)制而產(chǎn)生的, 共有4個基因:plin1、plin2、plin4-plin5-plin3集群祖先和plin6[24,29]。其中plin6作為PLIN家族的額外分支, 是硬骨魚特有的[24]。經(jīng)過一系列串聯(lián)復(fù)制和分化后產(chǎn)生了現(xiàn)在PLIN家族中的plin3、plin4和plin5基因, 完成了人類PLIN家族的5個基因庫。在硬骨魚基因組復(fù)制后, 4個PLIN家族基因變成了8個基因, 除plin2外其余的基因都恢復(fù)為單一拷貝, 本研究對鱖PLIN系統(tǒng)發(fā)育重建中也支持上述發(fā)現(xiàn)。

3.3 鱖plin2的組織表達(dá)分布

一般認(rèn)為plin2存在于中性脂滴的多種組織和培養(yǎng)細(xì)胞系中, 包括乳腺、肝臟、骨骼肌、小鼠脂肪細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞等[2,30]。本研究結(jié)果表明鱖plin2的2個亞型的組織表達(dá)情況有很大差異,plin2a基因在鱖的肝臟中表達(dá)最高, 其次是脂肪和脾臟組織。然而plin2b基因在鱖的肝臟中幾乎不表達(dá), 與其他組織相比, 在腎、胃、脂肪和腦組織中的表達(dá)水平更高?；趐lin2組織表達(dá)結(jié)果, 我們推測plin2a和plin2b在鱖脂滴形成和脂肪蓄積中的功能發(fā)生了分化,plin2a可能在鱖肝臟脂肪合成和分解中發(fā)揮更加重要的功能, 而plin2b可能主要在腎、胃、脂肪等其他組織發(fā)揮作用。

3.4 鱖plin2與肝臟脂肪蓄積密切相關(guān)

鱖等肉食性魚類對于糖類物質(zhì)利用能力差, 本實(shí)驗(yàn)室先前研究表明當(dāng)飼料中過量添加淀粉(20%)會造成鱖肝臟脂肪蓄積[18]。為了進(jìn)一步探究plin2a對鱖肝臟脂肪蓄積的影響, 首先我們通過過量投喂碳水化合物誘導(dǎo)了鱖肝臟中的脂質(zhì)含量增加。另外, 哺乳動物體內(nèi)plin2的豐度與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平直接相關(guān), 而plin2水平的升高則與脂肪堆積引起的疾病有關(guān)[28]。研究表明, 與正常人的肝細(xì)胞相比, 脂肪性肝病患者肝細(xì)胞中plin2的表達(dá)水平上調(diào)[11,14]。在喂食高脂肪或酒精飲食的小鼠中, 在酒精性肝病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?plin2表達(dá)上升并且包裹大量的脂滴[31]。因此, 我們同時構(gòu)建了鱖肝細(xì)胞高脂模型研究plin2a的作用。本研究參考了Yang等[32]利用棕櫚酸鈉誘導(dǎo)了草魚肝細(xì)胞脂肪蓄積以及實(shí)驗(yàn)室先前工作[22],采用棕櫚酸鈉添加劑來誘導(dǎo)鱖肝細(xì)胞的脂肪蓄積,先前本實(shí)驗(yàn)室研究表明用0.1 mmol/L PA對鱖肝臟原代細(xì)胞進(jìn)行刺激后, 其甘油三酯水平顯著增加且脂滴熒光強(qiáng)度增加, 因此我們選擇該濃度進(jìn)一步研究plin2功能作用[22]。我們的結(jié)果表明, 與不添加淀粉組相比, 鱖肝臟plin2a的mRNA表達(dá)水平極顯著增加。在細(xì)胞水平上同樣發(fā)現(xiàn)通過棕櫚酸鈉構(gòu)建的鱖肝細(xì)胞高脂模型中, 細(xì)胞內(nèi)plin2a的表達(dá)水平顯著增加。有研究表明,plin2作為肝臟組織中最豐富的脂滴蛋白, 與脂肪酸攝取以及脂解關(guān)系密切[11]。當(dāng)肝臟敲除plin2的小鼠飼喂高脂飼料后, 其肝臟脂肪水平降低, 同時脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制[14,15]。在哺乳動物中plin2過量表達(dá)會造成肝細(xì)胞中甘油三酯沉積, 從而導(dǎo)致脂肪變性。而抑制plin2表達(dá)可能在防止肝臟脂肪蓄積具有一定作用[31]?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn), 我們推測plin2a可能影響肝臟中脂肪合成和脂滴增加, 是鱖肝臟脂肪蓄積的重要調(diào)節(jié)因子。

綜上所述, 我們在本研究中鑒定出鱖plin2的2個亞型, 生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)分布情況表明不同亞型之間可能出現(xiàn)功能分化, 當(dāng)鱖肝臟處于脂肪蓄積狀態(tài)下plin2a表達(dá)上升, 說明該亞型可能在肝臟脂質(zhì)代謝中行使一定的功能。因此, 需要進(jìn)一步研究plin2對鱖肝臟脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制, 為闡明和預(yù)防鱖脂肪肝形成提供一定的理論依據(jù)。