大豆根際土壤產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的分離與鑒定

黃天姿，李同祥*，湯 薇，孫會(huì)剛，王繼良

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018；2.廊坊農(nóng)林科學(xué)院，河北廊坊 065000）

豆科植物具有十分廣闊的應(yīng)用空間，可將其用作生物飼料、植物肥料和土地覆蓋種植物［1］。豆類農(nóng)作物可生長(zhǎng)在世界各地的各種氣候帶、各種地形和各種土壤中［2］。農(nóng)耕土壤中，尤其是作物根際土壤，存在著豐富的、生理活動(dòng)活躍的多種微生物群落。這些微生物可與植物根系相互作用，影響植物的代謝，其中一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌統(tǒng)稱為植物根際促生細(xì)菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR）［3］。在PGPR 中，部分細(xì)菌能夠利用其自身產(chǎn)生的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基（ACC）脫氨酶，降低宿主植物根系和植物體內(nèi)的ACC 水平并減少乙烯的產(chǎn)生，進(jìn)而減弱由乙烯介導(dǎo)的對(duì)宿主植物生長(zhǎng)的抑制作用，削弱逆境脅迫對(duì)宿主植物造成的傷害，促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)［4］。因此，可以產(chǎn)生ACC 脫氨酶的細(xì)菌備受學(xué)者關(guān)注，并且被認(rèn)為在干旱、鹽堿地、農(nóng)藥污染和重金屬污染等逆境脅迫條件下能有效促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，是具有廣泛應(yīng)用潛力的一類PGPR［5］。

為篩選能產(chǎn)生ACC 脫氨酶活性的大豆根際土壤細(xì)菌，通過菌落形態(tài)、生理生化、16S rDNA 基因測(cè)序，鑒定了分離得到的5 株活性菌株，并測(cè)定了5 個(gè)菌株的ACC 脫氨酶活性，豐富了大豆根際土壤產(chǎn)ACC 脫氨酶的細(xì)菌資源，對(duì)進(jìn)一步研究大豆促生的菌種資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆根際土壤（江蘇省食品安全生物芯片檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室所屬實(shí)驗(yàn)田地取樣，土質(zhì)優(yōu)良，大豆長(zhǎng)勢(shì)較好），保存于實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)用LB、TSB、DF 及ADF 培養(yǎng)基均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及純化

精確稱取1 g 土壤，無菌水定容至100 mL，混勻備用。大豆土壤液按10 倍梯度稀釋至10-8，吸取100 μL 稀釋液于LB（TSB）培養(yǎng)基上，涂抹均勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察菌落形態(tài)。將上述菌落形態(tài)各不相同的菌株，挑出單菌落，分別劃線于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。分別劃線并重復(fù)操作3 次以上，最終劃線出其單菌落菌株，編號(hào)后置于-20 ℃冰箱保藏。

1.2.2 ACC 脫氨酶活性菌株的篩選

1）初篩。將分離出的菌株接種于DF、ADF 培養(yǎng)基（以ACC 作為唯一氮源），37 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。若菌株可以生長(zhǎng)，說明成功篩選出可降解ACC 菌株，若沒有生長(zhǎng)則表明此菌株無ACC 活性。

2）ACC 脫氨酶活性測(cè)定。以每分鐘ACC 脫氨酶催化ACC 生成1 μmol α-丁酮酸所需的酶量表示ACC 脫氨酶單位酶活［6］。通過Bradford 比色法測(cè)定酶蛋白含量。單位酶活力（U）與總蛋白質(zhì)量（mg）的比值為比活力，表示活性菌株的ACC 脫氨酶活性（U·mg-1）。ACC 脫氨酶活性計(jì)算公式如（1）所示。

1.2.3 ACC 脫氨酶活性菌株的鑒定

1）生理生化鑒定。菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察［7］。

2）16S rDNA 鑒定。提取5 株ACC 酶活性菌株總DNA，16S rDNA PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌的分離和純化

通過細(xì)菌培養(yǎng)基，篩選出10 株根際細(xì)菌，編號(hào)H1～H10，菌落形態(tài)特征見表1。從表1 可以看出，細(xì)菌的形態(tài)大小不盡相同，菌落大多呈圓形、乳黃色，有些菌落表面干燥，有些表面圓滑，分布形式密集與疏散的菌落數(shù)量大體相當(dāng)。

表1 根際細(xì)菌菌落形態(tài)特征

2.2 具有ACC 脫氨酶活性菌株篩選

從大豆根際土壤分離出的10 株細(xì)菌中，以ACC作為唯一氮源的DF、ADF 培養(yǎng)基篩選出5 株具有ACC 脫氨酶活性的菌株，菌株形態(tài)特征見圖1，ACC脫氨酶活性見表2。從表2 數(shù)據(jù)可知，H9 的ACC 脫氨酶活性最大，H2 的最小，H9 的活性約為H2 的7 倍。

圖1 H1、H2、H8、H9、H10 菌落形態(tài)

表2 5 株活性菌株的ACC 脫氨酶活性

2.3 活性菌株的鑒定

5 株活性菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果如表3 所示，基因組鑒定結(jié)果如圖3 所示。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA 序列測(cè)定，確定H1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2 為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8 為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9 為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillussp.），H10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

表3 5 株活性菌株生理生化反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

從大豆根際土壤中分離得到10 株根際細(xì)菌，從10株菌株中篩選出5 株能以ACC 作為唯一氮源的細(xì)菌。通過菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA 測(cè)序得出H1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2 為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9 為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），H10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；檢測(cè)了這5 株細(xì)菌的ACC 脫氨酶活力，其中H9 的ACC 脫氨酶活性最大，為0.097 8 U·mg-1，H2 的ACC 脫氨酶活性最小，為0.013 3 U·mg-1。

具有ACC 脫氨酶活性的微生物已被證明能在一定程度上減輕環(huán)境脅迫對(duì)植物的傷害［8］。趙龍飛等在大豆根瘤中篩選出8 株具有ACC 脫氨酶活性內(nèi)生細(xì)菌，活性最高的菌株（DD132）的酶活為15.712 U·mg-1［9］。和DD132 相比，本實(shí)驗(yàn)從大豆根際土壤中分出的5 株ACC 脫氨酶活性菌株活性低很多（活性最大的H9 僅為0.097 8 U·mg-1），可能與菌株的取樣環(huán)境不同有關(guān)（DD132 是從大豆根瘤中篩選，而H9 存在大豆根際土壤中）。