草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗體制備

楊 光，霍雨佳，蘇 紅，智達(dá)夫，劉默凝，竇傲蕾，王家業(yè)，曹貴方

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

草原短尾羊(prairie short-tail sheep)是內(nèi)蒙古自治區(qū)特有的綿羊品種，因其肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特，一直深受消費(fèi)者喜愛。Brachyury是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期中胚層細(xì)胞的標(biāo)志基因，該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子Brachyury蛋白不僅在初級(jí)中胚層細(xì)胞發(fā)揮作用，還與脊索瘤、肺癌和軟骨肉瘤等惡性癌癥密切相關(guān)[1-2]。Zhi等[3]研究表明，Brachyury基因c.G334T錯(cuò)義突變可能是造成綿羊短尾表型的主要原因；研究還發(fā)現(xiàn)，Brachyury突變也會(huì)造成小鼠尾部變短，而Brachyury純合突變的小鼠會(huì)在第10.5天因尿囊無(wú)法正常形成而致死[4-6]。Guillomot等[7]研究指出，綿羊BrachyurymRNA僅在胚胎時(shí)期表達(dá)，但未對(duì)Brachyury蛋白在胚胎時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行研究。Brachyury蛋白的表達(dá)對(duì)哺乳動(dòng)物原條的形成至關(guān)重要，且與上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)細(xì)胞群的發(fā)生相關(guān)，EMT細(xì)胞群是內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞的前體，并決定哺乳動(dòng)物胚胎軸向結(jié)構(gòu)的延伸[8-9]。Brachyury蛋白在EMT細(xì)胞群中瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)此類細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)建立具有重要作用[10-11]。在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Brachyury蛋白表達(dá)始于胚胎發(fā)育中的原腸時(shí)，止于中胚層細(xì)胞伴隨EMT作用遷移至胚胎的側(cè)部時(shí)[10]。在胚胎發(fā)育后期，Brachyury蛋白僅在胚胎的尾端中表達(dá)[12]。當(dāng)WNT信號(hào)通路(Wnt/β-catenin pathway)和FGF信號(hào)通路(Fgf pathway)激活Brachyury蛋白表達(dá)后，Brachyury激活wnt3a和Fgf4/8基因的表達(dá)[12-14]，二者維持了體軸延伸過(guò)程中中胚層祖細(xì)胞的聚集。在Brachyury基因雜合突變小鼠中，由于中胚層祖細(xì)胞的聚集作用減弱，出現(xiàn)胚胎后部發(fā)育截?cái)嗟默F(xiàn)象[15-16]，從而造成了短尾表型。在其他研究[12,17]中也發(fā)現(xiàn)了Brachyury蛋白的靶基因wnt3a和Fgf4/8突變同樣會(huì)造成短尾表型，以上研究暗示Brachyury蛋白在胚胎軸向延伸中的作用。

目前，市面上缺少綿羊Brachyury蛋白多克隆抗體，本試驗(yàn)克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全長(zhǎng)，并將其連接至pEASY?-Blunt E1載體中進(jìn)行原核表達(dá)，再將重組蛋白免疫日本大耳白兔，制備Brachyury蛋白多克隆抗體，旨在為草原短尾羊短尾形成機(jī)制研究提供重要的試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

6周齡日本大耳白兔，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；草原短尾羊，購(gòu)自呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗錫尼河鎮(zhèn)蘇和巴特爾家庭牧場(chǎng)，公羊母羊自然交配當(dāng)天記為胚胎0.5 d，按計(jì)劃時(shí)間(胚胎16，20，25和30 d)對(duì)草原短尾母羊宰殺并采集子宮，用含有1%雙抗的生理鹽水將胚胎從子宮內(nèi)沖出，迅速放入液氮中保存。

SOB無(wú)菌液體培養(yǎng)基、SOC無(wú)菌液體培養(yǎng)基、TB無(wú)菌液體培養(yǎng)基、RosettagamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、包涵體洗滌液、包涵體溶解液、動(dòng)物全蛋白提取試劑盒、SanPrep質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒、PageRuler 預(yù)染蛋白Marker，均購(gòu)自上海生工公司；pEASY?-Blunt E1 Expression Kit、Trans 10 Chemically Competent Cell、ProteinFind?Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、ProteinFind?Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、ProteinFind?Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自諾南京唯贊生物公司；RNA fast 200總RNA極速抽提試劑盒，購(gòu)自上海飛捷生物公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，購(gòu)自碧云天生物公司；透析袋MD 25(8000-14000D)、ELISA 套裝試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶公司；試驗(yàn)所用DNA Marker，購(gòu)自TaKaRa公司；弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)、弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)和剩余生化試劑，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 草原短尾羊Brachyury基因CDS全長(zhǎng)克隆

從液氮中取出草原短尾羊16 d的胚胎，研成粉末后提取總RNA，使用NanoDropTM2000熒光分光光度計(jì)對(duì)其濃度和污染降解等情況進(jìn)行鑒定，將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，備用。

以NCBI中綿羊Brachyury(XM_027972732.1)作為參考序列，使用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5′-CGGCTAGCCGATGACCTCCCC-GGGCACCG-3′(劃線部分為NheⅠ限制酶切位點(diǎn))，下游引物序列為：5′-TTTGATATCTCACATGGACGGGGGCGACACG-3′(劃線部分為EcoR Ⅰ限制酶切位點(diǎn))。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Brachyury基因CDS全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 20 μL，2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，68 ℃退火15 s,72 ℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。

1.3 原核表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1-Brachyury的構(gòu)建與鑒定

將膠回收的Brachyury基因CDS全長(zhǎng)序列連接至pEASY?-Blunt E1載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1-Brachyury。將pEASY?-Blunt E1-Brachyury導(dǎo)入Trans 10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用SOB無(wú)菌液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)于37 ℃、200 r/min條件下擴(kuò)增培養(yǎng)1 h。取菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基中，置37 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14 h后，挑取單克隆菌落加入SOB無(wú)菌液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中， 37 ℃、200 r/min條件下擴(kuò)增培養(yǎng)16 h，對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，并送往上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序后的重組質(zhì)粒序列輸入Bio-Sof網(wǎng)站(http://www.bio-soft.net/sms/codon_plot.html)進(jìn)行稀有密碼子預(yù)測(cè)。

1.4 重組Brachyury蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將測(cè)序比對(duì)正確的pEASY?-Blunt E1-Brachyury質(zhì)粒導(dǎo)入RosettagamiB(DE3)大腸桿菌中，使用TB無(wú)菌液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)在37 ℃、200 r/min條件下擴(kuò)增培養(yǎng)14 h。將培養(yǎng)好的菌液倒入50 mL TB無(wú)菌液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液在600 nm處吸光值為0.5至0.8時(shí)，向其中加入IPTG溶液(終濃度為0.4 mmol/L)， 37 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)3或4 h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用10 mL PBS溶液重懸沉淀，用超聲破碎儀破碎1 h。破碎條件為：40 W工作15 s，停5 s；將破碎后的溶液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌和溶解；對(duì)溶解后的沉淀和上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。試驗(yàn)同時(shí)設(shè) 插入pEASY?-Blunt E1的RosettagamiB(DE3)菌株、未導(dǎo)入pEASY?-Blunt E1-Brachyury載體質(zhì)粒的RosettagamiB(DE3)菌株和未加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的RosettagamiB(DE3)重組表達(dá)菌株為對(duì)照。電泳完成后將膠塊放入1 mmol/L KCl溶液中浸泡10 min；在白色條帶顯出后，將對(duì)應(yīng)在49 ku的白色條帶切下放入透析袋中，并向透析袋中加入2 mL蛋白質(zhì)電泳緩沖液，將透析袋放入含有蛋白質(zhì)電泳緩沖液的電泳槽中60 V電泳12 h；電泳后將透析袋放入PBS溶液中脫鹽6 h，期間每隔1 h更換1次PBS溶液；將透析袋取出后在其表面覆蓋PEG粉末進(jìn)行蛋白質(zhì)濃縮，待透析袋內(nèi)溶液濃縮為約1 mL時(shí)停止，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.5 重組Brachyury蛋白多克隆抗體的制備及血清效價(jià)的鑒定

將重組Brachyury蛋白稀釋至0.2 mg/mL，與等體積的弗氏完全佐劑混勻和乳化，采用皮下多點(diǎn)注射對(duì)兔子進(jìn)行初次免疫，同時(shí)設(shè)立未免疫的兔子為對(duì)照組。在初次免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫，第2次免疫所用佐劑為弗氏不完全佐劑，注射體積為第1次的1/2；第2次免疫7 d后進(jìn)行第3次免疫，注射體積為第1次的1/4，佐劑與第2次免疫相同；第3次免疫7 d后取兔耳緣靜脈血，用于檢測(cè)血清抗體效價(jià)。將重組Brachyury蛋白稀釋至10 μg/L，加入酶標(biāo)板各孔，200 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜；次日棄液后向孔中加入250 μL封閉液，將血清抗體作為一抗按照1∶87.5，1∶175，1∶350，1∶750，1∶1 500，1∶3 000，1∶6 000稀釋后加入，100 μL/孔，37 ℃孵育2.5 h；再向各孔加入二抗ProteinFind?Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)100 μL，在室溫下反應(yīng)1 h后棄液洗滌。最后向每孔加入100 μL TMB底物顯色液，37 ℃反應(yīng)15 min后加入50 μL終止反應(yīng)液，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量酶標(biāo)板中各孔的吸光值(OD450)。

1.6 草原短尾羊各個(gè)時(shí)期胚胎中Brachyury蛋白表達(dá)測(cè)定

使用動(dòng)物全蛋白提取試劑盒提取草原短尾羊16，20，25和30 d胚胎組織全蛋白，以血清多克隆抗體作為一抗，以ProteinFind?Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)作為二抗采用Western blot法檢測(cè)Brachyury蛋白在不同階段胚胎中的表達(dá)量，試驗(yàn)設(shè)GAPDH蛋白為內(nèi)參，以ProteinFind?Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody作為一抗，ProteinFind?Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)作為二抗，用Western blot法檢測(cè)胚胎組織全蛋白樣品中GAPDH蛋白的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Brachyury基因CDS全長(zhǎng)的克隆及原核表達(dá)載體的鑒定

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1)顯示目的條帶長(zhǎng)度為1 000～2 000 bp，與預(yù)期目的片段大小(1 335 bp)相符。

M.DL 2000 Marker；1.Brachyury基因CDS全長(zhǎng)

pEASY?-Blunt E1-Brachyury質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切后，得到2條條帶，位置分別為5 716和1 335 bp(圖2)，與預(yù)期條帶大小符合。結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1-Brachyury構(gòu)建成功。

M.DL 15000 Marker;1.pEASY?-Blunt E1-Brachyury質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 Brachyury基因序列對(duì)比及稀有密碼子預(yù)測(cè)

對(duì)BrachyuryCDS序列中所含稀有密碼子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，CGA 1個(gè)、CGG 3個(gè)、AGG 4個(gè)、AGA 2個(gè)、GGA 5個(gè)、GGG 10個(gè)、AUA 0、CUA 2個(gè)、CCC 18個(gè)和ACG 4個(gè)；其中CCC和ACG連續(xù)有1個(gè)、AGG和AGG連續(xù)有1個(gè)、GGA和GGG連續(xù)有1個(gè)、CUA和GGA 連續(xù)有1個(gè)、CUA和CCC 連續(xù)有1個(gè)。由于稀有密碼子較多可能會(huì)降低蛋白表達(dá)水平，所以選擇RosettagamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞作為宿主進(jìn)行原核表達(dá)。

黑色方框表示稀有密碼子

2.3 重組Brachyury蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

如圖4-A所示，IPTG誘導(dǎo)3和4 h的菌液沉淀均在43～55 ku有條帶出現(xiàn)，符合預(yù)期條帶大小(49.16 ku)，其中IPTG誘導(dǎo)4 h的菌液沉淀中Brachyury蛋白表達(dá)量較大，表明該條件下重組Brachyury蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。使用ProteinFind?Anti-His Mouse Monoclonal Antibody作為一抗，對(duì)切膠純化后的融合蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果(圖4-B)顯示在49.16 ku處有單一條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。上述結(jié)果表明，重組Brachyury蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

A.重組Brachyury蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):M.PageRuler預(yù)染蛋白Marker；1.插入pEASY?-Blunt E1的RosettagamiB(DE3)菌株；2.未導(dǎo)入pEASY?-Blunt E1-Brachyury載體質(zhì)粒的RosettagamiB(DE3)菌株；3.未加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的RosettagamiB(DE3)重組表達(dá)菌株；4，5.分別為IPTG誘導(dǎo)3 h的菌液上清液和沉淀；6，7.分別為IPTG誘導(dǎo)4 h的菌液上清液和沉淀。B.重組Brachyury蛋白的純化鑒定:M.PageRuler預(yù)染蛋白Marker；1.重組Brachyury蛋白

2.4 重組Brachyury蛋白多克隆抗體的效價(jià)

iELISA檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，重組Brachyury蛋白多克隆抗體效價(jià)為1∶1 500。

表1 重組Brachyury蛋白多克隆抗體效價(jià)的 iELISA檢測(cè)結(jié)果

2.5 草原短尾羊不同時(shí)期胚胎中Brachyury蛋白的表達(dá)水平

以制備的重組Brachyury蛋白多克隆抗體作為一抗，對(duì)草原短尾羊16，20，25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果(圖5)顯示在49.16 ku處出現(xiàn)單一的目的條帶，表明所制備的血清多克隆抗體有良好的免疫原性，可以特異識(shí)別草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白，其中草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白表達(dá)量最高。

M.PageRuler預(yù)染蛋白Marker；1～4分別為30，25，20，16 d胚胎

3 討 論

有研究指出，哺乳動(dòng)物的體節(jié)延伸離不開神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞的EMT作用，在此作用中Brachyury蛋白維持體軸正常的延伸[18]。Carolina等[19]研究表明，Brachyury蛋白下游靶基因包括參與EMT作用的基因，結(jié)合草原短尾羊群體中存在的尾椎骨畸形[3,20]現(xiàn)象以及基因組重測(cè)序結(jié)果可以推測(cè)：Brachyuryc.G334T 錯(cuò)義突變影響了下游靶基因與蛋白的結(jié)合，引起體軸延伸異常，從而導(dǎo)致綿羊短尾表型。在其他短尾動(dòng)物的研究中[21-23]也有相似結(jié)論。將草原短尾羊與小鼠的Brachyury蛋白氨基酸序列對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)所在區(qū)域的同源性較高，對(duì)小鼠Brachyury基因的第334位進(jìn)行G→T點(diǎn)突變后均出現(xiàn)短尾表型[24-25]，且為雜合個(gè)體，純合突變小鼠在胚胎10.5 d時(shí)停止發(fā)育；但與小鼠不同的是，草原短尾羊中Brachyury純合突變個(gè)體卻可以存活[26]，這一差異現(xiàn)象背后所涉及的分子機(jī)制還有待深入探究。

此外有研究指出，綿羊短尾性狀還與尾部脂肪沉積量有關(guān)[27-29]，但此類研究中所篩選到的候選基因并不完全一致，這可能與綿羊種類[29-31]和研究中所參考基因組序列版本[29,31-32]不同有關(guān)，但仍可推測(cè)造成短尾性狀的原因并不唯一，尾部脂肪沉積較少和尾椎骨畸形兩種表型背后的分子機(jī)制是否存在關(guān)聯(lián)，也有待后續(xù)探究。

本試驗(yàn)采用切膠方式純化蛋白，與鎳柱純化相比，操作更為簡(jiǎn)便，且所純化重組Brachyury蛋白中雜蛋白的相對(duì)含量較低。此外，本試驗(yàn)所得到的重組Brachyury蛋白主要以包涵體形式存在，上清液中所含有的重組Brachyury蛋白較少，下一步試驗(yàn)應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，使可溶性重組蛋白表達(dá)量增多，繼續(xù)探究突變與野生型Brachyury蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。

目前對(duì)綿羊胚胎各個(gè)時(shí)期Brachyury蛋白表達(dá)量變化的研究較少，其中一部分原因由于市面缺少綿羊Brachyury抗體。本研究克隆Brachyury基因CDS，由于該序列存在一定數(shù)量的稀有密碼子，可能造成蛋白表達(dá)量較少，所以使用RosettagamiB(DE3)菌株作為原核表達(dá)宿主，并構(gòu)建pEASY-Blunt E1-Brachyury原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)純化重組Brachyury蛋白，3次免疫日本大耳白兔后制備抗體血清。將其作為一抗對(duì)草原短尾羊不同時(shí)期胚胎進(jìn)行Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，目的條帶單一，可以特異識(shí)別短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白，且草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表達(dá)量最高。