一例加州鱸幼魚高傳染性疾病的診斷與思考

顧雪林，菅攀陽(yáng)，魏 賓，鈕 靜，宋學(xué)宏

(1.蘇州市吳中區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123)

加州鱸在蘇州已有30余年的養(yǎng)殖與繁殖歷史，目前已成為蘇州市三大主導(dǎo)養(yǎng)殖品種之一，年產(chǎn)量達(dá)2.5萬(wàn)噸。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖年限的增加，加州鱸育苗過(guò)程中的病害問(wèn)題日益突出，病害嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)90%，引起巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重挫傷了從業(yè)者的養(yǎng)殖積極性。

本文通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、癥狀觀察、病原學(xué)檢測(cè)等技術(shù)，對(duì)蘇州市吳中區(qū)的一例加州鱸苗種培育階段的高傳染性疾病進(jìn)行診斷分析，為控制該病繼續(xù)蔓延提供防控思路。

一、流行病學(xué)調(diào)查

蘇州市吳中區(qū)某加州鱸養(yǎng)殖育苗場(chǎng)共有8個(gè)600米2的鋪底膜塘口，從廣東引入加州鱸種魚自繁自育。因自繁苗不夠，在2021年3月中旬外購(gòu)4 000尾/千克的加州鱸魚苗放養(yǎng)于1號(hào)塘，放養(yǎng)密度為40萬(wàn)尾/畝，飼養(yǎng)至體長(zhǎng)約3厘米時(shí)分塘。4月水溫20～22℃時(shí)1號(hào)塘出現(xiàn)魚苗死亡，半個(gè)月內(nèi)其余7口陸續(xù)出現(xiàn)死亡，均為拉網(wǎng)分塘后出現(xiàn)死亡。至5月，池塘水溫逐漸升至25～27℃，魚苗長(zhǎng)至3～8厘米時(shí)死亡量增加，死亡率達(dá)80%。發(fā)病魚池底部滋生青苔，水體亞硝酸鹽0.41毫克/升、氨氮0.3毫克/升、pH 8.2、溶氧7～8毫克/升。1號(hào)塘發(fā)病初期內(nèi)服氟苯尼考、維生素C等，外潑碘制劑，病情有所好轉(zhuǎn)，但半個(gè)月后水溫上升時(shí)病情惡化，出現(xiàn)大批量死亡。

二、臨床癥狀

病魚體表發(fā)黑，背鰭、尾鰭基部發(fā)白，于水面上慢游、棲邊，反應(yīng)遲鈍，少量魚在水面螺旋式打轉(zhuǎn)(圖1A)；取病魚觀察，嚴(yán)重者體表發(fā)黑，背鰭、尾鰭基部無(wú)鱗、潰爛(圖1B)；下頜與胸鰭基部出血(圖1C)。解剖觀察，肝臟與脾臟腫大、發(fā)白、充血(圖2A)，腎臟腫大(圖2B)；胃部食物少，空腸空胃，嚴(yán)重者腹腔具血水(圖2C)。

圖1 患病加州鱸體表病癥

圖2 患病加州鱸內(nèi)臟器官癥狀

三、病原學(xué)分析

1.寄生蟲檢測(cè)

取典型的發(fā)病魚8尾，肉眼查看和顯微鏡檢測(cè)，體表、鰭、鰓、眼、口腔未見寄生蟲；解剖后肉眼觀察和顯微鏡檢查，肝臟、脾、腎臟、腸道、胃也沒有寄生蟲。

2.細(xì)菌檢測(cè)

采集10尾瀕臨死亡的發(fā)病魚，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下解剖，以平板劃線法從患病魚的肝分離細(xì)菌，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，獲1株優(yōu)勢(shì)菌。菌落特征為米白色、邊緣整齊、針尖大小的圓形菌落，經(jīng)細(xì)菌的生理生化鑒定，并將純培養(yǎng)菌株進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，鑒定結(jié)果為遲緩愛德華氏菌，生物型21311，可信度為98.95%。

3.病毒檢測(cè)

針對(duì)加州鱸幼魚發(fā)病癥狀以及高傳染性現(xiàn)象，懷疑感染病毒，因此檢測(cè)加州鱸常見的彈狀病毒(MSRV)、虹彩病毒(LMBV)及傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)。根據(jù)GenBank中MSRV的N基因(MT818233.1)、LMBV的MCP基因(MK681855.1)、ISKNV的MCP基因(AF371960.1)等序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，MSRV-F：ATGCCATATCCTGGTTCGTGA，MSRV-R：AACCCGAGCACTGGAGAAAC；LBMV-F：TACCGTCGTGTTTAGCCTTGTAC，LBMV-R：GGTGACCTGAGACCCACTATCG；ISKNV-F：GAATTCATGTCTGCAATCTCAGGTG，ISKNV-R：CTCGAGTTACAGGATAGGGAAGC；預(yù)測(cè)擴(kuò)增子大小分別為152、658、1 392 bp。采集9尾病魚，分別提取病魚的肝、脾、腎、鰓、肌肉、腸道、胃、腦，3尾為1組，分別提取總RNA和DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在部分病魚的腦部MSRV出現(xiàn)弱陽(yáng)性，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2次擴(kuò)增后，條帶明顯增強(qiáng)，但其他組織未檢測(cè)到MSRV(圖3A)；在各種組織中LMBV均顯示強(qiáng)陽(yáng)性，只在肝組織的1條泳道為陰性(圖3B)；ISKNV則均為陰性(圖3C)。

圖3 PCR鑒定結(jié)果

四、診斷結(jié)果

綜合上述流行病學(xué)調(diào)查、水質(zhì)監(jiān)測(cè)及病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，這一起加州鱸幼魚高傳染性疾病診斷為加州鱸虹彩病毒、遲緩愛德華氏菌共患病，并攜帶彈狀病毒，屬于病毒與細(xì)菌病并發(fā)癥。

五、分析與討論

1.細(xì)菌與病毒并發(fā)，細(xì)菌病防治方法療效甚微

目前，對(duì)加州鱸危害較大的細(xì)菌性疾病包括諾卡氏菌病、遲緩愛德華氏菌病、嗜水氣單胞菌病、溫和氣單胞菌病、維氏氣單胞菌病等。單一的遲緩愛德華氏菌病，可采用外潑二氧化氯或碘制劑、內(nèi)服恩諾沙星或氟苯尼考加以控制。但是，遲緩愛德華氏菌與虹彩病毒共同感染時(shí)，內(nèi)服氟苯尼考與維生素C，加上外潑碘制劑，治療效果甚微，最終導(dǎo)致大量死亡。因此，防止此病的蔓延關(guān)鍵在于預(yù)防。

2.加強(qiáng)檢疫是防控加州鱸幼魚彈狀病毒與虹彩病毒病的關(guān)鍵

加州鱸病毒性疾病主要由彈狀病毒、虹彩病毒及傳染性脾腎壞死病毒引起。此類疾病至今尚無(wú)專一藥物及治療方法，主要通過(guò)施用疫苗、抗體和免疫增強(qiáng)劑加以預(yù)防。加州鱸彈狀病毒是RNA病毒，發(fā)病時(shí)水溫一般為18～25℃。在4-5月及10-11月期間，一旦轉(zhuǎn)料不當(dāng)或長(zhǎng)途運(yùn)輸，感染病毒的魚入池1周內(nèi)就會(huì)大量死亡。加州鱸虹彩病毒是一種DNA病毒，通常使成魚發(fā)病，高發(fā)于水溫25～30℃的季節(jié)，水溫突然上升、溶氧降低、藥物刺激、過(guò)量投餌等是該病暴發(fā)的主要誘因。它們主要通過(guò)水體、餌料、魚體間摩擦進(jìn)行水平傳播，彈狀病毒也能通過(guò)親魚垂直傳播給苗種。因此，可以推測(cè)，本次加州鱸幼魚高傳染性疾病的暴發(fā)是因引入的魚苗已感染虹彩病毒；彈狀病毒可能引入親魚時(shí)就傳入，經(jīng)過(guò)繁殖傳給幼魚；也可能是由引入的苗種帶入。頻繁的魚苗分塘操作、轉(zhuǎn)料不當(dāng)?shù)仁箯棤畈《驹隰~體內(nèi)快速繁殖，導(dǎo)致魚苗免疫力下降、在池塘中打轉(zhuǎn)，乃至死亡。隨著養(yǎng)殖水溫升高，彈狀病毒繁殖受到抑制，但由于魚的免疫力低下，攝食量下降，殘餌多，高溫下水質(zhì)很快惡化，致使虹彩病毒在魚體內(nèi)大量擴(kuò)增，最終導(dǎo)致疾病暴發(fā)和快速傳播。

本案例中核酸檢測(cè)結(jié)果與上述推測(cè)基本一致，病魚組織中虹彩病毒病載量大，陽(yáng)性率100%；彈狀病毒只在魚腦組織中顯示弱陽(yáng)性；傳染性脾腎壞死病毒均是陰性。這一結(jié)果說(shuō)明，加州鱸虹彩病毒同樣可使加州鱸幼魚發(fā)病，彈狀病毒病與虹彩病毒病一旦暴發(fā)，損失慘重。從該病流行特點(diǎn)看，控制加州鱸病毒病的關(guān)鍵是嚴(yán)格實(shí)施苗種引入的檢疫制度；做好引種、引苗時(shí)的核酸檢測(cè)工作，是防止這類疾病蔓延的關(guān)鍵。

3.日常管理到位是防控病毒病的重要手段

從本案例加州鱸幼魚發(fā)病至暴發(fā)死亡的過(guò)程可以發(fā)現(xiàn)，以下幾個(gè)管理問(wèn)題導(dǎo)致魚體損傷、應(yīng)激，使病原快速傳播：①魚苗頻繁拉網(wǎng)產(chǎn)生外傷和應(yīng)激；②開始轉(zhuǎn)料時(shí)，大顆粒飼料比例太高，造成轉(zhuǎn)料不當(dāng)，飼料浪費(fèi)，且敗壞水質(zhì)；③發(fā)病池與健康池網(wǎng)具混合使用，增加了病毒傳播概率與速度。

加州鱸苗種培育階段高傳染性細(xì)菌性、病毒性疾病的防控，必須做好以下幾項(xiàng)日常管理工作：①發(fā)病池工具需單獨(dú)使用、及時(shí)消毒；②轉(zhuǎn)料時(shí)不同粒徑飼料的配比要適宜；③拉網(wǎng)前池塘中潑灑維生素C等抗氧化劑，以提高魚苗抗應(yīng)激能力；④在飼料中添加適量動(dòng)保產(chǎn)品，以保護(hù)肝臟、增強(qiáng)魚的體質(zhì)；⑤采用微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)，改善底質(zhì)環(huán)境，最大程度降低病毒、細(xì)菌的滋生和繁殖。