魚用疫苗免疫途徑的研究概況(下)

藺玉珍，王偉偉，黃孔陽，盧 武

(嵊州市甘霖鎮(zhèn)人民政府，浙江 紹興 312462；嵊州市畜牧業(yè)發(fā)展中心，浙江 紹興 312400)

2.提高口服免疫效果的措施

口服疫苗免疫效果并不十分理想，主要是由于抗原受到胃酸的作用和蛋白酶的水解，使抗原到達(dá)后腸部位時(shí)，其完整性和免疫部位已被破壞或抗原被消化掉，沒有足夠的抗原到達(dá)后腸(Quentel C等，1997)。因此，為了使抗原在魚的前腸不被消化，則發(fā)展了許多的包裹材料來保護(hù)抗原。現(xiàn)如今，常用的有海藻酸鈉、明膠、聚交酯醣酯聚合物、鹵蟲、生物被膜等材料。

(1)海藻酸鈉。海藻酸鈉是一種天然多糖類化合物，是從褐藻中提取而來的，現(xiàn)已作為包裹藥品和細(xì)胞的材料，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性等特性(Chan L W等，2002)，Joosten等(1997)用海藻酸鈉包裹溶藻弧菌免疫虹鱒和鯉魚，其結(jié)果顯示在魚體中有抗體產(chǎn)生。Tian等(2008)用海藻酸鈉包裹含有能夠表達(dá)淋巴囊腫病毒蛋白的質(zhì)粒進(jìn)行口服免疫日本牙鲆，檢測免疫3～16周牙鲆的抗體效價(jià)，表明其效果明顯。Romalde等(2004)認(rèn)為通過口服海藻酸鈉微囊化的疫苗雖然不能作為初次免疫的方法，但對魚有較好的保護(hù)效果。Altun等(2010)也用海藻酸鈉包裹L.garvieae bacterin疫苗口服免疫虹鱒魚，其結(jié)果表明，在免疫30天后的RPS為53%，61天后對魚體進(jìn)行二次免疫，120天時(shí)其RPS達(dá)到61%，效果明顯。李新華等(2007)用海藻酸鈉包裹嗜水氣單胞菌疫苗口服免疫銀鯽，結(jié)果表明微膠囊疫苗組血清抗體效價(jià)較高，且維持時(shí)間長，對口服免疫效果有明顯的提升。

(2)聚交酯醣酯聚合物。目前，聚交酯醣酯聚合物也被應(yīng)用于魚類口服疫苗的包裹技術(shù)上，它是一種疏水型的聚酯(Tian J Y等，2008)，降解性好且無毒，而且容易生產(chǎn)，價(jià)格便宜。Tian等(2008)利用聚交酯醣酯聚合物包裹LCDV的DNA疫苗免疫日本牙鲆，免疫90天后，在日本牙鲆體內(nèi)各組織中檢測到LCDV的mRNA，而且用ELISA在1～24周均可檢測到抗體。Altun等(2010)分別利用聚交酯醣酯聚合物和海藻酸鈉包裹L.garvieae bacterin免疫虹鱒，聚交酯醣酯聚合物為包裹材料的免疫效果比海藻酸鈉為包裹材料的好。

(3)鹵蟲。Campbell等(1993)利用鹵蟲無節(jié)幼體為載體的口服疫苗，通過ELISA方式監(jiān)測鰻弧菌的攝入過程，結(jié)果表明疫苗濃度不影響鹵蟲的攝取速度。Gomez-Gil等(1998)認(rèn)為，鹵蟲攝食細(xì)菌的數(shù)量是依賴死細(xì)菌的數(shù)量，同時(shí)活細(xì)菌的數(shù)量對鹵蟲攝食有一定的影響。Chair等(1994)用吞食有鰻弧菌的鹵蟲無節(jié)幼體口服免疫歐洲鱸，盡管其保護(hù)率并沒有明顯的提高，但是免疫后的魚卻能更好地生長，增強(qiáng)飼料的轉(zhuǎn)化率和應(yīng)對外界的各種應(yīng)激。Joosten等(1995)也用鹵蟲無節(jié)幼體作為載體攝食鰻弧菌進(jìn)行免疫不同年齡組的鯉魚和金頭鯛，口服免疫后的魚體在10天后接受注射免疫，其結(jié)果表明，15～29日齡的魚苗抗體水平受到抑制，而58日齡的魚苗抗體水平有所上升；57日齡和59日齡的鯛魚在21天后進(jìn)行再次免疫，其抗體水平有顯著的升高。Lin等(2005)表明用福爾馬林滅活大腸桿菌表達(dá)綠膿桿菌外毒素投喂鹵蟲無節(jié)幼體，然后形成一種基于食物鏈的口服免疫系統(tǒng)，最后以鹵蟲無節(jié)幼體來口服免疫斑馬魚，30天后分別對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，最終免疫組的存活率為81%，而對照組的存活率為31%。

(4)其他方法。脂質(zhì)體包裹疫苗可以延緩疫苗被消化、降解的時(shí)間，同時(shí)也是一種很好的疫苗佐劑，能夠增強(qiáng)口服疫苗的免疫原性。此外，生物被膜也是一種很好的疫苗佐劑，能夠保護(hù)抗原，從而能到達(dá)后腸，起到免疫保護(hù)的效果(Azad I S等，1999)。

近年來新型的植物口服疫苗也引起人們的普遍關(guān)注，與傳統(tǒng)的疫苗相比，植物口服疫苗具有很多優(yōu)勢。植物本身所具有的纖維組織，可以更好地保護(hù)疫苗，防止其在前腸中消化降解(Richter L等，1999)。其表達(dá)產(chǎn)物能夠進(jìn)行正確裝配和翻譯后修飾加工，與天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性都非常相似。

三、浸泡免疫

浸泡免疫是將魚體直接放入特定濃度的疫苗液中，經(jīng)過一定時(shí)間浸泡，讓抗原通過浸泡進(jìn)入魚體，刺激其產(chǎn)生免疫應(yīng)答。浸泡免疫具有操作簡單、對魚體損傷小且可結(jié)合魚體運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。目前浸泡方式有3種，分別為高滲浸泡、直接浸泡和噴霧免疫方式。高滲浸泡是短時(shí)間利用尿素或氯化鈉對魚體進(jìn)行高滲脫水，再將其放入疫苗溶液中，讓魚體能較快吸收，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。直接浸泡較為簡單，只需要將魚體放入疫苗溶液即可。此兩種浸泡方式各有優(yōu)劣，高滲浸泡能夠提高魚體攝食抗原的能力，同時(shí)也能提高魚體的保護(hù)率，但對魚體傷害較大，會對魚體產(chǎn)生較大刺激。賀路等(1999)在實(shí)驗(yàn)過程中認(rèn)為浸泡免疫能達(dá)到較好效果，能明顯提升魚體成活率。而Tatner等(1983)、Anderson(1979)卻認(rèn)為浸泡免疫效果不明顯，無法起到應(yīng)有的效果。噴霧免疫是利用一定濃度的疫苗溶液直接霧化噴射魚體的一種免疫方法，最初用于弧菌疫苗免疫魚體，且免疫魚體大小不限，能夠免疫大于20克/尾的魚。Gould等(1978)認(rèn)為噴霧壓力大小不影響其免疫效果，均能達(dá)到要求。然而，噴霧免疫也存在較大不足，其操作程序較多，要經(jīng)過捕撈、運(yùn)送、噴霧等環(huán)節(jié)(Robles R等，1998)，會對魚體產(chǎn)生較大的刺激。

其他的方法如淋浴和沖洗(Anderson D P等，1979)進(jìn)行免疫魚體，均能起到一定的效果。淋浴免疫的優(yōu)勢就是對免疫魚體的刺激小，但是需要大量的疫苗(Nakanishi T等，1997)。用滅活駝背石斑魚神經(jīng)壞死病毒(HGNNV)作為疫苗來淋浴免疫橙點(diǎn)石斑魚，用二甲基亞砜滅活HGNNV作為疫苗，以TCID50為107個(gè)/毫升免疫魚體120分鐘，免疫后30天和90天的相對存活率分別為87%和82%，可以很好地證明淋浴免疫的有效性(Kai Y H等，2008)。

1.浸泡免疫機(jī)理

魚類作為低等脊椎動物，其免疫防御系統(tǒng)調(diào)控基因以及基因控制產(chǎn)物同高等脊椎動物基本相似，具有相關(guān)組織、細(xì)胞及分子行使免疫功能(Hashimoto I等，1990；Secombes C J等，1996)。系統(tǒng)免疫和黏膜免疫共同完成魚類疾病的防御功能。

魚類是生活在水環(huán)境中的群生動物，其鰓、皮膚及腸道等黏膜組織往往是與外界環(huán)境首先接觸到的，并且接觸面積最大(Dalmo R A等，1997)，在自然狀況下，也是大多數(shù)病原入侵時(shí)首先接觸的部位。因此，魚的鰓、皮膚黏膜組織不僅具有非特異性免疫功能，同時(shí)也具有特異性的免疫應(yīng)答功能(Dos Santos N M S等，2001；Xu D H等，2002)。另外，魚的黏膜組織及其分泌黏液中含有豐富的非特異性免疫因子(Bergsson G等，2005；Mulder I E等，2007)，與特異性抗體蛋白共同構(gòu)成抵御病原微生物侵入的第一道防線。解剖學(xué)研究表明，魚的皮膚由內(nèi)層的真皮層、外層的表皮、衍生物及附屬結(jié)構(gòu)組成，其中表皮主要由上皮細(xì)胞組成，分布有黏液細(xì)胞和囊狀細(xì)胞(Press C M等，1999；Fast M D等，2002)。羅曉春等(2005)發(fā)現(xiàn)在斜帶石斑魚表皮和真皮層之間，游離著許多白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，Lobb(1987)在河鲇的皮膚中也發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞的存在，利用單克隆抗體免疫組化標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在受精兩個(gè)半月以上的鯉魚皮膚中發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此外，Xu等(2002)研究表明，皮膚表皮中存在抗體分泌細(xì)胞。Vervarcke等(2005)用弧菌全菌疫苗浸泡非洲鲇，則在免疫魚的體表黏液中檢測到抗體蛋白。上述結(jié)果表明，在一些魚的皮膚中存在著免疫功能細(xì)胞，但此細(xì)胞是否起源于皮膚組織，則有待于進(jìn)一步的研究。另外，在魚的皮膚組織及分泌黏液中存在許多非特異性免疫因子，如水解酶、菌酶轉(zhuǎn)移因子、幾丁質(zhì)、C-反應(yīng)蛋白、凝集素等。

鰓組織中存在有大淋巴細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等各種細(xì)胞。Lin等(1999)認(rèn)為虹鱒的鰓組織存在巨噬細(xì)胞，具有明顯的吞噬活性。華育平等(2005)認(rèn)為史氏鱘的鰓組織中存在溶菌酶。在大西洋鮭的鰓組織中也存在協(xié)助抗原呈遞的巨噬細(xì)胞。

目前大量研究表明，黏膜免疫反應(yīng)可以獨(dú)立于系統(tǒng)免疫反應(yīng)，而產(chǎn)生局部的免疫應(yīng)答，即能夠獨(dú)立完成對抗原的識別、捕捉、呈遞和抗體分泌等一系列反應(yīng)的特異性免疫應(yīng)答全過程，利用浸泡免疫能夠引起魚體的免疫過程一般以黏膜免疫反應(yīng)為主。Esteve-Gassent等(2004)研究表明，浸泡免疫后魚的鰓、皮膚和腸黏膜組織表面黏液中抗體水平、抗體分泌細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，能引起較為明顯的免疫應(yīng)答，而系統(tǒng)免疫反應(yīng)較弱，且反應(yīng)時(shí)間晚于黏膜組織。Moore等(1998)發(fā)現(xiàn)抗原的攝取量隨著浸泡濃度的增加而增加?？乖饕祸w和皮膚攝取，通過對二者的形態(tài)學(xué)觀察，鰓上的抗原顆粒主要由吞噬細(xì)胞攝取，而皮膚中的抗原先出現(xiàn)在皮膚柱狀上皮中，則可推測巨噬細(xì)胞完成抗原的識別和呈遞。學(xué)者們經(jīng)過不懈努力，在草魚、斑馬魚、駝背犬齒羅非魚、大西洋鮭等頭腎中克隆到了MHCⅡ的cDNA(Walker R A等，1994)，說明魚類存在具有功能性的MHCⅡ基因。Morrison等(2006)采用免疫組化原位標(biāo)記的方法，用Neoparamoeba.sp.懸液浸泡免疫大西洋鮭，在免疫魚鰓組織中檢測到MHCⅡ陽性細(xì)胞。

根據(jù)鰓組織的細(xì)胞組成，研究者認(rèn)為鰓具有獨(dú)立免疫應(yīng)答能力。Santos等(2001)用全菌疫苗浸泡免疫石齒鱸幼魚，發(fā)現(xiàn)在免疫魚鰓組織中不同時(shí)間點(diǎn)抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)應(yīng)答動力學(xué)規(guī)律。同時(shí)Lumsden等(1995)用黃桿菌浸泡免疫虹鱒，通過ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)鰓上的ASC要比外周血ASC的比例明顯偏高。

2.提高浸泡免疫的措施

(1)超聲。超聲方法是在魚類免疫途徑中新應(yīng)用的一種技術(shù)。超聲是一種高于20 000赫茲的高頻聲波，方向性好、穿透力強(qiáng)，應(yīng)用于浸泡免疫中，能夠提高細(xì)胞的滲透作用。Zhou等(2002)利用超聲技術(shù)將溶藻弧菌疫苗免疫青石斑魚，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間和恰當(dāng)?shù)念l率下，發(fā)現(xiàn)浸泡免疫的保護(hù)效果相當(dāng)于注射免疫的效果。同樣關(guān)于鯛魚方面的實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果(Zhou等，2002)。Navot等(2004)以金魚為實(shí)驗(yàn)材料，比較超聲技術(shù)與高滲浸泡兩種方法下，魚體對BSA的攝食量。結(jié)果表明，超聲處理要比高滲浸泡的免疫效果好，而且疫苗用量是高滲浸泡的1/5。

(2)弱毒疫苗。弱毒疫苗是由致病性大為減弱的減毒株所制備的疫苗。常用的此類疫苗有VHSV的F25(21)抗熱株疫苗、IHNV減毒疫苗(Fryer J L等，1976)、CCV減毒疫苗(Walczak E M等，1981)，癤瘡病減毒疫苗及草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗(許淑英等，1994)等，具有免疫原性好、免疫持續(xù)期長、使用劑量小等優(yōu)點(diǎn)，但對其安全性尚有疑慮。

四、前景展望

經(jīng)過以上對注射、口服、浸泡免疫的免疫機(jī)理進(jìn)行大量的闡述可以得知，注射免疫主要引起的是魚類的系統(tǒng)免疫；口服免疫既可以引起系統(tǒng)免疫，又可以引起黏膜免疫，但主要是黏膜免疫；而浸泡免疫則主要引起的是黏膜免疫反應(yīng)。免疫接種與藥物治療相比，具有安全性、無污染、在魚體內(nèi)沒有殘留、不會產(chǎn)生耐藥等一系列優(yōu)勢。隨著疫苗研究的深入，各種疫苗隨即問世，如聯(lián)苗、多價(jià)疫苗以及基因工程疫苗等。為了使魚類疫苗的發(fā)展能夠更科學(xué)，更有實(shí)用意義，延長其免疫應(yīng)答時(shí)間(楊先樂等，1993)，研究魚類接種疫苗后機(jī)體相關(guān)的免疫應(yīng)答機(jī)理是制定生產(chǎn)中合理免疫方案的重要理論基礎(chǔ)。

比較注射、口服以及浸泡免疫3種免疫途徑的機(jī)理及優(yōu)缺點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，如果在未來的研究中，人們能夠研發(fā)出一種既有注射免疫的免疫效果，又能避免疫苗在魚體內(nèi)的消化破壞，同時(shí)在生產(chǎn)實(shí)踐中操作簡便，使用的疫苗量也少的疫苗，不失為疫苗研究領(lǐng)域中的一個(gè)突破性的進(jìn)展。這有待于對魚類疫苗及魚類免疫機(jī)理進(jìn)行深入研究。

(全文完)