氣相色譜分析氨基酸研究進展

祝偉霞， 張守杰， 郁 露， 師子豪， 楊 娜

（鄭州海關(guān)技術(shù)中心， 鄭州 450003）

氨基酸是生物功能的主要載體，已發(fā)現(xiàn)300多種氨基酸，是環(huán)境、食品、生物、生命活動中重要的物質(zhì)，國內(nèi)外學(xué)者從不同角度、不同方面、不同領(lǐng)域?qū)Π被徇M行研究分析。 目前氨基酸測定方法包括專用儀器分析法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜法、電泳法和生物法[1]。 生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子，在進行測定前需要采用酸、堿和蛋白酶催化將蛋白質(zhì)水解成α-氨基酸的混合物。 我國食品安全國家標準規(guī)定采用6 mol/LHCl溶液酸水解方法測定氨基酸，李梅等優(yōu)化了酸水解不同實驗條件[2]。 氨基酸屬于高活性、強極性、難揮發(fā)性的一類化合物，在氣相色譜分析時需要采用相應(yīng)的衍生化技術(shù)改善其色譜行為。 本文主要介紹了采用氣相色譜技術(shù)測定氨基酸的研究進展。

1 衍生化方法進展

衍生化反應(yīng)是采用氣相色譜測定游離氨基酸的主要步驟，氨基酸結(jié)構(gòu)中存在氨基、羰基、羥基等多個極性基團，在中性溶液中以兩性離子存在，不易揮發(fā)性，進行氣相色譜分離時，極性基團與固定液產(chǎn)生氫鍵作用力，導(dǎo)致不出峰、峰形拖尾、靈敏度低等問題， 因此需將其衍生化成揮發(fā)性好且熱穩(wěn)定的衍生物后進行分析。 氨基酸衍生化可以在氨基和羧酸基團上進行，主要包括羥基硅烷化、羰基酯化和氨基?；苌夹g(shù)。

硅烷化衍生反應(yīng)是通過硅烷基與羧基、氨基、羥基中活潑氫反應(yīng)生成相應(yīng)的硅酯衍生物， 常用的硅烷化反應(yīng)試劑包括三甲基硅烷( TMS)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺( MSTFA)、N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺( BSTFA)等試劑。 硅烷化反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性強， 但硅烷化衍生物進行氣相色譜氫火焰離子化檢測器，長時間硅沉積易污染儀器，采用氣相色譜穩(wěn)定同位素質(zhì)譜測定硅衍生物，降低燃燒爐的氧化效率，影響使用壽命。楊芹等采用MSTFA作為衍生化試劑，在全蝎中發(fā)現(xiàn)的16種游離氨基酸[3]。 酯化和酰化是兩種重要的氨基酸衍生化技術(shù)， 氨基酸的羧基和其它有機酸的羰基一樣， 在一定的條件下可以被醇酯化后，形成相應(yīng)的酯類化合物。 當(dāng)氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯、丙酯、丁酯衍生物后，羧基的化學(xué)反應(yīng)性能即被掩蔽，氨基的化學(xué)性能得到加強，更易于?；驘N基結(jié)合。 ?；磻?yīng)是在氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿性溶液中發(fā)生作用， ?；〈被峤Y(jié)構(gòu)中的活性氫。 因氨基酸結(jié)構(gòu)中多個極性基團，聯(lián)合采用酯化和酰化是氨基酸分析最常用的衍生化方法，首先在相應(yīng)的醇和鹽酸條件下酯化， 然后在非揮發(fā)性中間體蒸發(fā)后的?；?。該過程可產(chǎn)生N-酰基（乙?；?、三氟乙?；?、五氟丙基、七氟丁基等）的各種酯（即甲基、乙基、異丙基、仲丁基、戊基、異戊基等）化合物，表1列出常用酯?；椒ā?劉海珍等測定鰻魚肌肉組織16種氨基酸三氟酸異丙酯衍生物， 結(jié)果誤差在0.1‰～0.5‰之間[4]。許慶琴采用七氟丁酸酐和酸性正丁醇作為13種氨基酸的衍生化試劑， 氣相色譜氫火焰離子化檢測法測定了野生果汁中氨基酸含量，回收率在84.4%～96.0%之間[5]。李紅燕對比了氨基酸N-乙酰基正丙酯( NAP) 法和氨基酸N-三氟乙?；惐?TFAIP) 法測定17 種氨基酸衍生化效果,結(jié)果表明TFAIP測定偏差0.02‰～0.31‰，NAP0.04‰～0.67‰，證明TFAIP法結(jié)果更穩(wěn)定[6]。 孟慶國對比了影響19種氨基酸衍生化反應(yīng)的酯化時間、酯化溫度、酰化時間和?；瘻囟鹊葪l件， 結(jié)果表明?；磻?yīng)時間越長，蛋氨酸衍生化產(chǎn)率越高，精氨酸和色氨酸產(chǎn)率下降，其它16種氨基酸溫度和時間影響小[7]。

表1 氨基酸分析不同的衍生化方法

2 儀器測定方法研究進展

根據(jù)氨基酸衍生物的物理化學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用領(lǐng)域，氨基酸的測定主要采用電子捕獲檢測器（ECD）、氫火焰離子化檢測器(FID)、四極桿質(zhì)譜技術(shù)(MS)和穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)(IRMS)。 高靈敏度的電子捕獲適用于增加鹵素的親電性衍生物。 FID對所有有機物產(chǎn)生信號響應(yīng)， 信號強度與氨基酸衍生物的碳原子數(shù)成正比，在定量多種氨基酸含量方面應(yīng)用廣泛，但氨基酸結(jié)構(gòu)中氮、 氧雜原子影響FID信號響應(yīng)，F(xiàn)ID定量測定時，需要校正因子。許德成等采用FID法測定20種蛋白質(zhì)氨基酸，測果結(jié)果與氨基酸分析儀進行對比，結(jié)果表明FID法分析魚松食品中氨基酸變異系數(shù)小于9.2%，氨基酸分析儀的變異系數(shù)小于8.2%[8]。

氣相色譜質(zhì)譜法可以同時滿足定性和定量的需求， 張紅漫等采用氣相色譜一質(zhì)譜法測定中藥沙苑子中的氨基酸， 測定沙苑子中氨基酸的總質(zhì)量分數(shù)為4.23%[9]。楊瑞琴等采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析手印殘留物中氨基酸的研究， 刑事科學(xué)技術(shù)手印顯現(xiàn)部分的發(fā)展提供幫助[10]。 氣相色譜同位素比質(zhì)譜分析蛋白氨基酸的碳和氮元素， 可以溯源蛋白質(zhì)的合成、降解和代謝，跟蹤碳氮元素轉(zhuǎn)化過程，對于生命科學(xué)和食品研究具有重要的意義。 鐘其頂?shù)炔捎脷庀嗌V同位素質(zhì)譜儀測定發(fā)酵液中游離氨基酸δ13C值，穩(wěn)定碳同位素豐度的精度誤差小于0.5‰[11]。何紅波等采用氣相色譜同位素質(zhì)譜方法測定土壤氨基酸中氮同位素， 可有效區(qū)分土壤中原有的和利用外源氮素新合成的氨基化合物[12]。 孟靖等采用氣相色譜同位素比值質(zhì)譜法測定枸杞氨基酸中氮同位素比，測定結(jié)果δ15N值精密度為0.13‰～0.52‰，未產(chǎn)生同位素餾分效應(yīng)[13]。

3 存在的問題

氣相色譜測定氨基酸時存在的問題：首先，衍生化應(yīng)時間長，需要多個步驟的溶劑轉(zhuǎn)移，衍生操作費時。 其次，評價結(jié)果準確性難，氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)率對照氨基酸標準品進行計算，無法計算準確蛋白質(zhì)-氨基酸-衍生物的反應(yīng)產(chǎn)率。最后，氣相色譜-質(zhì)譜作為氨基酸的定性方法，應(yīng)建立相應(yīng)衍生物離子碎片、分子離子峰等NIST庫，實現(xiàn)準確定性。