接種乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中理化性質(zhì)及安全品質(zhì)的影響

陳援援，牛文秀，馬凱華，梁麗雅，馬儷珍

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

風(fēng)干腸是北方享有盛名的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品之一，它是由瘦肉和脂肪顆粒為原料，添加食鹽、糖、曲酒、味精等，在自然或人工控制條件下經(jīng)微生物發(fā)酵作用而形成的具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，水分活性低（0.7～0.8）、pH 低（4.5～5.5）可長(zhǎng)期儲(chǔ)存的發(fā)酵干燥肉制品[1-2]。然而，風(fēng)干腸傳統(tǒng)上是自然發(fā)酵生產(chǎn)，微生物菌群組成不易嚴(yán)格控制，存在安全隱患[3]。此外，風(fēng)干腸的成熟是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，涉及多種微生物的相互作用，而某類(lèi)型微生物（如大腸桿菌、奧里斯鏈球菌、腸球菌、梭菌和變形桿菌等）具有合成N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的能力或者促進(jìn)亞硝化反應(yīng)的進(jìn)程[4]，因?yàn)镹-亞硝胺（N-nitrosamines，NAS）是由亞硝酸鹽和二級(jí)胺類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)生成的一種極強(qiáng)致癌物，而微生物可以通過(guò)代謝蛋白氧化酶產(chǎn)生二級(jí)胺，或分泌氨基酸脫羧酶產(chǎn)生的生物胺通過(guò)脫氨反應(yīng)和環(huán)化反應(yīng)形成二級(jí)胺[5-6]。也有研究表明，某些乳酸菌（如木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類(lèi)植物乳桿菌等）具有抑制NAs 形成的前體物質(zhì)[7]，或具有轉(zhuǎn)化已生成的NAs 的能力[8]。

目前在肉制品生產(chǎn)中使用發(fā)酵劑已受到特別的關(guān)注[9-13]，這是因?yàn)榘l(fā)酵劑具有降低肉制品的pH，抑制致病性和腐敗性微生物的繁殖，控制生物胺和N-亞硝胺等危害物的產(chǎn)生，并能產(chǎn)生良好風(fēng)味和益生性等優(yōu)勢(shì)[14]。乳酸菌是風(fēng)干腸中的優(yōu)勢(shì)菌，常用于肉品發(fā)酵的微生物種類(lèi)有戊糖片球菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸片球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌及變異性微球菌等，對(duì)提高肉制品的品質(zhì)和安全性具有重要的作用，大量研究證明凝固酶陰性葡萄球菌能進(jìn)行糖發(fā)酵、氨基酸代謝、脂質(zhì)氧化及酯酶催化反應(yīng)等[15]，具有產(chǎn)良好風(fēng)味的功能特性。Liao 等[16]研究調(diào)查了植物乳桿菌120、釀酒酵母2018 和木糖葡萄球菌135 對(duì)NDMA 及其前體形成的影響，發(fā)現(xiàn)三株菌株均能在培養(yǎng)液中直接降解NDMA，其中降解率最高的是植物乳桿菌120。Hua 等[17]研究了商品發(fā)酵劑SBM-52（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸足球菌）、PROMIX5（木糖葡萄球菌、類(lèi)植物乳桿菌和清酒乳桿菌）、WBX-43（木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌）、V3（植物乳桿菌）發(fā)酵魚(yú)肉醬品質(zhì)特性的影響，結(jié)果表明SBM-52、PRO-MIX5 和V3 均能迅速降低pH，WBX-43 和SBM-52 發(fā)酵劑可用于生產(chǎn)風(fēng)味更好的優(yōu)質(zhì)魚(yú)肉醬。

前期研究中，比較了幾種外源添加物對(duì)風(fēng)干腸理化性質(zhì)及安全品質(zhì)的影響[18-20]，發(fā)現(xiàn)添加自配的復(fù)合抗氧化劑和自制的發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（用FBFA表示）更能降低風(fēng)干腸的亞硝酸鹽殘留量、TBARs值，控制組胺和NAs 的形成，對(duì)風(fēng)干腸的色澤和安全品質(zhì)等具有較好的改善作用，但它不能很好地抑制腸桿菌科菌，且通過(guò)微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在風(fēng)干腸中所占的豐度比例不高。所以為了進(jìn)一步提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)，本研究在風(fēng)干腸加工中，分別接種3 種商業(yè)發(fā)酵劑為試驗(yàn)組，通過(guò)風(fēng)干過(guò)程中測(cè)定不同指標(biāo)的變化，研究不同菌種對(duì)風(fēng)干腸品質(zhì)的影響，目的是利用優(yōu)勢(shì)菌群來(lái)控制腐敗微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到生物防腐的目的，為發(fā)酵劑在風(fēng)干腸中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷卻排酸成熟24 h 的豬后腿肉、豬肥膘 天津二商迎賓肉類(lèi)食品有限公司；食鹽、白糖、曲酒、味精、醬油、牛骨肉末 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；茶多酚、迷迭香、木糖、葡萄糖 豫中生物科技有限公司；VE、異抗壞血酸鈉、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、VB1蘇州佰億鑫生物科技有限公司；SHI-59（Staphylococcus xylose木糖葡萄球菌、Pediococcus pentosus戊糖片球菌、Lactobacillus plantarum植物乳桿菌）、WBL-45（Staphylococcus xylose木糖葡萄球菌、Staphylococcus carnosus肉葡萄球菌、Lactobacillus sake清酒乳桿菌）、PROMIX5（Staphylococcus xylose木糖葡萄球菌、Lactobacillus sake清酒乳桿菌、Lactobacillus plantarum類(lèi)植物乳桿菌）意大利薩科公司；膠原蛋白腸衣（牛二層皮提取、孔徑30 mm）神冠控股（集團(tuán)）有限公司；N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品：N-二甲基亞硝胺（N-Nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝胺嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝胺吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基二丙胺（N,N-Dipropylnitrosamine，NDPA）美國(guó)Supelco 公司；乙腈、二氯甲烷（均為色譜純）、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、高氯酸、丹磺酰氯、亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水、硼酸 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；配制試劑所用水 均為超純水。

Agilent 1200、Agilent 1260 高效液相色譜儀（配備紫外吸收檢測(cè)器）、ZORBAX EClipse Plus C18液相色譜柱、Zorbax Extend-C18液相色譜柱 美國(guó)Agilent 公司；CM-5 色差儀 日本Konica Minolta公司；HD-4 智能水分活度測(cè)量?jī)x 迪樂(lè)電子儀器科技有限公司；STARTER3100 pH 計(jì) 美國(guó)Ohaus 公司；GS0610 超聲波清洗機(jī) 深圳博冠科技有限公司；SX-500 多功能高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy 公司；CLIMACELL 恒溫恒濕箱 艾力特國(guó)際貿(mào)易有限公司；XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BVBJ-30F 真空攪拌機(jī) 嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；XZ-5L 手搖灌腸機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、LC-CCA 冷卻液循環(huán)泵、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵 上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FBFA 的制備 FBFA 是由發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）和復(fù)合抗氧化劑（compound antioxidants，CA）復(fù)配而成。FBF 的制備參照樊曉盼等[21]的方法，牛骨肉末和水按1:4 的比例在0.1 MPa，121 ℃下高壓浸提4 h，將浸提液冷卻到室溫后，加入0.06%的風(fēng)味蛋白酶和0.03%的復(fù)合蛋白酶，在50 ℃的搖床中酶解4.5 h，結(jié)束后沸水浴滅酶活20 min，等恢復(fù)室溫后接種用滅菌乳提前活化2 h 的VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌），添加量為0.02%，在30 ℃，130 r/min條件下振搖發(fā)酵12 h，結(jié)束后沸水浴滅菌20 min。待冷卻至室溫后分別加入1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8%VB1攪拌均勻后在110 ℃進(jìn)行美拉德反應(yīng)1 h，冷卻后于4 ℃靜置12 h。最后用兩層紗布過(guò)濾即為成品FBF。其添加量為肉重的2%，CA 的添加量按照熊鳳嬌等[22]的方法，即茶多酚、迷迭香、VE和異抗壞血酸鈉添加量（以原料肉重計(jì)）分別為60.14、60.11、60.00 和60.00 mg/kg，將FBF 和CA 以1:1復(fù)配得FBFA。

1.2.2 風(fēng)干腸的制作 風(fēng)干腸制作工藝：原料肉預(yù)處理→腌制→拌餡→罐腸→風(fēng)干成熟→成品。

1.2.2.1 腌制 將豬后腿瘦肉剔除筋膜、脂肪后，用絞肉機(jī)絞碎（篩板孔徑8 mm），背膘用切絲機(jī)切碎，按照肥瘦比1:9 的比例放入真空攪拌機(jī)中，加入占肉總質(zhì)量1.8%的食鹽、0.01%的亞硝酸鈉（事先用少量水溶解）和異抗壞血酸鈉0.55 g/kg，真空攪拌5 min，取出后放入不銹鋼盆中，緊貼肉表面蓋一層保鮮膜，于0～4 ℃冷庫(kù)中腌制24 h。

1.2.2.2 拌餡 將腌制好的肉再次倒入真空攪拌機(jī)中，依次加入4%糖、1.5%曲酒、0.2%味精、0.3%生抽、10%水、10 g/100 kg 的乳酸菌發(fā)酵劑（按肉重計(jì)，CK 組不加），真空攪拌8 min。

1.2.2.3 灌腸 將制好的肉餡灌入膠原蛋白腸衣中，結(jié)扎（每節(jié)13～15 cm）、排氣。

1.2.2.4 風(fēng)干 將灌制好的肉腸放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中風(fēng)干12 d，恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、相對(duì)濕度和風(fēng)速參數(shù)如表1 所示。

表1 風(fēng)干腸工藝參數(shù)Table 1 Process parameters of air-dried sausage

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 在風(fēng)干腸加工的基礎(chǔ)配方基礎(chǔ)上，試驗(yàn)設(shè)計(jì)4 組，每組均加入FBFA（按照1.2.1），對(duì)照組（control check CK）不接種，其它3 組（SHI 組、WBL 組、PRO 組）分別接種10 g/100 kg的SHI-59、WBL-45、PRO-MIX5。分別在風(fēng)干的第0、3、6、9、12 d 取樣測(cè)定樣品的水分含量、aw、色差、pH、TVB-N 值；分別測(cè)定風(fēng)干第6、12 d 生物胺變化以及第12 d 的N-亞硝胺含量、亞硝酸鹽殘留量。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.4.1 水分含量 按照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法。

1.2.4.2 aw用絞肉機(jī)將樣品絞碎，室溫（約20 ℃）下將肉平鋪于玻璃皿上，用智能水分活度儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.3 pH 按照GB 5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH 值的測(cè)定》中肉及肉制品pH 值測(cè)定方法。

1.2.4.4 色差值測(cè)定 將絞碎樣品置于室溫（約20 ℃）下平衡溫度2 h，均勻平鋪于玻璃皿中，采用色差儀測(cè)定樣品的亮度值（L*）和紅度值（a*）（正值表示樣品色澤偏紅，負(fù)值表示樣品色澤偏綠），測(cè)定前用標(biāo)準(zhǔn)白板校正色差儀。每個(gè)處理組包含3 個(gè)平行試樣，結(jié)果取平均值。

1.2.4.5 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》。

1.2.4.6 亞硝酸鹽殘留量測(cè)定 參照GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》。

1.2.4.7 NAs 含量測(cè)定 樣品前處理參照GB 5009.26-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類(lèi)化合物的測(cè)定》進(jìn)行，然后經(jīng)高效液相色譜儀檢測(cè)。

色譜條件：參照肖付剛等[23]的方法，使用ZORBAX EClipse Plus C18液相色譜柱（4.6 mm×250 nm）；紫外檢測(cè)器固定波長(zhǎng)230 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；分析時(shí)間25 min；后序運(yùn)行時(shí)間10 min。流動(dòng)相及梯度洗脫程序如表2 所示。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.2.4.8 生物胺含量的測(cè)定 參照杜智慧[24]的方法。稱(chēng)取5 g 碎肉樣加入20 mL 0.4 mol/L 的高氯酸30000 r/min 下勻漿30 s，在4 ℃ 4000 r/min 條件下離心10 min。重復(fù)上述步驟1 次，合并兩次上清液，用0.4 mol/L 的高氯酸定溶至50 mL。樣品和標(biāo)品衍生化處理方式相同：取1 mL 的樣液，加入0.2 mL，2 mol/L NaOH 和0.3 mL 飽和NaHCO3，2 mL 10 mg/mL 丹磺酰氯，40 ℃避光反應(yīng)30 min，結(jié)束后加10 μL 氨水終止反應(yīng)，用乙腈定容至5 mL，4 ℃、3000 ×g 條件下離心5 min，上清液過(guò)膜，上液相檢測(cè)。

色譜條件：采用高效液相色譜儀測(cè)定，色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18Column (4.6 mmID×150 mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相A 為水，C 為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表3。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 3 Mobile phase gradient elution procedure

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析；采用Excel 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中水分含量和aw 變化的影響

乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中水分含量和aw變化的影響見(jiàn)圖1A～B 所示。由圖1 可以看出，隨著風(fēng)干過(guò)程的進(jìn)行，CK、SHI、WBL 和PRO 組水分含量和aw均呈顯著降低趨勢(shì)（P<0.05）；水分含量由69.36%～70.70%降至23.90%～27.97%，aw由起初的0.949～0.964 降至0.776～0.803，達(dá)到了一般風(fēng)干腸對(duì)水分含量和aw要求的范圍[25]。PRO 組的aw下降緩慢，可能與PRO 組風(fēng)干腸在整個(gè)風(fēng)干過(guò)程中pH 降低幅度變化不大有關(guān)（見(jiàn)圖2），遠(yuǎn)離肌球蛋白的等電點(diǎn)5.4，進(jìn)而使肌原纖維蛋白的收縮、變性或降解程度不大，肌肉蛋白持水力相對(duì)較強(qiáng)，使水分散失的速度減慢[26]。WBL 組風(fēng)干腸在風(fēng)干的第3、6 d 水分含量為組內(nèi)最高，到風(fēng)干的第9、12 d 水分含量又快速降低，說(shuō)明接種WBL 發(fā)酵劑能加快水分散失，提高干燥的速度。在風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)，WBL 組的水分含量為組內(nèi)最高27.57%，aw又能保持較低水平（0.781），這有利于保持風(fēng)干腸產(chǎn)品較好的彈性、多汁性和口感等感官性質(zhì)，同時(shí)較低的水分活度有利于抑制微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)。

圖1 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中水分含量（A）和aw（B）變化的影響Fig.1 Effect of lactic acid bacteria on water content (A) and aw(B) of air-dried sausage during air drying

2.2 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中pH 變化的影響

乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中pH 變化的影響見(jiàn)圖2 所示。由圖2 可以看出，4 組腸在加工過(guò)程中pH 均呈先降低后緩慢升高的趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，SHI 組和WBL 組的pH 下降速度比CK 組快，這是因?yàn)镾HI 組中有戊糖片球菌，WBL 組中有清酒乳桿菌，它們均可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸[27]，且在發(fā)酵前期肉餡中的乳酸菌生長(zhǎng)繁殖速度快，導(dǎo)致pH 快速下降。在成熟第9 d 后，4 組風(fēng)干腸的pH 均有所上升，直到成熟過(guò)程結(jié)束，這與Xiao 等[28]試驗(yàn)結(jié)果一致，可能與微生物產(chǎn)生的蛋白酶水解活性有關(guān)。Lorenzo 等[29]認(rèn)為，細(xì)菌蛋白酶可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，并產(chǎn)生肽、氨基酸和胺，提供更好的緩沖效果。如在酸性條件下，微生物產(chǎn)生生物胺可以維持細(xì)胞內(nèi)的pH 恒定，微生物脫羧酶活性受酸環(huán)境誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)脫羧反應(yīng)消耗質(zhì)子，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)pH 升高，同時(shí)排出堿性胺物質(zhì)，使風(fēng)干腸肉餡體系pH 升高[30]。各組pH 回升的幅度不同可能與發(fā)酵劑所含的菌種種類(lèi)及數(shù)量不同有關(guān)。在風(fēng)干的第3、6、9、12 d PRO 組的pH 均顯著高于其它3 組（P<0.05），這與李秀明等[31]在研究不同乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵紅腸品質(zhì)的影響中的結(jié)果一致，說(shuō)明PRO-MIX5 組乳酸菌發(fā)酵劑的產(chǎn)酸活力弱。從整體上看，4 組風(fēng)干腸成品的pH 均小于5.4，屬于高酸發(fā)酵肉制品，這有利于抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，從而提高產(chǎn)品的安全性。

圖2 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中pH 變化的影響Fig.2 Effect of lactic acid bacteria on pH value of air-dried sausage during air drying

2.3 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中色澤變化的影響

乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中色澤變化的影響見(jiàn)圖3 所示。由圖3A 可知，4 組風(fēng)干腸發(fā)酵初期的亮度值（L*）都達(dá)到了47 以上，而在風(fēng)干的第3 dL*顯著降低（P<0.05），這主要是因?yàn)槿怵W發(fā)生了脂質(zhì)氧化、色素降解、微生物生長(zhǎng)和水分散失的影響，但SHI 組和WBL 組L* 值顯著大于CK 組（P<0.05）；在風(fēng)干的第12 d，4 組風(fēng)干腸的L*值大小關(guān)系為PRO≈WBL>SHI>CK，說(shuō)明添加乳酸菌能夠提高風(fēng)干腸的L*值，這與徐玉寧等[32]研究的乳酸菌具有提高風(fēng)干腸亮度值的結(jié)果一致。Visessanguan 等[33]報(bào)道，接種植物乳桿菌可加速泰國(guó)發(fā)酵香腸發(fā)酵過(guò)程中L*的增加，樣品顏色的變化歸因于產(chǎn)酸、蛋白質(zhì)變性和亞硝基肌紅蛋白的穩(wěn)定性，發(fā)酵過(guò)程中肉蛋白質(zhì)的酸化會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白中的肌球蛋白粗絲收縮，從而增加肉的光反射。圖3B 為風(fēng)干腸加工過(guò)程中紅度值（a*）的變化情況，隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，SHI 組、WBL 組、PRO 組的a*值均呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，且顯著高于CK組（P<0.05），SHI 組、WBL 組、PRO 組在風(fēng)干12 d 時(shí)a*值分別為13.11、13.97、13.49，3 組之間差異不顯著（P>0.05）。說(shuō)明接種的乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)高鐵肌紅蛋白的還原能力強(qiáng)，可使風(fēng)干腸的發(fā)色效果好。研究表明，在肉制品中接種乳酸菌發(fā)酵劑產(chǎn)生乳酸使其pH 降低，有利于產(chǎn)生游離亞硝酸，接著分解生成NO，NO 可與肉中的肌紅蛋白結(jié)合形成對(duì)熱穩(wěn)定的玫瑰色的亞硝基肌紅蛋白（NO-Hb），從而賦予產(chǎn)品明亮的紅色[34]，另一方面，一些細(xì)菌如植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、木糖葡萄球菌、片球菌等體內(nèi)能合成一氧化氮合酶，從而催化L-精氨酸生成NO 達(dá)到促進(jìn)發(fā)色的目的[35]。

圖3 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中色差的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria on color difference during air-dried sausage processing

2.4 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中TVB-N 值變化的影響

風(fēng)干腸中的蛋白質(zhì)被分解成氨基酸等小分子，可以大大提高其消化吸收能力，同時(shí)進(jìn)一步提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和保健功能[36-37]。4 組風(fēng)干腸在加工過(guò)程中TVB-N 含量的變化如圖4 所示。由圖4 可以看出，隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，4 組風(fēng)干腸中TVB-N 含量均呈上升趨勢(shì)，且3 個(gè)試驗(yàn)組在風(fēng)干的第3、6、9、12 d的TVB-N 含量均顯著高于CK 組（P<0.05），這是因?yàn)樵陲L(fēng)干腸發(fā)酵和成熟過(guò)程中，由內(nèi)源性蛋白酶或微生物所產(chǎn)生的蛋白酶分解蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生堿性含氮小分子物質(zhì)，致使TVB-N 值升高[38]。3 組試驗(yàn)組由于接入復(fù)合發(fā)酵劑，在加工過(guò)程中，隨著微生物數(shù)量增加，產(chǎn)生蛋白酶的活力增強(qiáng)，堿性含氮小分子物質(zhì)也會(huì)增越多。Candogan 等[36]和Aro 等[39]發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵劑促進(jìn)了發(fā)酵香腸蛋白質(zhì)的降解，特別是混合發(fā)酵劑。

圖4 乳酸菌對(duì)風(fēng)干過(guò)程中風(fēng)干腸TVB-N 值的影響Fig.4 Effect of lactic acid bacteria on TVB-N value of air-dried sausage during air drying

2.5 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸成品亞硝酸鈉殘留量和N-亞硝胺含量的影響

表4 為乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸成品亞硝酸鈉和N-亞硝胺含量的影響。由表4 可知，4 組風(fēng)干腸的亞硝酸鹽殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中的規(guī)定≤30 mg/kg，說(shuō)明發(fā)酵工藝能加速亞硝酸鹽的降解，SHI-59 組風(fēng)干腸成品的亞硝酸鹽殘留量為組內(nèi)最低（1.91 mg/kg），WBL組和PRO 組之間亞硝酸鹽殘留量差異不顯著（P＞0.05），可能與這3 組復(fù)合發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力和亞硝酸鹽還原酶活性有關(guān)的緣故[40-41]，CK 組雖然沒(méi)有接種發(fā)酵劑，但原料和環(huán)境中的微生物能發(fā)酵產(chǎn)酸，降低肉餡中的pH（見(jiàn)圖2），使亞硝酸鹽還原成NO 進(jìn)行發(fā)色，此外亞硝酸鹽具有殺菌、抗氧化作用，所以發(fā)酵過(guò)程能降低亞硝酸鹽殘留量。

我國(guó)在GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中的規(guī)定，肉制品中NDMA 不得高于3 μg/kg。4 組風(fēng)干腸成品NAs 含量如表4 所示，與CK 組相比，PRO 組對(duì)6 種NAs 均有顯著的抑制效果（P<0.05），特別是對(duì)NMEA 的抑制率達(dá)100%，4 組風(fēng)干腸的NDMA 均在安全范圍內(nèi)，PRO 組對(duì)NDMA 的抑制效果最好，其抑制率為56.94%，這與李秀明等[42]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明PRO 菌具有直接降解NAs 的能力；SHI 組除對(duì)NMEA 不具有抑制作用外，對(duì)其它5 種NAs 均有顯著的抑制效果（P<0.05），特別是NDMA 的含量只有1.82 μg/kg。分析其原因，也許是由于SHI 組中含有植物乳桿菌，Sun 等[43]將植物乳桿菌接種到哈爾濱風(fēng)干腸中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能顯著抑制風(fēng)干腸中NDPA 的形成。WBL組能抑制NDMA、NPIP 和NDPA 的生成。關(guān)于PRO、SHI 和WBL 組商業(yè)發(fā)酵劑是如何協(xié)同抑制NAs（尤其是NDMA）形成的機(jī)理還不明確，今后可以借助宏基因組學(xué)分析微生物群落結(jié)構(gòu)，各乳酸菌基因功能活性，微生物之間的相互協(xié)同作用；通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段找出目標(biāo)蛋白；通過(guò)宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究乳酸菌產(chǎn)相關(guān)酶的基因序列，然后進(jìn)行拼接，做物種注釋和基因注釋了解其代謝通路。

2.6 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中生物胺含量變化的影響

風(fēng)干腸中含有豐富的蛋白質(zhì)，在發(fā)酵和成熟過(guò)程中經(jīng)某些具有脫羧酶活性的微生物作用形成有潛在危害作用的含氮物質(zhì)-生物胺。乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸分別在風(fēng)干第6 d 和第12 d 生物胺含量變化的影響如表5 所示。由表5 可以看出，12 d 的各種生物胺和生物胺總量均顯著高于6 d（P<0.05），說(shuō)明隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，各種生物胺有一個(gè)積累的過(guò)程。8 種生物胺中，亞精胺在各組中含量均處于極低水平，精胺在4 組風(fēng)干腸中均有檢出，12 d 時(shí)各組之間差異不顯著（P>0.05）。在風(fēng)干第6 d 時(shí)，僅在CK 組檢測(cè)出色胺（1.03 mg/kg），到第12 d 時(shí)CK 組色胺增加到5.79 mg/kg，WBL 組色胺含量（0.71 mg/kg）遠(yuǎn)低于CK 組（P<0.05），而SHI 組和PRO 組均未檢測(cè)出色胺，說(shuō)明接種乳酸菌WBL、SHI、PRO 對(duì)風(fēng)干腸中色胺有明顯的抑制作用。組胺在8 種生物胺中毒性最大，從表4 可以看出，風(fēng)干12 d 時(shí)4 組風(fēng)干腸成品的組胺含量低于歐盟監(jiān)管條例91-493-EEC 中規(guī)定的食品中組胺含量不應(yīng)超過(guò)100 mg/kg[44]。腐胺、尸胺、組胺和酪胺是發(fā)酵肉制品中最常見(jiàn)的生物胺[45]，4 組風(fēng)干腸在風(fēng)干12 d 時(shí)檢測(cè)出的尸胺和酪胺含量最高，其次是腐胺和組胺，SHI、WBL、PRO 組的尸胺、組胺、酪胺和生物胺總量高于CK 組，其中PRO組最為顯著（P<0.05），分析這一現(xiàn)象的原因，可能是本試驗(yàn)風(fēng)干腸在加工過(guò)程中，溫度一直保持25 ℃，試驗(yàn)組中發(fā)酵劑作用的結(jié)果產(chǎn)生的微生物蛋白酶使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生大量的游離氨基酸和肽類(lèi)，經(jīng)腸桿菌科和假單胞菌屬[46]等具有氨基酸脫羧酶活性的微生物作用而使生物胺大量積累。基于上述現(xiàn)象，下一步試驗(yàn)可以通過(guò)改變風(fēng)干工藝條件，前期發(fā)酵階段溫度為30 ℃，讓乳酸菌在短時(shí)間內(nèi)快速生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酸成為優(yōu)勢(shì)菌來(lái)抑制腐敗微生物的繁殖，后期風(fēng)干過(guò)程降低溫度至15～16 ℃，進(jìn)一步抑制腐敗微生物的繁殖，以此來(lái)降低風(fēng)干腸中組胺、酪胺和尸胺的含量。生物胺是形成致癌物NAs 的前體物質(zhì)之一，由表3 可知，PRO 組中6 種NAs 含量沒(méi)有因?yàn)槠渖锇泛吭黾佣@著增加，反而其N(xiāo)As 含量顯著低于CK 組（P<0.05），說(shuō)明接種PRO-MIX5 商業(yè)復(fù)配菌能高效代謝NAs，或改變NAs 的合成路徑，Nowak 等[47]研究表明短乳酸桿菌0945 和干酪乳桿菌114001 細(xì)胞內(nèi)提取物中發(fā)生的酶促反應(yīng)可能參與亞硝胺的消除。Grill 等[48]報(bào)道在磷酸鹽緩沖液中具有酶活性的雙歧桿菌BB536 胞內(nèi)提取物，可以在體外代謝NDMA、NPIP 和NPYR。

表4 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸成品亞硝酸鹽和N-亞硝胺的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria on nitrite and N-nitrosamine in air-dried sausage

表5 乳酸菌對(duì)風(fēng)干腸加工過(guò)程中生物胺含量變化的影響（mg/kg）Table 5 Effect of lactic acid bacteria on biogenic amines of air-dried sausage during air drying (mg/kg)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了3 種復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸理化性質(zhì)及安全品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)在3 個(gè)接菌組中WBL 組能明顯降低風(fēng)干腸的aw，提高風(fēng)干腸的品質(zhì)。SHI 和WBL 在風(fēng)干第0～3 d 期間能快速降低肉餡體系的pH 至為5.39 和5.10。到風(fēng)干終點(diǎn)時(shí)SHI、WBL、PRO 組的L*值、a*值均顯著高于CK 組（P<0.05），說(shuō)明3 種乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)干腸有較好的發(fā)色作用，其中WBL-45 的發(fā)色效果最佳。通過(guò)對(duì)風(fēng)干腸成品亞硝酸鹽殘留量、NAs 和生物胺這3 個(gè)安全性指標(biāo)測(cè)定，4 組風(fēng)干腸成品的亞硝酸鹽殘留量遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)30 mg/kg，其中SHI 組的亞硝酸鹽殘留量1.91 mg/kg 為組內(nèi)最低，PRO 組對(duì)6 種NAs 有較好抑制效果，SHI 組對(duì)除NMEA 以外的5 種NAs 有較好的抑制效果，WBL僅能抑制NPIP 和NDPA 的生成；3 組發(fā)酵劑均對(duì)風(fēng)干腸中的色胺和亞精胺有明顯的抑制作用，但對(duì)尸胺、組胺、酪胺和生物胺總量沒(méi)有抑制效果，不過(guò)其含量在安全可控范圍。整體上，接種3 種復(fù)合發(fā)酵劑可使致癌物質(zhì)NAs 和亞硝酸鹽殘留量均保持在較低水平，能不同程度地提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)，這對(duì)于風(fēng)干腸的實(shí)際生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。