不同年份標準倉儲廣陳皮表面微生物的分布

陳 林，吳 蓓，陳鴻平，王 福，胡 媛，劉友平

（成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥標準化教育部重點實驗室 西部特色中藥資源——省部共建國家重點實驗室 成都 611137）

陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾，燥濕化痰之功[1]。其入藥歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，原名“橘柚”，為常用的藥食兩用品?！侗静萁?jīng)集注》以其“陳久者良”[4]，之后醫(yī)家以橘皮久藏能溫、能行，至《食療本草》[3]始有“陳皮”之名，沿用至今，流通藥材分為“陳皮”與“廣陳皮”?，F(xiàn)代研究，學者多從貯藏條件[5]、環(huán)境因子[6]等各方面探究陳皮陳化機制，并通過對陳皮中真菌的分析進一步探究陳皮的藥效物質(zhì)基礎。項目組前期研究了3，5，10年廣陳皮優(yōu)勢菌落，常見、稀有菌群[7]，發(fā)現(xiàn)廣陳皮表面真菌群落與濕度、水分、溫度、總黃酮、多糖含量密切相關。嘗試將黑曲霉反接陳皮，結果發(fā)現(xiàn)黃酮類成分含量均增加，抗氧化和祛痰作用增強，與倉儲5年陳皮功效相當。提示廣陳皮表面微生物可引起藥效物質(zhì)的改變。研究廣陳皮微生物分布，于廣陳皮質(zhì)量控制具有重要意義。

本文以標準倉貯0，1，2，3，4，5，10，15，30年的廣陳皮為研究對象，通過Illumina HiSeq 測序平臺，分析不同貯藏年限廣陳皮真菌與細菌群落的差異，以及微生物群落變化規(guī)律，為廣陳皮質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

PTC200PCR 儀，美國BIO-Rad 公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一儀器廠；2×Taq PCR Master-Mix （Tiangen Biotech Co.，China）；QIAquick 膠回收試劑盒，QIAGEN 公司；HiSeq 2500 測序系統(tǒng)，Illumina 公司；建庫試劑盒TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，Illumina 公司。

1.2 試驗材料

不同貯藏年限標準倉儲廣陳皮均購于江門市新會陳皮村市場股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學鑒定為茶枝柑，見表1。標準倉儲為產(chǎn)地原位倉儲，季節(jié)性定期管理，并記錄倉儲溫濕度變化，是一種良好的樣品可追溯收集辦法，可避免環(huán)境以及年份不準確對微生物種類的影響，對確保試驗結果準確性提供了保障。

表1 廣陳皮信息表Table 1 Sample information

1.3 試驗方法

使用無菌棉簽擦拭樣品表面，剪下棉簽部分，采用CTAB 法提取樣品總DNA，根據(jù)保守區(qū)設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500 測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Illumina HiSeq 測序平臺得到雙端reads數(shù)PE Reads，進行拼接得到原始序列數(shù)Raw Tags，將原始序列過濾得到優(yōu)化序列Clean Tags，再進行過濾嵌合體，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)Effective Tags。使用UCLUST 對Tags 在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTUs，并對每個OUT 進行物種注釋。同時對OTUs 進行豐度、Alpha 多樣性以及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 OUT 分析結果

使用QIIME[8]（version 1.8.0）軟件中的U CLUST[9]對Tags 在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU 進行分類學注釋。不同年限廣陳皮各等級的物種類型數(shù)目見表2，微生物“屬”水平的物種分布見圖1、圖2。

由表2可知，隨著貯存年限的增加，真菌各等級的物種類型數(shù)目整體呈先上升后下降的趨勢，在貯存年限為兩年時達到最高。由圖1可知，在“屬”水平，不同年限廣陳皮樣品的真菌種類不盡相同，總體相對豐度水平前10 的真菌屬為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、節(jié)擔菌屬（Wallemia）、輪枝菌屬（Verticillium）、被孢霉屬（Mortierella）、假絲酵母屬（Candida）、枝孢菌屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）與耐干霉菌屬（Xeromyces）。其中，有孢漢遜酵母屬僅在貯存的初期存在，且相對豐度占比約為9%；假絲酵母菌屬、枝孢菌屬、曲霉屬以及青霉菌屬為常駐菌種，曲霉屬與青霉菌屬在廣陳皮產(chǎn)出貯存2年后其生長活性最強。隨著貯存的年限增長，耐干霉菌屬相對豐度逐年增加，第10年時其相對豐度占比超過40%，第15年成為僅存的注釋物種。

表2 各等級的物種類型數(shù)目Table 2 The number of species in each class

圖1 真菌“屬”水平物種分布圖Fig.1 Distribution of genus level species of fungi

由表2可知，廣陳皮的細菌各等級物種類型數(shù)目，隨年限增加整體呈先增加，后減少，再增加，最終逐漸緩慢減少并趨于穩(wěn)定。由圖2可知相對豐度水平前10 的細菌屬為布勞特氏菌屬（Blautia）、霍氏真桿菌屬（[Eubacterium]hallii group）、1174-901-12、泛菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、另枝菌屬（Alistipes）、毛螺菌屬（Uncultured bacterium f Lachnospiraceae）、瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]torques group）。其 中1174-901-12 僅存在于當年剛產(chǎn)的廣陳皮中，泛菌屬在貯存4年的廣陳皮中相對豐度占比達20%以上，其它年份卻極少存在，其它菌屬在不同年限的樣品中均存在，但在貯存的前4年，每年各有1至2 個顯著的優(yōu)勢菌屬。而在貯存年限為5年、10年、15年以及30年的樣品中各菌屬相對豐度占比漸趨均衡，與前4年的樣品相比優(yōu)勢菌屬并未顯示出突出的優(yōu)勢。

圖2 細菌“屬”水平物種分布圖Fig.2 Distribution of bacteria at the genus level

2.2 Alpha 多樣性分析結果

Alpha 多樣性（Alpha diversity）反映的是單個樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity）。Chao1 和Ace 指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness） 的影響。相同物種豐度的情況下，群落中各物種均勻度越大，則群落多樣性越大，Shannon 指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[10]。另外還統(tǒng)計了OTU覆率Coverage，其數(shù)值越高，則樣本中物種被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。該指數(shù)反映本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況。

使用Mothur（version v.1.30）軟件，對樣品Alpha 多樣性指數(shù)進行評估。各樣品Alpha 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表3所示。

由表3可知，不同年限樣品的真菌與細菌的OUT 覆蓋率均在0.999 以上，表明本次測序結果能較準確地反映樣本中微生物的真實情況。

表3 Alpha 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of Alpha diversity index

物種豐富度以ACE 指數(shù)為評價指標，各樣品的豐富度大小順序為Y10＞Y1＞Y4＞Y2＞Y3＞Y0＞Y5＞Y15＞Y30 （真菌）；Y2＞Y4＞Y5＞Y15 （Y30）＞Y10＞Y1＞Y3＞Y0（細菌）。以Chao1 指數(shù)評價物種豐富度，各樣品的豐富度大小順序為Y4＞Y2＞Y10＞Y3＞Y5＞Y1＞Y0＞Y15＞Y30 （真菌）；Y2＞Y4＞Y15＞Y30＞Y5＞Y10＞Y1＞Y3＞Y0（細菌）。綜合ACE指數(shù)與Chao1 指數(shù)兩個指標，真菌的物種類型在貯存年限為2 至4年時豐富度較高，隨著貯存年限的增加物種豐富度下降，當貯存年限為30年時豐富度指數(shù)僅為指數(shù)得分較高樣品的1/6 至1/10；細菌的物種類型在貯存年限為2年、4年時豐富度較高，當樣品貯存10年以上豐富度指數(shù)變化差異小，物種類型數(shù)目趨于穩(wěn)定。

物種多樣性以Simpson 指數(shù)為評價指標，各樣品的多樣性順序為Y2＞Y4＞Y3＞Y5＞Y10＞Y0＞Y30＞Y15＞Y1 （真菌）；Y15＞Y10＞Y5＞Y3 （Y30）＞Y0＞Y1＞Y2＞Y4（細菌）。以Shannon 指數(shù)為評價指標，各樣品的多樣性順序為Y2＞Y3＞Y4＞Y5＞Y10＞Y0＞Y1＞Y15＞Y30（真菌）；Y5＞Y10＞Y15＞Y30＞Y3＞Y1＞Y4＞Y2＞Y0 （細菌）。綜合Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)兩個指標，在廣陳皮的產(chǎn)出初期與貯存年限超過10年時真菌物種多樣性較差，即物種均一性差，表明廣陳皮在產(chǎn)出初期與貯存較長年限后真菌的優(yōu)勢菌群更為突出。而廣陳皮中的細菌在貯存年限長的樣品中物種多樣性較大，即均一性較好，表明隨著貯存時間的延長，廣陳皮中各類細菌在長期生存競爭之下，逐漸達到一種相互制約平衡的狀態(tài)，這與真菌形成顯著優(yōu)勢菌群的情況存在差異。

2.3 主成分分析結果

通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）方法對不同樣品OUT 組成進行分析，并使用R 語言工具繪制PCA 分析圖，結果見圖3、圖4。

圖3 真菌PCA 分析圖Fig.3 PCA analysis of fungi

圖4 細菌PCA 分析圖Fig.4 PCA analysis of bacteria

由真菌的主成分分析圖可知，兩主成分之和大于90%，表明兩個成分能很好地代表樣品中真菌群落的信息，其中PC1 和PC2 分別解釋了不同真菌群落71.10%和26.84%的信息。根據(jù)主成分分析結果可將不同貯存時間的廣陳皮樣品劃分為3組，貯存0年、1年為一組，貯存2年、3年、4年、5年、10年為一組，貯存15年、30年為一組。

由細菌的主成分分析圖可知，兩主成分之和大于60%，其中PC1 和PC2 分別解釋了不同細菌群落32.01%和28.63%的信息，兩個成分所占比重相似。綜合兩大主成分的分析結果，不同年限的廣陳皮樣品可歸為4 類，貯存1年、3年、5年、10年、15年、30年為一類，貯存0年、2年、4年各為一類。

2.4 真菌群落分布特征

基于ITS 區(qū)高通量測序的序列數(shù)據(jù)，并結合OUT 分析、Alpha 多樣性分析與主成分分析的結果表明，9 個不同貯存年限的廣陳皮樣品，其真菌的物種類型豐富程度總體為先上升后下降，在貯存年限為2年、3年、4年、5年、10年時物種類型數(shù)目較多且均一性好，說明該期間廣陳皮各真菌群落生長活力差異較小，不同菌落之間競爭生存以維持一個相對穩(wěn)定的微生物環(huán)境。在此期間青霉菌屬與曲霉屬為主要菌群。據(jù)相關研究報道[7、11-12]，青霉菌具有一定的酶活性，可降解纖維素等以提高總黃酮的提取率。曲霉作為發(fā)酵工業(yè)的常用菌種，可促使化學活性物質(zhì)合成轉化。貯存3年的廣陳皮中青霉菌屬和曲霉屬活力較強與傳統(tǒng)要求的“存期3年或以上的才稱之為陳皮” 的說法相對應，從各分析結果還可知，在貯存初期與超過10年的樣品中真菌群落中優(yōu)勢菌屬顯著，但這兩種時期的優(yōu)勢菌屬種類卻大不相同。陳皮在產(chǎn)出當年有孢漢遜酵母屬相對豐度優(yōu)勢明顯，但經(jīng)過1年之后相對豐度占比減少至初始的三分之一，其相對豐度與曲霉屬相當，約占總體的3%，貯存2年的樣品中已不存在有孢漢遜酵母屬，而耐干霉菌屬則表現(xiàn)出相反的豐度變化趨勢。有孢漢遜酵母屬為一類拮抗酵母菌常噴灑于柑橘上以抑制柑橘采后病害的發(fā)生[10]，故此推斷在產(chǎn)出當年有孢漢遜酵母屬相對豐度占比高可能是由人為導致，后主導地位被更適宜生存的青霉菌等所取代。但隨著年限的延長，真菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，生存條件逐漸惡化，大部分菌種難以存活，而耐干霉菌屬這種極端環(huán)境微生物相對豐度不斷地增加，由第10年的40%在第15年上升至80%，成為絕對的優(yōu)勢菌屬。

2.5 細菌群落分布特征

通過16S 區(qū)高通量測序得到序列數(shù)據(jù)，運用OUT 分析、Alpha 多樣性分析與主成分分析可知細菌在不同年限樣品中的變化規(guī)律。區(qū)別于真菌，細菌種類數(shù)目的變化趨勢波動較大，但變化幅度較小。細菌中的優(yōu)勢菌屬有鞘氨醇單胞菌、乳桿菌屬、另枝菌屬與泛菌屬，分別為貯存年限0年、1年、2年與4年樣品的優(yōu)勢菌屬，以及在各年份樣品中均占有較高相對豐度的瘤胃球菌屬。因優(yōu)勢菌屬的制約，0年、1年、2年和4年的樣品雖菌群種類豐富度略高，但均一性較差。加之不同年限優(yōu)勢菌屬存在差異，貯存年限0年、2年、4年的樣品與其它年限的樣品被劃歸為不同類別。其中鞘氨醇單胞菌作為貯存0年樣品的優(yōu)勢菌屬具有降解芳香化合物的特性，解釋了研究報道[13]中所述的廣陳皮在陳化初期，阿魏酸、綠原酸呈下降趨勢而香豆酸呈上升趨勢的現(xiàn)象。作為早期優(yōu)勢菌的乳桿菌屬與泛菌屬主要分解消耗鼠李糖、果糖、蔗糖等營養(yǎng)物質(zhì)。而在各年份均有著較高相對豐度的瘤胃球菌屬可降解細胞壁中的纖維素，這將有利于植物細胞中物質(zhì)的溶出，提高藥效物質(zhì)的提取率。通過以上不同細菌屬的生物特性與分布特點可以從微生物的角度更好地理解廣陳皮的陳化機制。

3 結論

通過本研究可知，不同年份廣陳皮表面微生物的分布特點與自身的生物習性和所處的外在環(huán)境息息相關，寄生于廣陳皮的微生物在消耗廣陳皮營養(yǎng)物質(zhì)的同時亦代謝產(chǎn)生各種活性酶而作用于寄主，以此改變寄主的內(nèi)在物質(zhì)基礎。因此在廣陳皮的陳化過程中，不同年份優(yōu)勢菌屬的改變，也可從一定程度上反映廣陳皮所處的年份，如同藥材的成分特征圖譜，不同的菌屬亦可用于表達廣陳皮的年份信息。相較于真菌，細菌在不同年份間的種類差異不是那么顯著，故基于本次研究結果，可建立以真菌特征菌屬為主，細菌特征菌屬為輔的模式來初步判斷陳皮藥材的貯存時間。其中貯存年限0年的廣陳皮應檢出真菌孢漢遜酵母屬或細菌1174-901-12，且不能檢出耐干霉菌屬；貯存年限1 至5年應檢出青霉菌屬與曲霉屬，可檢出真菌鐮刀菌屬或細菌泛菌屬；貯存年限5年以上至10年的廣陳皮應檢出青霉菌屬、曲霉屬與耐干霉菌屬；貯存年限10年以上的廣陳皮應檢出耐干霉菌屬，青霉菌屬與曲霉菌屬不得檢出或少量檢出。

本研究利用高通量測序方法分析了0，1，2，3，4，5，10，15，30年的廣陳皮藥材表面微生物分布特點，從環(huán)境因子以外的另一個方面來更深入的認識廣陳皮的陳化機制，加之本次研究所用廣陳皮藥材的貯存年限跨幅大，可較之前類似的報道更為全面地反映了微生物與廣陳皮年份之間的關系，有助于更好地分析微生物對廣陳皮陳化過程的影響，揭示廣陳皮藥效物質(zhì)的形成機理。另外，本文對廣陳皮特征菌屬這一概念的首次提出可為陳皮質(zhì)量研究提供新的思路。