ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)貯藏期間雙孢蘑菇表面微生物生長(zhǎng)和保鮮的影響

魏 奇，李 婕，劉蓓蓓，羅小芳，方 婷，陳炳智，江玉姬*

（1 寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建寧德 352100 2 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），俗稱紐扣蘑菇或白蘑菇，是一種高蛋白、低脂肪的食用菌，因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而倍受各國(guó)人們的青睞。然而，采收后的雙孢蘑菇含水量較高（90%），組織結(jié)構(gòu)柔軟，呼吸強(qiáng)度高，仍然有強(qiáng)烈的生理代謝活動(dòng)。雙孢蘑菇在環(huán)境因素和微生物的作用下，比較容易發(fā)生色澤和風(fēng)味的改變。雙孢蘑菇的質(zhì)地柔嫩，在貯運(yùn)和市場(chǎng)銷售過程中也更加容易受到機(jī)械損傷，從而導(dǎo)致雙孢蘑菇產(chǎn)生褐變和腐爛，不利于長(zhǎng)期貯存[1]。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（ε-PL）這種功能性多肽由多個(gè)賴氨酸殘基聚合而成，主要從鏈霉菌屬的代謝產(chǎn)物中獲得。較多文獻(xiàn)報(bào)道：ε-PL 具有廣譜抑菌的特性，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等具有抑制作用[2]。ε-PL 作為天然防腐抑菌劑，對(duì)人體安全無毒，在食品中應(yīng)用具有良好的前景。早在2003年，F(xiàn)DA 就批準(zhǔn)ε-PL 為安全食品保鮮劑，我國(guó)于2014 批準(zhǔn)ε-PL 用于蔬果保鮮[3]。目前有關(guān)ε-PL 對(duì)食用菌的保鮮研究較少。預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型是一種快速、高效的評(píng)估微生物生長(zhǎng)潛力或預(yù)測(cè)特定條件下微生物生長(zhǎng)的方法，被認(rèn)為是評(píng)估產(chǎn)品貨架期和食品安全的重要工具，以執(zhí)行危害分析并設(shè)置關(guān)鍵控制點(diǎn)，進(jìn)一步制定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)劃[4]。在食品加工和儲(chǔ)存過程中，預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型可以用于描述致病或腐敗微生物的生長(zhǎng)行為，其中，時(shí)間是重要的參數(shù)之一[5]。

目前，雙孢蘑菇常用的保鮮方法是低溫貯藏。本課題組前期研究雙孢蘑菇表面微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和優(yōu)勢(shì)腐敗菌，發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇表面主要的腐敗微生物為假單胞菌[6]。假單胞菌是常見的腐敗微生物，可通過引起雙孢蘑菇褐變、斑點(diǎn)和腐敗而顯著降低其品質(zhì)[7]。據(jù)報(bào)道，傘菌假單胞菌（Pseudomonas agarici）是引起雙孢蘑菇表面斑點(diǎn)的主要因素[8]。Gill 等[9]研究表明托拉斯假單胞菌（Pseudomonas tolaasii）會(huì)引起雙孢蘑菇褐斑病。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道：4 ℃并不能完全抑制假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖，在食品冷藏條件下假單胞菌比其它腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)速率快，僅采用低溫貯藏措施不能完全抑制雙孢蘑菇表面假單胞菌的增長(zhǎng)。雙孢蘑菇在生產(chǎn)運(yùn)輸、貯藏銷售的過程中，常被置于溫度相對(duì)較高的環(huán)境下，加速了微生物的生長(zhǎng)繁殖[11]。本研究利用低溫結(jié)合ε-PL，研究其對(duì)雙孢蘑菇表面微生物生長(zhǎng)的影響，建立貨架期預(yù)測(cè)模型，為雙孢蘑菇的保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)所用的食用菌子實(shí)體（雙孢蘑菇）由福建省漳州市同發(fā)食品工業(yè)有限公司提供。

細(xì)菌菌種：托拉斯假單胞菌（Pseudomonas tolaasii）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、米氏假單胞菌（Pseudomonas migulae）和傘菌假單胞菌（Pseudomonas agarici）為雙孢蘑菇表面分離得到[6]。

蛋白胨粉（Peptone），杭州微生物試劑有限公司；腦-心浸出液肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂、假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基（CFC），青島海博生物技術(shù)有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，浙江新銀象生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B-CYD2022L 無菌采樣袋，比克曼生物科技有限公司；MX-S 混勻儀，北京興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；JZ-1 拍擊式均質(zhì)機(jī)，拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司；Megafuge 8 離心機(jī)，上海賽默飛世爾科技有限公司；MGC-100 光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TMS-PRO 質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC 公司；ADCI-60-C 全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司；MB25 水分測(cè)定儀，奧豪斯有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液的制備 4 株假單胞混合菌液制備參考李長(zhǎng)城[12]的方法，接種至雙孢蘑菇的混合假單胞菌液濃度為107～108CFU/mL。

1.3.2 樣品處理 選擇外觀潔白，大小一致，無褐變和機(jī)械損傷的新鮮雙孢蘑菇。一部分用5 kGy劑量輻照處理，用來測(cè)定假單胞菌的生長(zhǎng)情況；另一部分置于4 ℃條件下存放，用來測(cè)量背景菌的生長(zhǎng)情況。在無菌條件下，將質(zhì)量濃度為0.15 g/L和0.30 g/L 的ε-聚賴氨酸水溶液用噴霧器均勻地噴灑到菇體表面，自然晾干。用無菌均質(zhì)袋將雙孢蘑菇分裝成質(zhì)量約為25 g 于無菌均質(zhì)袋中，其中輻照組需將100 μL 假單胞菌混合菌懸液接種至雙孢蘑菇樣品中，最終雙孢蘑菇樣品中細(xì)菌濃度為4.0～5.0 lg（CFU/g），并在所有樣品袋貼上標(biāo)簽。

1.3.3 培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 參考彭亞博等[13]的方法。背景菌和假單胞菌菌數(shù)轉(zhuǎn)化為以10 為底的對(duì)數(shù)或自然對(duì)數(shù)。最終單位以lg （CFU/g）表示。

1.3.4 模型的建立 根據(jù)研究表明，采用修正的Gompertz 模型對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌和背景菌群的生長(zhǎng)曲線均具良好的擬合精確度[6]。故本文繼續(xù)采用修正的Gompertz 模型擬合。表達(dá)式如下：

式中：X（t）——t 時(shí)刻細(xì)菌的菌數(shù)，ln（CFU/g）；X0——細(xì)菌的初始菌數(shù)，ln（CFU/g）；Xmax——細(xì)菌的穩(wěn)定期菌數(shù)，ln（CFU/g）；μmax——比生長(zhǎng)速率，h-1。

1.3.5 感官評(píng)分 參照Lukasse 等[14]進(jìn)行感官評(píng)價(jià)的評(píng)定。感官評(píng)級(jí)表見表1。

表1 感官指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory properties

1.3.6 顏色的評(píng)價(jià) 通過ADCI-60-C 全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)測(cè)定雙孢蘑菇蓋的黑白度L*值，從而對(duì)雙孢蘑菇的顏色進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.7 硬度評(píng)價(jià) 采用SMSTA TA.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定雙孢蘑菇的硬度。質(zhì)構(gòu)儀的設(shè)置參數(shù)如下：P/2 探頭；100 g 觸發(fā)力；10%壓縮比；1 mm·s-1測(cè)前速度；1 mm·s-1測(cè)中速度；10 mm·s-1測(cè)后速度。

1.3.8 失重率的測(cè)定 采用稱量法測(cè)定雙孢蘑菇的失重率。M1為貯藏前雙孢蘑菇的質(zhì)量，g；M2為貯藏后雙孢蘑菇的質(zhì)量，g。

1.3.9 水分含量的測(cè)定 將雙孢蘑菇子實(shí)體去柄去菌褶，縱切成1 mm 的薄片，稱取1 g 后采用水分測(cè)定儀測(cè)定水分含量。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 背景菌及假單胞菌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)均采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部東部地區(qū)研究中心開發(fā)的預(yù)測(cè)微生物專用軟件IPMP2013（Integrated Pathogen Modeling Program）進(jìn)行分析。采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性差異分析（Duncan 法，顯著水平P≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和ε-PL 濃度對(duì)雙孢蘑菇表面微生物生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知，在4，16 和25 ℃時(shí)，經(jīng)過不同濃度的ε-PL （0.15 和0.30 g/L）處理，雙孢蘑菇表面背景菌和假單胞菌的生長(zhǎng)曲線有所不同。背景菌和假單胞菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)出完整的3 個(gè)階段，分別為：遲緩期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。雙孢蘑菇表面背景菌群在穩(wěn)定期的菌落數(shù)大于假單胞菌。溫度和貯藏時(shí)間微生物的生長(zhǎng)具有影響，低溫貯藏則有利于抑制微生物的生長(zhǎng)。在16 和25 ℃時(shí)，ε-PL對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌生長(zhǎng)無明顯抑制作用。在4 ℃條件下，ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)有抑制作用，質(zhì)量濃度為0.30 g/L的ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)抑制作用效果最佳。由此可知，低溫條件和ε-PL 協(xié)同作用對(duì)雙孢蘑菇具有較好的保鮮作用。

圖1 ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect the of growth of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus treated with ε-PL

2.2 溫度和ε-PL 濃度對(duì)雙孢蘑菇表面微生物生長(zhǎng)速率的影響

由表2可知，不同濃度的ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群生長(zhǎng)速率影響不大。由圖2可知，不同濃度ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群最大生長(zhǎng)菌數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。4，16 和25 ℃時(shí)，最大生長(zhǎng)菌數(shù)分別為7.42，8.35 和8.65 lg（CFU/g）。在4℃時(shí)，不同濃度ε-PL 處理后的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌最大生長(zhǎng)菌數(shù)分別為7.42，6.60，6.36 lg（CFU/g）。而4 ℃條件下，添加0.15 g/L 和0.30 g/L濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長(zhǎng)速率分別為0.026 h-1和0.017 h-1，明顯低于對(duì)照組0.035 h-1，表明在4 ℃條件下，質(zhì)量濃度0.15 g/L和0.30 g/L 的ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)有抑制作用。

圖2 雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌在不同溫度、濃度ε-PL 下最大生長(zhǎng)菌數(shù)Fig.2 The maximum bacterial populations of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus at different temperature and different concentrations of ε-PL

表2 溫度和ε-PL 濃度對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長(zhǎng)速率影響Table 2 Effects of temperature and concentrations of ε-PL on the growth rate of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus

16 ℃時(shí)，不同濃度ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇樣品中假單胞菌最大生長(zhǎng)菌數(shù)分別為8.18，8.28，8.35 lg（CFU/g）。在16 ℃條件下，添加0.00，0.15 和0.30g/L 質(zhì)量濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長(zhǎng)速率分 別：0.200，0.243 和0.233 h-1，ε-PL對(duì)其抑制效果無顯著性差異（P＞0.05）。

在25 ℃時(shí)，最大生長(zhǎng)菌數(shù)分別為8.65，8.64，8.55 lg（CFU/g）。而25 ℃下，添加0.00，0.15 和0.30 g/L 質(zhì)量濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長(zhǎng)速率分別：0.569，0.655 和0.523 h-1，說明0.00～0.30 g/L 質(zhì)量濃度ε-PL 對(duì)其抑制效果無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同溫度、ε-PL 濃度條件下雙孢蘑菇貨架期方程

從微生物的角度來說，背景菌群的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可以反映產(chǎn)品的貨架期，表3列出了不同溫度和不同濃度ε-PL 下雙孢蘑菇貨架期方程，可為評(píng)價(jià)雙孢蘑菇相關(guān)產(chǎn)品的貨架期提供參考。

表3 雙孢蘑菇的貨架期方程Table 3 The shelf life equation of Agaricus bisporus

2.4 低溫（4 ℃）條件下ε-PL 濃度對(duì)雙孢蘑菇品質(zhì)的影響

ε-PL 是一種多肽類的天然保鮮劑，抑菌性能良好，且對(duì)人體安全無害。ε-PL 處理對(duì)雙孢蘑菇感官評(píng)價(jià)如圖3所示。第0 天時(shí)，經(jīng)0.15 和0.30 g/L 質(zhì)量濃度ε-PL 處理的雙孢蘑菇與對(duì)照組（0.00 g/L）相比，無明顯差別，說明ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇的外觀品質(zhì)沒有影響。在貯藏溫度為4 ℃的條件下，雙孢蘑菇的感官評(píng)分隨著貯藏時(shí)間的增加而降低。在貯藏時(shí)間為第8 天時(shí)，雙孢蘑菇具有明顯開傘的情況，菇體外觀顏色變暗，菇體產(chǎn)生異味，出現(xiàn)褐變和腐爛，食用品質(zhì)下降，失去商品價(jià)值。

圖3 雙孢蘑菇貯藏期間感官評(píng)價(jià)變化情況Fig.3 Sensory evaluation of Agaricus bisporus during storage

2.5 不同ε-PL 濃度處理對(duì)雙孢蘑菇白度的影響

雙孢蘑菇菌蓋的潔白與否是消費(fèi)者判斷雙孢蘑菇品質(zhì)的重要指標(biāo)。采收后的雙孢蘑菇菌蓋較容易發(fā)生褐變，會(huì)導(dǎo)致雙孢蘑菇中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，降低雙孢蘑菇的品質(zhì)，影響其商品價(jià)值。L*值越高提示雙孢蘑菇褐變程度越低。如圖4所示，不同處理組的L*值均呈現(xiàn)不斷降低的現(xiàn)象。經(jīng)0.00，0.15 和0.30 g/L 質(zhì)量濃度的ε-PL 處理的雙孢蘑菇的L*初始值分別為84.24，84.61，84.86，無顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)照組（0.00 g/L）的L*值下降速率較快，貯藏4 d 后L*值從84.24 降到76.26，而0.30 g/L 質(zhì)量濃度的ε-PL 處理組貯藏4 d 時(shí)的L*值為78.02，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可知，ε-PL 處理能夠延緩雙孢蘑菇的褐變。貯藏第6 天時(shí)，對(duì)照組與處理組的L*值均降至75以下。

圖4 雙孢蘑菇貯藏期間白度值變化情況Fig.4 The value of L* on Agaricus bisporus during storage

2.6 不同ε-PL 濃度處理對(duì)雙孢蘑菇硬度的影響

硬度是判定雙孢蘑菇品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。新鮮程度較高的雙孢蘑菇組織結(jié)構(gòu)緊密，其菇體內(nèi)含水量高可以較好地維持細(xì)胞膨壓，因此菇體的硬度值也較高[15]。雙孢蘑菇在貯藏期間，由于呼吸作用和蒸騰作用，菇體的水分會(huì)逐漸減少，并且菇體產(chǎn)生自溶，導(dǎo)致雙孢蘑菇的硬度降低[16]。據(jù)報(bào)道，雙孢蘑菇采后貨架期短，易受微生物侵染，腐敗細(xì)菌（如假單胞菌）產(chǎn)生的酶能夠降解菇體的細(xì)胞壁，分解細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)，使細(xì)胞產(chǎn)生破裂，膨壓發(fā)生改變，導(dǎo)致菇體組織結(jié)構(gòu)變軟，硬度降低[17-19]。由圖5可知，與對(duì)照組相比，在第2，4，6，8 和10 天時(shí)，經(jīng)過ε-PL 處理后，雙孢蘑菇的菇體硬度能夠顯著提高（P＜0.05）。第8 天時(shí)，對(duì)照組的硬度指標(biāo)減少了21.76%，而0.15 和0.30 g/L 的ε-PL 處理組僅分別下降了11.72%和6.25%。由此說明，ε-PL 處理可以保持雙孢蘑菇較高的硬果，有一定的保鮮效果。

圖5 ε-PL 對(duì)貯藏期間雙孢蘑菇硬度的影響Fig.5 The effect of hardness on Agaricus bisporus treated with ε-PL during storage

2.7 不同ε-PL 濃度處理對(duì)雙孢蘑菇水分含量和失重的影響

雙孢蘑菇子實(shí)體中含水量高，據(jù)報(bào)道，失重率達(dá)到5%時(shí)，雙孢蘑菇菇體會(huì)產(chǎn)生皺縮，增加PPO等酶的活力，由此加速雙孢蘑菇的褐變。雙孢蘑菇的失重的主要原因是水分蒸騰作用。由圖6和圖7所示，4 ℃貯藏期間，經(jīng)0.00，0.15 和0.30 g/L 質(zhì)量濃度的ε-PL 處理的雙孢蘑菇的初始水分含量分別為92.21%，92.38%，93.43%，無顯著性差異（P＞0.05）。失重率的上升與水分含量的下降屬于對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，雙孢蘑菇的失重率逐漸增大，而水分含量逐漸減小。在貯藏期間，與對(duì)照組相比，ε-PL 處理的雙胞蘑菇其水分含量高于對(duì)照組，但沒有顯著差異（P＞0.05）；并且能夠減緩雙孢蘑菇的質(zhì)量損失。

圖6 雙孢蘑菇貯藏期間失重率變化情況Fig.6 The weight loss rate of Agaricus bisporus during storage

圖7 雙孢蘑菇貯藏期間水分含量變化情況Fig.7 The moisture content of Agaricus bisporus during storage

3 討論

物理方法對(duì)設(shè)備要求較高?；瘜W(xué)方法具有成本低和保鮮效果好的特點(diǎn)，但是化學(xué)殘留物具有不可避免的毒副作用。因此，高效無毒的天然保鮮劑在雙孢蘑菇的應(yīng)用前景十分廣闊?；艚÷?shù)萚19]研究發(fā)現(xiàn)超高壓與ε-PL 處理能夠有效保持鰹魚色澤，延長(zhǎng)鰹魚的貨架期。但目前聚賴氨酸對(duì)于食用菌的保鮮研究相對(duì)較少。因此，本研究通過探究恒溫（4～25 ℃）條件下不同質(zhì)量濃度的ε-PL（0.00，0.15 和0.30 g/L）添加量處理對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長(zhǎng)的抑制作用，并建立相應(yīng)的貨架期預(yù)測(cè)模型，結(jié)合感官、色澤、質(zhì)地、失重情況、水分變化等指標(biāo)，綜合探討ε-PL 在不同溫度條件下對(duì)雙孢蘑菇的保鮮效果。研究發(fā)現(xiàn)，在4，16 和25 ℃時(shí)，雙孢蘑菇在不同質(zhì)量濃度的ε-PL（0.15 和0.30 g/L）作用下，背景菌群及假單胞菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)出完整的3 個(gè)階段。在4 ℃條件下ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)有抑制作用，質(zhì)量濃度為0.30 g/L 的ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)有顯著抑制作用（P＜0.05）。周祺等[20]研究表明：ε-PL 對(duì)腸球菌具有抑制作用。肖媛等[21]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過ε-PL 處理，能夠降低柑橘果實(shí)酸腐病的損傷接種發(fā)病率和病斑直徑，破壞柑橘酸腐病細(xì)胞膜的完整性，抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，由此表明ε-PL 具有良好抑菌的作用。在16 ℃和25 ℃條件下ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長(zhǎng)無顯著性差異（P＞0.05）。在4 ℃條件下，不同質(zhì)量濃度的ε-PL（0.15 和0.30 g/L）處理的雙孢蘑菇感官品質(zhì)、L*值、硬度和水分含量隨著貯藏時(shí)間的增加而逐漸下降，失重率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小。雙孢蘑菇的褐變與菇體內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化及微生物有著密切的關(guān)系[22]。本研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，ε-PL 能夠提高雙孢蘑菇的硬度和持水性，延緩菇體發(fā)生褐變，對(duì)延長(zhǎng)雙孢蘑菇的貨架期具有積極的作用。研究報(bào)道表明ε-PL 可以提高櫻桃，鮮切菠菜等果蔬的貯藏品質(zhì)，并且延長(zhǎng)其貨架期[23-24]。綜上所述，在4 ℃條件下，質(zhì)量濃度為0.30 g/L 的ε-PL 對(duì)雙孢蘑菇表面假單胞菌生長(zhǎng)有顯著抑制作用，并且ε-PL 處理可以提高雙孢蘑菇的品質(zhì)，延長(zhǎng)雙孢蘑菇的貯藏期。

注：圖中不同字母表示在0.05 水平上差異顯著，相同字母表示差異不顯著。