鰱魚背肌組織蛋白酶L的初步分離及蛋白層析純化方法

王 謙，焦熙棟，閆博文，孟令璐，曹洪偉，黃建聯(lián)，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)，范大明

（1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫 214122 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍與調(diào)理水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361022 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 4 福建省冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361022 5 福建安井食品股份有限公司 福建廈門 361022）

中國(guó)淡水鰱魚資源豐富，以鰱魚肌肉為原料加工的魚糜制品因高蛋白和低脂肪等特點(diǎn)而消費(fèi)前景看好。在魚糜加工過程中大多出現(xiàn)凝膠劣化現(xiàn)象，魚肉被內(nèi)源性蛋白酶降解，導(dǎo)致魚糜凝膠強(qiáng)度低、口感差等問題[1]，其中淡水魚糜制品的凝膠劣化現(xiàn)象相較于海水魚更為嚴(yán)重[2]。大多數(shù)研究認(rèn)為肌纖維結(jié)合性蛋白酶是魚糜凝膠劣化現(xiàn)象的主要誘因，因?yàn)槠渑c蛋白結(jié)合緊密，在魚糜加工過程中不易去除[3]。其中，組織蛋白酶L（EC 3.4.22.15）因水洗后殘留活性高、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抗凍性強(qiáng)和具有廣泛的底物特異性等特征而備受關(guān)注[4-6]。目前研究大多通過分子克隆手段獲得組織蛋白酶L，此方法難度較大，尤其是異源蛋白的表達(dá)受多種因素影響，從而間接影響酶的活性和結(jié)構(gòu)[7]。市售組織蛋白酶L 大多來源于哺乳動(dòng)物，而魚類與哺乳動(dòng)物組織蛋白酶L 的同源性較差，白鰱組織蛋白酶L 的基因片段尚未被鑒定，針對(duì)鰱魚組織蛋白酶L 的分子克隆研究極少。有必要對(duì)白鰱的內(nèi)源性組織蛋白酶L 進(jìn)行分離純化，為研究抑制魚糜凝膠劣化方法提供依據(jù)。

由于組織蛋白酶L 含量較少且其和肌肉結(jié)合緊密性強(qiáng)，現(xiàn)有的純化方法大多采用陰離子交換層析、分子篩層析、陽(yáng)離子交換層析和染料親和層析組合的多步層析法來保證其純度，然而此法步驟繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)且回收率低[8]。本文在現(xiàn)有組織蛋白酶L 分離純化方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化酸處理、鹽析和透析等分離步驟，建立弱陰離子交換和分子篩兩步層析法，作為一種分離純化鰱魚組織蛋白酶L 的新型方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活白鰱（每條1 500～2 000 g），購(gòu)買于附近超市，擊暈宰殺后裝冰速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室待用；蛋白純化層析柱 HiTrap SP HP、HiTrap Q HP、HiTrap DEAE FF （1.6 cm×2.5 cm） 和HiLoad16/600 Superdex 75 pg（1.6 cm×60 cm）Cytiva（思拓凡），原通用電氣醫(yī)療生命科學(xué)事業(yè)部；熒光合成底物ZPhe-Arg-MCA 和7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），美國(guó)sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇公司；Bradford蛋白測(cè)定試劑盒，上海碧云天有限公司；快速銀染試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；三氯乙酸、乙酸、乙醇、十二烷基磺酸鈉、氯化鈉、醋酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空斬拌乳化混合多功能一體機(jī)，德國(guó)Stephan 公司；AKTA pure 蛋白層析系統(tǒng)，瑞典通用電氣醫(yī)療集團(tuán)（GE Healthcare）；F-7000 熒光光譜儀，日本日立（Hitachi）公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司；79480-3 冷凍干燥機(jī)，美國(guó)CONCO 公司；蛋白電泳系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶的分離 宰殺后的新鮮白鰱取其背部肌肉放入真空斬拌鍋低速斬拌至碎肉狀，加入4倍體積4 ℃預(yù)冷的25 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（含5 mmol/L L-Cys、0.3 mmol/L PMSF，pH 5.0） 于4 ℃勻漿20 min 后12 000×g 離心20 min 取上清液，上清液用四層紗布過濾后即為粗酶分離液。

1.3.2 酸處理 用1 mol/L 鹽酸分別調(diào)整粗酶分離液的pH 值至3.0 和4.0，于30 ℃分別反應(yīng)5，10，15，20，25，30 min 后用1 mol/L 氫氧化鈉回調(diào)pH 值至5.8～6.0，立即12 000×g 離心20 min 取上清液測(cè)酶活，此上清液即為酸化級(jí)分。

1.3.3 硫酸銨鹽析 對(duì)酸化級(jí)分用40%～90%的硫酸銨分級(jí)沉淀，充分鹽析后12 000×g 離心20 min，分別收集沉淀和上清液，測(cè)其蛋白濃度和酶活。收集到的沉淀部分即為硫酸銨級(jí)分。

1.3.4 透析超濾濃縮 對(duì)硫酸銨級(jí)分用含有5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0 的20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液溶解，選用分子質(zhì)量分別為3 500，7 000，14 000 u 的透析膜于4 ℃下透析24 h。透析級(jí)分通過超濾濃縮即為濃縮粗酶液。

1.3.5 離子交換層析 將濃縮粗酶液用0.45 μm微孔濾膜過濾后分別上樣到HiTrap DEAE FF（1.6 cm×2.5 cm）、HiTrap Q HP （1.6 cm×2.5 cm）、HiTrap SP HP（1.6 cm×2.5 cm）離子交換柱，流動(dòng)相A 分別為20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液 （含5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0，7.0）、50 mmol/L 的乙酸鹽緩沖液（含5 mmol/L L-Cys，pH 值為4.5），以0～1 mol/L 氯化鈉梯度洗脫，收集活性峰后透析、超濾濃縮，即為離子交換級(jí)分。流速1 mL/min，每管收集4 mL。

1.3.6 HiLoad16/600 Superdex 75 pg 凝膠過濾層析 將離子交換級(jí)分上樣于HiLoad16/600 Superdex 75 pg （1.6 cm×60 cm） 凝膠柱，用含0.2 mol/L 氯化鈉的20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液 （含5 mmol/L L-Cys，pH 值為6.0）平衡和洗脫，流速為1 mL/min，收集活性峰，每管4 mL，透析超濾濃縮凍干存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 組織蛋白酶L 活力測(cè)定 參照Yamashita等[9]的方法，將組織蛋白酶L 的特異性底物ZPhe-Arg-MCA 濃度配制成0.1 mol/L，將含有20 mmol/L 新制備的半胱氨酸的0.5 mL 4 mmol/L EDTA-0.4 mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）加入到0.9 mL 樣品中?；旌先芤涸?5 ℃下預(yù)熱，同時(shí)快速加入0.5 mL 0.1 mmol/L 合成底物開始反應(yīng)。在25 ℃下反應(yīng)30 min 后，通過添加3.0 mL 0.1 mol/L三氯乙酸0.1 mol/L 乙酸緩沖液（pH 4.5）終止反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 處測(cè)量了反應(yīng)體系中AMC 的熒光值。采用標(biāo)準(zhǔn)AMC樣品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在25 ℃下，按照1 個(gè)酶活單位為釋放1 nmol AMC 計(jì)算組織蛋白酶L 的活性。

1.3.8 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 參考考馬斯亮藍(lán)法，采用去垢劑兼容型Bradford 蛋白定量試劑盒，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。樣品組每根離心管加入100 μL 樣品稀釋液，迅速加入1 mL Bradford 工作液混勻，室溫15～30 ℃反應(yīng)10 min 后在分光光度計(jì)上測(cè)595 nm 處吸收值。

1.3.9 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染法 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法制備樣品凝膠，電泳完成后采用銀染法監(jiān)測(cè)凝膠中低豐度蛋白質(zhì)[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中隨機(jī)抽取樣本，每組樣品至少平行測(cè)定3 次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。測(cè)定樣品的平均值進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）。圖表用OriginPro 2017 軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 初步分離條件的優(yōu)化

目前已有較多研究從多種生物的肌肉或者內(nèi)臟中分離純化出組織蛋白酶L，包括從鯉魚背部白肌[11]、耗牛肉[12]、牛胰臟[6]、魷魚肝臟[13]等，主要采用硫酸銨鹽析和蛋白柱層析等多種蛋白純化方法相結(jié)合的手段。為了除去雜蛋白，提高酶的比活，本研究在初步提取階段對(duì)酸化、鹽析、透析3 個(gè)步驟進(jìn)行條件優(yōu)化。

2.1.1 酸處理?xiàng)l件的優(yōu)化 因?yàn)榻M織蛋白酶L 具有較高的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，通常會(huì)對(duì)粗酶液進(jìn)行先酸化保溫后回調(diào)pH 值的酸處理手段來提高回收率[15]。不同的酸處理?xiàng)l件下粗酶液中組織蛋白酶L 的活性變化如圖1所示，粗酶液經(jīng)過pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后，其中組織蛋白酶L 比活增加最多，是粗酶液的37 倍，故選取pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后回調(diào)至pH 6.0 作為酸處理最優(yōu)條件。

圖1 不同酸處理?xiàng)l件對(duì)組織蛋白酶L 活性的影響Fig.1 Effect of acid condition on cathepsin L activity

2.1.2 鹽析條件的優(yōu)化 硫酸銨鹽析法可以從大量粗酶液中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，還可以除去脂類等雜質(zhì)[14]。粗酶液的鹽析曲線如圖2所示，可以看出隨著硫酸銨飽和度的增加，組織蛋白酶L在30%～40%的蛋白沉淀中比活相對(duì)較少，只有1 U/mg 左右，而在55%的硫酸銨中開始大量沉降，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到55%，70%，80%，90%時(shí)，比活分別達(dá)到2.40，2.63，2.08，1.91 U/mg，因此選用55%～90%的硫酸銨飽和度可以最大限度回收目的蛋白。

圖2 組織蛋白酶L 的鹽析曲線Fig.2 Salting out curve of cathepsin L

2.1.3 透析條件的優(yōu)化 對(duì)用3 種透析袋分離得到的不同分子質(zhì)量的組分進(jìn)行組織蛋白酶L 活性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，通過7 000 u透析袋透析得到的組分中組織蛋白酶L 的比活最高，通過14 000 u 透析袋的組分比活最低，表明粗酶液在7 000～14 000 u 分子質(zhì)量范圍內(nèi)存有活性的組織蛋白酶L 中間體。這與前人的報(bào)道[16-17]一致，組織蛋白酶L 的分子質(zhì)量在30～45 ku 范圍內(nèi)，但在機(jī)體內(nèi)組織蛋白酶L 存在多種形式，包括酶-內(nèi)源抑制劑形式、無活性且低活性的前體形式和有活性的成熟單體形式，同時(shí)在酸化處理過程中會(huì)形成各種分子質(zhì)量形式的活性中間體和小分子質(zhì)量的成熟體，所以實(shí)際得到的產(chǎn)物是組織蛋白酶L 各種活性形式的混合物。因此為了最大限度回收具有活性的組織蛋白酶L，本法選取7 000 u 的透析袋進(jìn)行粗分離。

表1 不同分子質(zhì)量透析袋對(duì)組織蛋白酶L 活性的影響Table 1 Effects of molecular weight of dialysis bags on cathepsin L activity

2.2 蛋白純化條件的優(yōu)化

2.2.1 離子交換層析柱的選擇 Liu 等[18]采用離子交換層析、分子篩層析、陽(yáng)離子交換層析和親和層析四步純化出鰱魚背肌中的組織蛋白酶L；Hu等[19]采用一步離子交換色譜法從鯉魚背肌中純化得到組織蛋白酶L；Cui 等[6]和Ogata 等[20]的純化結(jié)果表明強(qiáng)陽(yáng)離子交換可以大幅提高組織蛋白酶L的比活，表明陽(yáng)離子交換柱對(duì)組織蛋白酶L 具有很好的分離效果。為了選取適合的蛋白純化層析柱，試驗(yàn)中采用強(qiáng)陽(yáng)離子（HiTrap SP HP）、強(qiáng)陰離子 （HiTrap Q HP） 和弱陰離子 （HiTrap DEAE FF）3 種離子交換柱對(duì)粗酶液中的組織蛋白酶L進(jìn)行分離，通過組織蛋白酶L 比活來篩選合適的離子交換柱，結(jié)果如圖3所示。

粗酶液經(jīng)弱陰離子柱交換層析（圖3a）后，在40～80 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為236 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分；經(jīng)強(qiáng)陰離子柱交換層析（圖3b）后，在15～30 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為181 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分；而經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子柱交換層析（圖3c）后，僅在50～60 mL 的洗脫體積范圍內(nèi)得到最高活力為113 U/L 的組織蛋白酶L 活性部分。陰離子柱分離得到的蛋白峰分離度更好，分辨率更高，且目的蛋白峰紫外強(qiáng)度在16 mAU 左右，而陽(yáng)離子柱分離得到的蛋白峰數(shù)量多且粘連，其目的蛋白峰紫外強(qiáng)度在2 mAU 左右，說明陰離子交換柱能有效吸附鰱魚組織蛋白酶L，且有效分離雜蛋白。此結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似[8，18-19，21]。

對(duì)比圖3a 和圖3b，可以看出經(jīng)弱陰離子柱分離得到的目的蛋白峰寬更大，且其洗脫得到的活性蛋白溶液中組織蛋白酶L 活力更高，是強(qiáng)陰離子柱的1.3 倍。該結(jié)果可能是因?yàn)閺?qiáng)陰離子柱的適用pH 值范圍在2～12，弱陰離子柱的適用pH值在2～9，故對(duì)于酸性蛋白酶（結(jié)果見圖8）的組織蛋白酶L 分離，弱陰離子柱的分辨率要高于強(qiáng)陰離子。因此根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取弱陰離子柱（Hi-Trap DEAE FF）作為組織蛋白酶L 分離純化的離子柱。

圖3 采用不用離子交換層析柱——HiTrap DEAE FF（a）、HiTrap Q HP（b）、HiTrap SP HP（c）對(duì)組織蛋白酶L 純化效果影響Fig.3 Effect of ion exchange chromatography column on purification of cathepsin L HiTrap DEAE FF （a），HiTrap Q HP （b），HiTrap SP HP （c）

2.2.2 流動(dòng)相A 的pH 值選擇 離子交換層析的基本反應(yīng)過程是填料與待分離物質(zhì)以及緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度和pH 值的選擇對(duì)于分離效果有很大的影響。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH 值的選擇首先要保證待分離蛋白的穩(wěn)定，并盡量使目的蛋白和雜質(zhì)與離子交換填料的結(jié)合有較大的差別，使目的蛋白與離子交換填料有穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)與離子交換填料結(jié)合不穩(wěn)定，因此選擇合適的平衡緩沖液就可以去除大量的雜蛋白[22]。大部分研究選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為平衡緩沖液，也有選取20 mmol/L、pH 7.5 的Tris-HCl 緩沖液作為弱陰離子柱的平衡緩沖液[13]。由于本試驗(yàn)選取的弱陰離子柱填料有所改進(jìn)，為了確定其最佳平衡緩沖液pH 值，分別選取pH 6.0 和pH 7.0 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液對(duì)組織蛋白酶L 分離，蛋白層析曲線結(jié)果如圖4所示。通過對(duì)比可以看出在pH 6.0 條件下此弱陰離子柱對(duì)組織蛋白酶L 的分離度更好，且其最高酶活（236 U/L）是pH 7.0 條件下（180 U/L）的1.31 倍。pH 6.0 條件下在280 nm處檢測(cè)到的目的蛋白峰強(qiáng)度為4～15 mAU，比pH 7.0 條件下的2～7 mAU 高，故選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為此弱陰離子柱的平衡緩沖液。該結(jié)果可能是因?yàn)閜H 6.0 更接近組織蛋白酶L 的等電點(diǎn)[7，23]，目的蛋白在其等電點(diǎn)處更容易保留。雖然根據(jù)等電點(diǎn)原理，目的蛋白在pH 7.0 的離子化程度更大，更容易被洗脫，然而試驗(yàn)結(jié)果在pH 7.0 時(shí)不好的原因可能是體系的離子強(qiáng)度大導(dǎo)致磷酸根和樣品會(huì)競(jìng)爭(zhēng)填料上的弱堿性陰離子基團(tuán)，從而導(dǎo)致洗脫后目的蛋白峰面積較小。

圖4 采用不用pH 值平衡緩沖液——pH 6.0（a）、pH 7.0（b）對(duì)組織蛋白酶L 純化效果影響Fig.4 Effect of different pH balance buffer on the purification of cathepsin L pH 6.0 （a），pH 7.0 （b）

2.2.3 分子篩層析 為了進(jìn)一步純化組織蛋白酶L，將經(jīng)弱陰離子柱交換后的活性部分收集濃縮加到平衡好的Superdex 75 pg 分子篩層析柱，所得層析洗脫曲線如圖5所示，可以看出在40～50 mL洗脫體積處有蛋白組分Ⅰ和組分Ⅱ，在50～70 mL洗脫體積處有一組紫外信號(hào)較弱的蛋白組分Ⅲ，在100～120 mL 洗脫體積處有紫外信號(hào)較強(qiáng)的蛋白組分Ⅳ，通過酶活測(cè)定表明蛋白組分Ⅲ為組織蛋白酶L，同時(shí)也表明分子篩層析柱能夠?qū)⒔M織蛋白酶L 與其它雜蛋白進(jìn)一步分離。

圖5 組織蛋白酶L 的Superdex 75 pg 分子篩層析洗脫曲線Fig.5 Superdex 75 pg molecular sieve elution curve of cathepsin L

2.3 組織蛋白酶L 初步分離及純化方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 SDS-PAGE 電泳法鑒定純度 將具有組織蛋白酶L 活性的洗脫部分收集濃縮后通過SDSPAGE 電泳銀染色法鑒定其純度，結(jié)果如圖6所示。泳道2 顯示粗酶液通過弱陰離子交換層析后大分子質(zhì)量雜蛋白已經(jīng)得到有效去除，但仍有部分雜蛋白保留。泳道3 顯示通過分子篩層析柱的組織蛋白酶L 活性部分在45 ku 處出現(xiàn)單一條帶，表明上述兩步組合層析法可獲得電泳純的組織蛋白酶L。其它研究從鯉魚中獲得的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為36 ku[19]，從藍(lán)園鲹中純化的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為30 ku[21]，Li 等[8]證明鰱魚的組織蛋白酶L 前體的分子質(zhì)量為78 ku，而組織蛋白酶L 之間分子質(zhì)量的差異可以歸因于使用的魚類種類和試驗(yàn)條件的不同。由于本研究中純化的組織蛋白酶L 分子質(zhì)量為45 ku，低于組織蛋白酶L 前體的分子質(zhì)量（78 ku），故推測(cè)本研究中純化的組織蛋白酶L 為成熟形態(tài)。

圖6 鰱魚背肌組織蛋白酶L 的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of cathepsin L in silver carp dorsal muscle

2.3.2 粗分離及純化結(jié)果表征 粗分離各步及層析過程中組織蛋白酶L 的比活和純化倍數(shù)結(jié)果見表2，經(jīng)過兩步層析法最終純化倍數(shù)為487 倍，從1 000 g 鰱魚肌肉中分離純化的組織蛋白酶L 約22 mg。結(jié)果顯示粗分離步驟的純化效率一般，經(jīng)弱陰離子交換層析后純化倍數(shù)相較于粗酶液提高了近3 倍，分子篩層析一步的純化倍數(shù)相比陰離子層析提高不顯著，說明陰離子交換柱已去除大部分雜蛋白。Hu 等[19]采用一步離子交換色譜法從1 000 g 魚中純化出4.35 mg 組織蛋白酶L，純化倍數(shù)為18 倍。Li 等[8]采用離子交換、凝膠過濾和親和層析四步法從1 000 g 魚肉中純化出0.32 mg 組織蛋白酶L，純化倍數(shù)為2 130 倍。不同的純化結(jié)果與魚的種類有關(guān)[24]，此外使用的層析步驟越多，其純化倍數(shù)越高，回收率越低。綜上所述，本試驗(yàn)中采用的弱陰離子交換和分子篩兩步層析法純化倍數(shù)和回收率均較高且簡(jiǎn)單省時(shí)。

表2 鰱魚背肌組織蛋白酶L 純化結(jié)果表Table 2 Purification result of cathepsin L from silver carp dorsal muscle

2.4 組織蛋白酶L 的基本酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 由圖7可知，隨著反應(yīng)溫度增加，白鰱組織蛋白酶L 的活性先增加后急劇下降，其最適反應(yīng)溫度為55 ℃，與大部分研究報(bào)道的45～55 ℃結(jié)果吻合[11，13，25]。且組織蛋白酶L 的熱穩(wěn)定性隨溫度升高急劇下降，在50℃保溫1 h 時(shí)活性仍保留50%以上，而78 ℃下保溫1 h 后幾乎無活性，該結(jié)果表明組織蛋白酶L有一定的耐熱性。

圖7 組織蛋白酶L 的溫度-相對(duì)酶活曲線Fig.7 Temperature-relative enzyme activity curve of cathepsin L

2.4.2 最適反應(yīng)pH 值和pH 值穩(wěn)定性 由圖8可知，鰱魚組織蛋白酶L 的最適反應(yīng)pH 值為5～5.5。酸性條件下其活性有所保持，其中pH 3.0 時(shí)仍然保持了45%的活性。堿性條件下此酶的活性急劇下降，在pH 7.0 時(shí)仍有20%左右的活性，在pH 8.0 時(shí)幾乎失活，表明此酶是偏酸性蛋白酶。

2.4.3 底物專一性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù) 經(jīng)測(cè)定，白鰱的組織蛋白酶L 對(duì)其專一性熒光底物ZPhe-Arg-MCA 有較強(qiáng)的水解活性，對(duì)組織蛋白酶B 和組織蛋白酶H 的專一性熒光底物幾乎沒有水解活性，由其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線（圖9）和米氏方程雙倒數(shù)曲線（圖10）可知其最大反應(yīng)初速度達(dá)到130 U/mg，Km值為49 μmol/L。

圖9 組織蛋白酶L 水解Z-Phe-Arg-MCA 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.9 Kinetic curves of the hydrolysis of Z-Phe-Arg-MCA by cathepsin L

圖10 組織蛋白酶L 水解Z-Phe-Arg-MCA 的雙倒數(shù)曲線Fig.10 Double reciprocal curve of hydrolyzing Z-Phe-Arg-MCA by cathepsin L

3 結(jié)論

本研究對(duì)白鰱中組織蛋白酶L 的粗分離和純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，重點(diǎn)研究了初步提取過程中硫酸銨飽和度、酸處理?xiàng)l件和透析袋分子質(zhì)量對(duì)粗酶液中組織蛋白酶L 活性的影響，以及純化過程中不同類型離子交換層析柱和離子交換平衡緩沖液pH 值對(duì)蛋白層析純化結(jié)果的影響。結(jié)果表明，鹽析最佳硫酸銨飽和度范圍是55%～90%、酸處理最優(yōu)條件為pH 3.0，40 ℃熱處理10 min 后回調(diào)至pH 6.0、透析袋最佳分子質(zhì)量為7 000 u，以上試驗(yàn)條件可以最大限度回收目的蛋白。采用弱陰離子交換和分子篩兩步層析法，選取20 mmol/L、pH 6.0 磷酸鹽緩沖液作為弱陰離子柱的平衡緩沖液可得到45 ku 電泳純組織蛋白酶，其純化倍數(shù)為487，回收率為22 mg/1 000 g。兩步層析法較一步離子交換層析法純化倍數(shù)更高，較四步組合層析法回收率更高且簡(jiǎn)單省時(shí)。本法的建立為探究魚糜凝膠劣化現(xiàn)象的有效抑制方法奠定了良好的基礎(chǔ)。