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    文冠果葉提取物降血壓活性研究

    2022-04-12 03:29:08馬挺軍
    中國食品學報 2022年3期
    關鍵詞:降血壓文冠果灌胃

    王 亞,馬挺軍

    (北京農(nóng)學院食品科學與工程學院 北京 102206)

    文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)是無患子科文冠果屬植物,是中國特有的古老的木本油料樹木類型,有200 多年的種植歷史,又被稱作“北方油茶”,在我國內(nèi)蒙古、河南、甘肅、新疆等地區(qū)廣泛種植[1]。其葉片、果殼、果仁、種皮[2-5]均含有多種活性物質(zhì)。文冠果葉含楊梅苷、槲皮素、蘆丁、香豆素等活性物質(zhì),除此之外,文冠果葉中還含有皂苷類化合物,皂苷是一種存在于植物中的特殊苷類物質(zhì),在組成上由皂苷元和大部分以分子狀態(tài)存在的糖、糖醛酸等物質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)皂苷元組成可將皂苷分為三萜類皂苷和甾體類皂苷,而文冠果中多為三萜類皂苷[6]。研究表明,皂苷類化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血壓等活性[7-9]。

    高血壓是心血管疾病的重要因素之一。據(jù)2018年中國心血管疾病報告,中國有2.9 億心血管疾病患者[10]。慢性高血壓可導致心血管疾病,如心力衰竭、心臟病、中風、冠狀動脈疾病,以及其它疾病,如腎臟疾病、視力喪失、癡呆、抑郁等[11-12]。

    近年來,文冠果作為特種經(jīng)濟作物被廣泛研究。有研究表明文冠果具有治療阿爾茲海默癥、抑菌、抗癌等活性[13-15],然而,對于文冠果葉降血壓活性的研究報道較少。本文用文冠果葉正丁醇提取物做動物體內(nèi)試驗,期間檢測大鼠收縮壓、舒張壓、平均壓、心率、血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇等指標,探究文冠果葉正丁醇提取物對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR 大鼠)的影響,以及降血壓活性,為文冠果保健功能產(chǎn)品開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    1.1.1 試驗材料 文冠果葉,華清農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。用粉碎機粉碎,過60 目篩,備用。

    文冠果葉正丁醇提取物 (N-butanol extract from Xanthoceras sorbifolia leaves,X-NE),將2 g 文冠果葉加入10 mL 石油醚脫脂后用60%乙醇回流提取3 次得提取物,將提取物用水溶解,3 500 r/min 離心15 min 后取上清液用正丁醇萃取3次得到。

    蘆丁、沒食子酸、齊墩果酸標準品,中國食品藥品檢定研究院;香草醛、乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、亞硝酸鈉等均為分析純,西隴化工股份有限公司;福林酚試劑,美國Sigma 公司;碳酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、高氯酸等均為分析純,北京化工廠。氨氯地平,浙江新賽科藥業(yè)有限公司;羧甲基纖維素,國藥集團化學試劑有限公司。

    1.1.2 試驗儀器 KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;LabTech 紫外分光光度計UV9100D,北京萊伯泰科儀器有限公司;FW177 中草藥粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;7020 全自動生化分析儀,日本日立公司;BP2006A型智能無創(chuàng)血壓計,北京軟隆科技有限責任公司。

    1.2 實驗動物

    SPF 級大鼠(72 只,其中自發(fā)性高血壓SHR大鼠60 只,正常Wistar 大鼠12 只,平均質(zhì)量為200~240 g)均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2018-0002。試驗期間以鼠全價顆粒飼料飼養(yǎng),自由飲用無菌水,并適應性喂養(yǎng)5 d 后進行試驗。

    1.3 方法

    1.3.1 黃酮含量測定 取蘆丁標準品50 mg,用60%乙醇溶解并定容至50 mL。稱取5 mL 置于50 mL 容量瓶中,配制成0.1 mg/mL 的標準品儲備液。稱取上述標準液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL溶液于試管中,并添加60%乙醇至10.0 mL。依次加入5%的NaNO20.6 mL,靜置5 min,加入10%的AlCl30.6 mL,靜置6 min,加入4% NaOH 4 mL,混勻后添加60%乙醇至20 mL,靜置15 min后置于510 nm 吸光度下進行比色,測定其吸光值。以蘆丁含量為橫坐標,以吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。通過線性擬合得到回歸方程y=2.1633x-0.0161,R2=0.9993,式中,x 為文冠果葉黃酮含量(mg),y 為波長510 nm 處測定的吸光值。

    用粉碎機將文冠果葉粉碎成末,準確稱取2 g的文冠果葉粉。按1∶10(g/mL)的比例用石油醚將葉粉脫脂15 min,離心,取下層沉淀,將其吹干,用60%乙醇定容至50 mL。樣品測定時準確吸取溶液2 mL,添加60%乙醇至5 mL,剩余操作同上。

    1.3.2 酚酸的測定方法 取沒食子酸標準品10 mg,定容至100 mL,即配成0.1 mg/mL 的標準品儲備液,分別吸取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL 沒食子酸標準液,定容至6 mL,即得10,20,30,40,50 μg/mL 的標準液。吸取上述標準液0.4 mL,加入2 mol/L 福林酚試劑0.1 mL 和15%的Na2CO3溶液2 mL,用蒸餾水定容至8 mL。在25 ℃反應2 h,另吸取蒸餾水0.4 mL,同上操作。置于765 nm 吸光度下進行比色,測定其吸光值,以沒食子酸含量為橫坐標,以吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。通過線性擬合得到回歸方程y=0.0066x+0.0157,R2=0.9991,式中,x 為文冠果葉酚酸含量,y 為波長765 nm 處測定的吸光值。

    準確稱取2 g 文冠果葉粉,加入60 mL 的60%的乙醇溶液,在50 ℃條件下回流提取40 min,抽濾后,取膏體用乙醇溶解,定容50 mL,取0.4 mL,按照上述標準曲線方法進行測定。

    1.3.3 皂苷的測定方法[16]標準曲線按香草醛比色法操作。通過線性擬合得到回歸方程y=5.645x-0.233,R2=0.9994。式中,x 為大豆皂苷含量(mg),y為波長541 nm 處測定的吸光值。

    將文冠果葉正丁醇提取物按照上述標準曲線方法進行測定。

    1.3.4 X-NE 提取物降血壓活性試驗 雄性Wistar 大鼠12 只,測量其血壓值并做為空白對照組,雄性SHR 大鼠60 只,測量其血壓值,根據(jù)血壓隨機分為5 組,分別為陰性對照組、陽性對照組、XNE 高劑量組(2 g/kg)、X-NE 中劑量組(1 g/kg)、X-NE 低劑量組(0.5 g/kg)。于分組當天開始給藥,空白對照組和陰性對照組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素溶液,陽性對照組灌胃給予氨氯地平混懸液(5 mg/kg),X-NE 低、中、高劑量組分別灌胃給予X-NE,每天給藥1 次,連續(xù)給藥4 周,每周測量動物血壓1 次。

    試驗期間室內(nèi)通風狀況良好,控制溫度20~25 ℃,相對濕度40%~70%;每日12/12 h 交替照明;每小時換氣15 次以上。所有大鼠均喂飼鼠全價顆粒飼料及無菌水,自由攝取。每周測量動物收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)1 次,并計算其平均壓(mean blood pressure,MBP),于給藥結(jié)束當天動物眼眶靜脈叢采血、在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min,然后取上清凍存,檢測血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇含量。

    1.3.5 統(tǒng)計學處理 將試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件整理,結(jié)果以±s 表示。用SPSS 16.0 軟件分析試驗結(jié)果,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 表明具有統(tǒng)計學差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 文冠果葉提取物中黃酮、酚酸、皂苷含量分析

    由圖1可知,文冠果葉提取物中黃酮、酚酸的含量分別為3.84%,3.35%,皂苷含量相對較高,為5.3%。邱悅等[17]通過醇提法提取文冠果葉中的總皂苷,最優(yōu)條件下皂苷得率為4.952%,而本試驗提取物中皂苷含量更高,這可能是由于文冠果葉原料不同,通過回流提取后提取率更高。

    圖1 文冠果葉黃酮、酚酸及皂苷含量Fig.1 Contents of flavonoids,phenolic acids and saponins in Xanthoceras sorbifolia leaves

    2.2 灌胃4 周對大鼠血壓的影響

    由表1~表3可知,陰性對照組SHR 大鼠的血壓(SBP、DBP 和MBP)持續(xù)保持較高的水平,與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。與陰性對照組相比,陽性對照組(5 mg/kg)在給藥觀察期間能夠持續(xù)穩(wěn)定的降低動物的SBP、MBP,在1~4 周均具有極顯著差異(P<0.01),而DBP 在1~2 周具有極顯著差異(P<0.01),在3~4 周具有顯著差異(P<0.05)。這表明氨氯地平可以降低SHR 大鼠血壓,較好地控制血壓水平。氨氯地平是一種鈣通道阻滯劑,可以有效地降低血壓[17]。Mohd 等[19]通過對SHR 大鼠口服1 mg/kg 的氨氯地平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨氯地平治療可有效降低高血壓大鼠的SBP、DBP 和MBP,本試驗采取灌胃給藥,且氨氯地平質(zhì)量濃度較高(5 mg/kg),因此降壓效果更為明顯。

    X-NE 高劑量組收縮壓和平均壓在第4 周有下降趨勢且差異極顯著(P<0.01),而舒張壓在第3周有下降趨勢,在第4 周具有顯著差異(P<0.05)且達到最低(101.20±20.54)mmHg。X-NE 中劑量組收縮壓和平均壓在3、4 周均有極顯著差異(P<0.01),并逐漸趨于穩(wěn)定,舒張壓在第3 周有顯著差異(P<0.05),第4 周差異極顯著(P<0.01)。X-NE低劑量組SHR 大鼠收縮壓逐漸升高,但與陰性對照組相比在第4 周差異顯著(P<0.05),而舒張壓和平均壓均在第二周有所增加,隨后開始下降,降壓效果不穩(wěn)定,而且與X-NE 中高劑量組比較,降壓效果更差。曹敏等[20]通過口服給予SHR 大鼠三七花皂苷,發(fā)現(xiàn)其高、中、低劑量組[60 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)、15 mg/(kg·d)]大鼠的收縮壓、舒張壓均在第2 周后開始出現(xiàn)顯著降低。陳梅卿[21]通過腹腔注射人參皂苷Rb1 對SHR 大鼠作用12 周后,高、低劑量組【60 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)】血壓均較治療前明顯下降(低劑量降低7.91%,高劑量組降低19.25%),但較氨氯地平組 【5 mg/(kg·d)】(降低24.17%)差。這與本試驗的結(jié)果略有差異,由表1、表3可知,X-NE 高、中劑量組血壓下降且均高于陽性對照組,這是由于劑量的不同,并且X-NE 提取物中皂苷含量較高所導致。至今并未有研究表明文冠果葉的降血壓機理,而文冠果葉中皂苷含量高達5.3%,因此推斷可能是X-NE中的皂苷起到了降血壓作用。

    表1 灌胃4 周對SHR 大鼠收縮壓的影響Table 1 Effect of X-NE on systolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding

    表3 灌胃4 周對SHR 大鼠平均壓的影響Table 3 Effect of X-NE on mean blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding

    2.3 灌胃4 周對大鼠血清心率的影響

    表2 灌胃4 周對SHR 大鼠舒張壓的影響(±s,n=12)Table 2 Effect of X-NE on diastolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding (±s,n=12)

    表2 灌胃4 周對SHR 大鼠舒張壓的影響(±s,n=12)Table 2 Effect of X-NE on diastolic blood pressure of SHR rats after 4 weeks of feeding (±s,n=12)

    組別 舒張壓/mmHg第1 周 第2 周 第3 周 第4 周空白對照組 102.10±6.84 103.40±9.32 95.30±12.38 102.10±11.78陰性對照組 113.50±10.16△ 112.10±13.25 118.70±12.29△△ 118.80±10.34△△陽性對照組 94.10±16.09** 99.10±11.24** 106.15±10.15* 108.10±10.76*X-NE 高劑量 102.00±16.17 115.70±7.21 109.90±19.76 101.20±20.54*X-NE 中劑量 96.10±24.52 112.40±14.21 102.80±16.46* 97.60±11.02**X-NE 低劑量 110.80±14.57 117.00±23.03 107.10±30.59 105.10±14.51*

    心率被視為評價交感神經(jīng)活性的有效指標,交感神經(jīng)過度激活在高血壓的病程中發(fā)揮了重要作用[22],因此心率加快可能會加速高血壓的發(fā)生。

    由表4可知,以X-NE 灌胃大鼠4 周,與陰性對照組及空白對照組相比,陽性對照組及X-NE各劑量組的心率在試驗4 周內(nèi)均無顯著性差異(P>0.05),這表明X-NE 對大鼠心率并無顯著影響。

    表4 給藥4 周對SHR 大鼠心率的影響Table 4 Effect of X-NE on heart rate of SHR rats after 4 weeks of feeding

    2.4 灌胃4 周對大鼠血清ET-1、血清NO、血清甘油三脂和血清膽固醇含量的影響

    高血壓時血管剪應力的增加會使內(nèi)皮細胞內(nèi)Ca2+水平降低,導致NO 合酶活性降低,NO 的舒張血管效應減弱[23]。通過檢測血清中ET-1 和NO 的表達量可以簡單而有效的評估SHR 大鼠的血壓變化情況[24]。王禹程等[25]研究表明,通過升高NO含量或降低ET-1 含量可以起到降血壓作用。同時血脂增高時可以影響血管的外周阻力,使其增高,從而減弱血管壁的彈性,使血液的黏度增加,可形成或進一步加重高血壓疾病[26]。由表5可知,XNE 所有劑量組血脂TG 與陰性對照組比較均極顯著性降低(P<0.01),中劑量組最低,為(0.27±0.04)mmHg,同時中劑量組能夠顯著降低血清ET-1 水平和極顯著升高血清NO 水平,與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05,P<0.01)。

    表5 給藥4 周后對大鼠TG、CHO、ET-1 和NO 的影響Table 5 Effect of X-NE on TG,CHO,ET-1 and NO of SHR rats after 4 weeks of feeding

    3 結(jié)論

    文冠果葉中黃酮含量為3.84%,酚酸含量為3.35%,皂苷含量為5.3%。本研究通過正丁醇萃取得到文冠果葉提取物X-NE,并選取此提取物進行體內(nèi)實驗,灌胃4 周后,與陰性對照組相比,SHR 大鼠血壓顯著降低,低、中、高劑量組(0.5,1,2 g/kg)大鼠收縮壓、平均壓、舒張壓和血脂均顯著降低 (P<0.05);大鼠心率及CHO 無顯著性變化(P>0.05);中劑量組大鼠血清ET-1 顯著降低,NO含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明,文冠果葉提取物可以降低SHR 大鼠血壓,并且中劑量組還能顯著降低大鼠血脂與血清ET-1,升高血清NO 水平(P<0.05),明顯改善SHR 大鼠自身反應因子紊亂的狀況,因此中劑量組具有降血壓活性,推斷其降血壓活性物質(zhì)為皂苷,下一步將對文冠果葉提取物進行分離并闡明皂苷結(jié)構(gòu)與降血壓之間的關系。

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