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    麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎損傷的保護(hù)作用

    2022-04-12 03:29:08吳興泉廖愛(ài)美黃繼紅
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:亞硝酸鹽脂質(zhì)中毒

    趙 肅,潘 龍,吳興泉,廖愛(ài)美,黃繼紅,2*

    (1 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州 450001 2 許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院 河南許昌 461000 3 鄭州糧食批發(fā)市場(chǎng) 鄭州 450001)

    亞硝酸鹽是食品工業(yè)中常用的食品添加劑,在肉制品加工過(guò)程中起增味、著色和抑菌等作用[1]。此外,它被用作工業(yè)生產(chǎn)中亞硝基化合物、染料以及橡膠等化學(xué)產(chǎn)品[2]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,氮肥的大量使用、工業(yè)污水/廢水處理不當(dāng)以及食品中添加未加控制的亞硝酸鹽,導(dǎo)致人類(lèi)暴露于亞硝酸鹽的幾率大大增加。亞硝酸鹽在低濃度下對(duì)人體有良好的生理作用,它是一氧化氮合成的前體物質(zhì),用作血管擴(kuò)張劑、支氣管擴(kuò)張劑以及氰化物中毒的治療劑[3]。然而,高濃度亞硝酸鹽會(huì)產(chǎn)生毒性作用,包括細(xì)胞毒性、胚胎毒性和致畸性[4]。

    最近針對(duì)人類(lèi)飲食中的天然產(chǎn)物作為預(yù)防嚴(yán)重疾病的化學(xué)替代方法來(lái)減輕身體毒性成為研究熱點(diǎn)。Al-Brakati 等[5]研究表明黑種草籽油中的植物化學(xué)成分百里香醌和伊布硒能增強(qiáng)腎組織內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)活性,抑制亞硝酸鹽引起的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡,減少腎組織損傷。多酚提取天然產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和清除自由基。Cheng 等[6]研究表明,酚類(lèi)化合物綠原酸(chlorogenic acid,CGA)能夠降低大鼠體內(nèi)的高鐵血紅蛋白水平,避免亞硝酸鹽引起的細(xì)胞膜損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化以及氧化應(yīng)激。長(zhǎng)期口服5 mg/kg 大蒜油(garlic oil)能夠改善大鼠認(rèn)知功能,減輕亞硝酸鈉對(duì)大腦造成的神經(jīng)毒性損傷,其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[7]。此外,大蒜油還可以降低大鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransfease,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等肝、腎標(biāo)志物水平[8]。

    麥胚球蛋白(wheat-embryo globulin,WEG)是脫脂麥胚中提取的一種蛋白質(zhì),氨基酸比例均衡,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老等作用,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的蛋白質(zhì)資源[9-11]。到目前為止,國(guó)內(nèi)外研究主要集中于球蛋白營(yíng)養(yǎng)功能開(kāi)發(fā),而對(duì)于麥胚球蛋白預(yù)防亞硝酸鹽危害的關(guān)注較少。根據(jù)之前報(bào)道亞硝酸鹽中毒會(huì)引起腎損傷[12],本文以麥胚球蛋白為研究對(duì)象,探討麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠的預(yù)防功效,為麥胚球蛋白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 材料 麥胚球蛋白,以脫脂麥胚為原料,按鹽提法提取制備,由河南省科譜特醫(yī)藥科技研究院有限公司提供,其中麥胚球蛋白≥1%。

    亞硝酸鈉(分析純),天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;維生素C(食品級(jí)),石藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司;總蛋白定量測(cè)定試劑盒(BCA)、蛋白定量測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、過(guò)氧化氫(CAT)試劑盒、抗氧化能力(T-AOC)試劑盒,均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所;其它試劑均為分析純。

    1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)NO.41003100006969,許可證號(hào)SCXK 豫2017-0001),鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

    基礎(chǔ)飼料配方:水分≤100 g,組氨酸≥5.5 g,鐵≥120 mg,維生素B1≥13 mg,粗蛋白≥200 g,色氨酸≥2.5 g,錳≥75 mg,維生素B2≥12 mg,粗脂肪≥40 g,苯丙+酪氨酸≥13.0 g,銅≥10 mg,維生素B6≥12 mg,粗纖維≤50 g,蘇氨酸≥8.8 g,鋅≥30 mg,煙酸≥60 mg,粗灰分≤80 g,亮氨酸≥17.6 g,碘≥0.3 mg,泛酸≥24 mg,鈣10~13 g,異亮氨酸≥10.3 g,硒≥0.1~0.2 mg,葉酸≥6.00 mg,總磷6~12 g,纈氨酸≥11.7 g,維生素A≥14 000 IU,生物素≥0.2 mg,賴(lài)氨酸≥13.2 mg,鎂≥2.0 mg,維生素D≤1 500 IU,維生素B12≥0.022 mg,蛋+胱氨酸≥7.8 g,鉀≥5.0 g,維生素E ≥120 IU,膽堿≥1 250 mg,精氨酸≥11.0 g,鈉≥2.0 g,維生素K≥5.0 g;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;XHF-D 高速分散器,寧波新生物股份有限公司;LT1002E 電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;AU5800 全自動(dòng)生化分析儀,美國(guó)貝殼曼公司;Tecan Infinite pro 型號(hào)酶標(biāo)儀,瑞士帝肯有限公司;FMB-20 制冰機(jī),杭州聚同電子有限公司;Dk-98-II 電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;723N 可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 選取42 只體重(160~180 g)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,參照文獻(xiàn)[13],用隨機(jī)數(shù)字表法把大鼠分為空白組、模型組、麥胚球蛋白組(40 mg/kg)、麥胚球蛋白低劑量組(40 mg/kg)、麥胚球蛋白中劑量組(80 mg/kg)、麥胚球蛋白高劑量組(160 mg/kg) 以及維生素C組(80 mg/kg),每組6 只。末次給藥12 h 后,空白組和麥胚球蛋白組給予等體積的生理鹽水,其它各組按60 mg/kg NaNO2進(jìn)行灌胃,所有劑量都用去離子水配置。在最后一次治療24 h 后,用乙醚麻醉后處死大鼠。大鼠飼養(yǎng)于河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,整個(gè)試驗(yàn)期間,室溫控制在24~26 ℃,相對(duì)濕度為40%~70%,光暗周期為12 h,動(dòng)物在整個(gè)治療期間均可自由飲食和水。

    1.3.2 腎組織臟器系數(shù)測(cè)定 大鼠斷頸處死后立即解剖取出腎臟,用預(yù)冷生理鹽水清洗血液,濾紙吸干,稱(chēng)重并計(jì)算臟器系數(shù)。

    腎臟系數(shù)(%)=腎臟質(zhì)量(mg)/體重(g)×100

    1.3.3 血清生理生化指標(biāo)測(cè)定 將抗凝血3 000 r/min 離心10 min,分離血清,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

    1.3.4 腎組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定 腎組織當(dāng)中SOD、MDA、GSH、CAT、T-AOC 的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

    1.4 Caspase 3 和Caspase 8 活力測(cè)定

    取適量腎臟組織勻漿,其它均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

    1.5 腎組織病理學(xué)檢查

    大鼠處死后,迅速取腎組織置于4%多聚甲醛中固定,固定24 h 后用水沖洗,經(jīng)梯度乙醇脫水,二甲苯作透明劑,常規(guī)石蠟包埋處理后切成5 μm厚薄片,HE 染色,在×200 倍顯微鏡下觀察腎組織切片的形態(tài)變化。

    2 數(shù)據(jù)處理

    以上所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組試驗(yàn)保持3 個(gè)平行,采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素(One-Way ANOVA)方差分析。P<0.05表示具有顯著性差異。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽中毒大鼠腎質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響

    麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎質(zhì)量及腎系數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表1,與空白組相比,亞硝酸鹽急性中毒會(huì)引起模型組大鼠腎重和腎臟系數(shù)升高 (P<0.05),與之前報(bào)道一致[12]。經(jīng)麥胚球蛋白干預(yù)后,麥胚球蛋白各組腎重和腎臟系數(shù)分別降低(P<0.05)。此外,麥胚球蛋白各組大鼠腎相對(duì)質(zhì)量和腎系數(shù)均與空白組相比無(wú)顯著差異,說(shuō)明麥胚球蛋白可以減輕亞硝酸鹽引起的腎損傷。

    表1 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎質(zhì)量及腎系數(shù)的影響Table 1 Effects of WEG on kidney mass and their coefficients of rats

    3.2 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽中毒大鼠腎功能的的影響

    麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎功能指標(biāo)Cr 和BUN 的影響結(jié)果見(jiàn)圖1,與空白組相比,各麥胚球蛋白組以及維生素C 組中的BUN 和Cr 含量均未出現(xiàn)顯著差異。與模型組相比,BUN 和Cr 含量出現(xiàn)明顯降低,差異明顯(P<0.05),說(shuō)明麥胚球蛋白能夠維持大鼠正常腎功能。

    圖1 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎功的影響Fig.1 Effects of WEG on renal function of rats

    3.3 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟抗氧化能力的影響

    麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟抗氧能力影響如表2所示。與空白組相比,模型組大鼠腎臟中的SOD、CAT、T-AOC 和GSH 活性均低于空白組 (P<0.05);與模型組相比,補(bǔ)充麥胚球蛋白和維生素C 以后可以明顯改善亞硝酸鹽急性中毒腎組織SOD、CAT、T-AOC 和GSH 含量,差異性顯著(P<0.05),表明麥胚球蛋白可以清除體內(nèi)自由基,調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂,減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

    表2 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎組織抗氧化活性的影響Table 2 Effects of WEG on antioxidant activity of rats kidney

    3.4 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎組織中Caspase 3 和Caspase 8 的影響

    麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟Caspase 3 和Caspase 8 能力影響如表3所示。與空白組相比,模型組大鼠腎臟中Caspase 3 和Caspase 8 蛋白表達(dá)水平上升明顯(P<0.05);與模型組相比,補(bǔ)充麥胚球蛋白以及維生素C 以后Caspase 3 和Caspase 8蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),表明麥胚球蛋白可能抑制腎臟上皮細(xì)胞凋亡,對(duì)亞硝酸鹽引起的腎組織氧化應(yīng)激具有減緩作用。

    表3 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎組織中Caspase 3 和Caspase 8 的影響Table 3 Effects of WEG on Caspase 3 and Caspase 8 of rats kidney

    3.5 WEG 對(duì)大鼠腎組織的影響

    大鼠腎組織切片HE 染色效果如圖2所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織中的腎小管?chē)?yán)重壞死,腎小管擴(kuò)張,管型形成,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而相比于模型組,麥胚球蛋白各組以及維生素C 組中大鼠腎小管壞死、管型形成、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均得到明顯緩解。

    圖2 麥胚球蛋白對(duì)腎組織的影響(200×)Fig.2 The effect of WEG on the kidney (200×)

    4 討論與結(jié)論

    亞硝酸鹽作為食品添加劑用于維持或改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、味道和質(zhì)地,與胺反應(yīng)會(huì)生成亞硝胺和自由基,這些產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)人體器官造成損害。因此攝入一定量天然抗氧化劑可以預(yù)防器官炎癥損傷、控制相關(guān)疾病以及自由基的形成。本研究以麥胚球蛋白為研究對(duì)象,根據(jù)預(yù)設(shè)人均體重60 kg,每日應(yīng)攝入麥胚球蛋白40 mg/kg 的量,設(shè)置了3 個(gè)劑量,分別為40,80,160 mg/kg,進(jìn)行7 d喂養(yǎng)后進(jìn)行攻毒。亞硝酸鹽中毒劑量60 mg/kg 是參考以往文獻(xiàn)中毒劑量[12],此劑量會(huì)造成大鼠中毒,但是不會(huì)造成大鼠死亡,本試驗(yàn)也用此劑量進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)證明。在整個(gè)灌胃麥胚球蛋白期間,各組大鼠發(fā)育良好,背毛濃密有光澤,活動(dòng)正常、較活躍,均未出現(xiàn)死亡和異?,F(xiàn)象。本文通過(guò)對(duì)大鼠的腎功能、抗氧化指標(biāo)以及細(xì)胞凋亡因子含量測(cè)定,初步探討得到麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎損傷具有保護(hù)作用。

    血清BUN 是指血液中除蛋白質(zhì)以外的含氮化合物,是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物,主要通過(guò)腎小球排出體外,當(dāng)腎小球?yàn)V率下降到正常值50%時(shí),BUN 水平會(huì)迅速升高[14]。血清Cr 作為高能量化合物磷酸肌酸的分解物,由肌肉組織及神經(jīng)組織釋放至血液中,血液中的Cr 經(jīng)腎小球過(guò)濾后大部分不再被吸收,而是直接由尿液排出體外。血清中的Cr 濃度會(huì)因腎功能不全、尿毒癥等因素而上升,Cr 作為腎功能的檢測(cè)指標(biāo)在腎臟疾病的診斷及治療過(guò)程中具有重要意義[15]。所以血清BUN 和Cr 是臨床評(píng)價(jià)腎功能狀態(tài)的重要指標(biāo),當(dāng)腎功能受損時(shí),BUN 和Cr 數(shù)值會(huì)明顯升高。以上結(jié)果說(shuō)明,麥胚球蛋白能緩解亞硝酸鹽導(dǎo)致的腎功能損傷。

    當(dāng)亞硝酸鹽進(jìn)入機(jī)體時(shí),會(huì)在代謝活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生大量自由基,如超氧陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫等,造成機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化和一些重要酶類(lèi)的氧化,從而導(dǎo)致機(jī)體器官組織損傷。T-AOC是評(píng)估體內(nèi)各類(lèi)抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同作用,對(duì)包括酶體系與非酶體系在內(nèi)的整個(gè)氧化防御酶系統(tǒng)做出宏觀評(píng)價(jià)的一個(gè)重要參考指標(biāo)[16]??寡趸甘菣C(jī)體通過(guò)對(duì)氧化損傷防御的第一道防線(xiàn),其中SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,它具有特殊的生理活性,是清除自由基的主要酶[17]。SOD 可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化自由基造成的損傷,并修復(fù)自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。GSH 是一種廣泛存在于體內(nèi)的重要氧化物酶。GSH 的主要生物學(xué)功能是降低脂質(zhì)過(guò)氧化,迅速清除H2O2。CAT 是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的一部分,能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)椤H,使之分解為H2O 和氧氣[18]。MDA 是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物,是將脂質(zhì)過(guò)氧化活性氧轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)劑即非自由基質(zhì)分解產(chǎn)物,并通過(guò)鏈?zhǔn)交蛑ф湻磻?yīng)放大活性氧的氧化能力[19],通常能反映體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化以及細(xì)胞損傷程度。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組相比,模型組大鼠腎組織中的MDA 水平顯著升高,同時(shí)T-AOC、SOD、GSH 以及CAT 顯著降低(P<0.05),而經(jīng)麥胚球蛋白以及維生素C 干預(yù)后能顯著提高T-AOC、SOD、GSH 以及CAT 含量,且呈現(xiàn)一定程度劑量效應(yīng)的關(guān)系。以上試驗(yàn)結(jié)果表明麥胚球蛋白能夠提高機(jī)體抗氧化活力,清除氧自由基和預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化,降低氧化損傷程度。

    細(xì)胞凋亡是急性亞硝酸鹽腎功能損傷的重要機(jī)制,而Caspase 家族是控制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)平衡的重要基因家族[20]。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)加速細(xì)胞凋亡,Caspase 3 和Caspase 8 不管在細(xì)胞外還是細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中均扮演重要的角色,因此本試驗(yàn)研究選擇Caspase 3 和Caspase 8 作為重要的檢測(cè)指標(biāo)。Caspase 3 是細(xì)胞凋亡途徑的最終凋亡因子,進(jìn)而激活細(xì)胞蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),使細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)發(fā)生降解失去活性,引起細(xì)胞凋亡[21]。Caspase 8 作為凋亡啟動(dòng)因子,位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心地位,可在其它蛋白輔助下,發(fā)生自我活化,最終誘發(fā)凋亡[22]。試驗(yàn)結(jié)果表明亞硝酸鹽急性中毒時(shí)麥胚球蛋白治療各組中的腎組織Caspase 3 和Caspase 8 的表達(dá)明顯低于模型組。兩部分試驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了麥胚球蛋白預(yù)防后的腎組織的凋亡率明顯低于模型組,麥胚球蛋白預(yù)防亞硝酸鹽所致的急性腎損傷的機(jī)制與減少組織細(xì)胞的凋亡保護(hù)有效腎細(xì)胞具有重要關(guān)系。與此同時(shí),由病理切片可以看出,模型組大鼠腎組織中的腎小管?chē)?yán)重壞死,腎小管擴(kuò)張,管型形成,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而麥胚球蛋白以及維生素C 各組相比出現(xiàn)明顯改善,細(xì)胞腫脹減少,炎癥程度明顯減輕。病理切片與各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符合,進(jìn)一步說(shuō)明麥胚球蛋白在預(yù)防亞硝酸鹽對(duì)腎毒性損傷的可能性,為麥胚球蛋白的開(kāi)發(fā)提供新思路。

    綜上所述,亞硝酸鹽攝入會(huì)導(dǎo)致大鼠腎組織損傷,引起脂質(zhì)代謝紊亂,降低機(jī)體抗氧化能力,對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷。麥胚球蛋白能夠改善亞硝酸鹽造成的腎組織氧化應(yīng)激能力,提高抗氧化能力,從而對(duì)大鼠腎組織具有一定保護(hù)作用。

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