大黃浸膏的HPLC指紋圖譜研究

范 珊 趙新紅 張作華 齊永秀

山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）藥學院，山東泰安 271016

大黃浸膏是一種棕色至棕褐色粉末，將大黃通過回流提取、濃縮、干燥等步驟制備大黃浸膏，方法簡單，便于操作。大黃是目前臨床常用的中藥材，也是比較常見的草本植物，在我國分布較廣泛［1］，藥用價值較高。大黃具有調(diào)血脈，利關(guān)節(jié)，除痰濕，利大小腸的功效。目前對大黃的化學組成、含量測定以及藥理作用的研究都比較深入和廣泛。國內(nèi)外的研究表明蒽醌類、雙蒽酮類、芪苷類、鞣質(zhì)類化合物為大黃的主要成分。研究表明大黃的藥理作用主要與其所含的蒽醌類成分有關(guān)［2-3］。大黃中的有效成分具有較強的瀉下作用，并且會對離體小腸產(chǎn)生影響［4-6］，同時還可以發(fā)揮抗病毒、抑菌、抗炎等作用。因此，目前國內(nèi)外文獻對大黃及其制劑的研究主要以蒽醌類成分作為質(zhì)量控制指標［7-10］。大黃浸膏作為大黃藥材的制劑之一，多種成藥處方的組成成分都會使用大黃浸膏，因其作為提取物有效成分含量高于大黃藥材，在臨床上應(yīng)用非常廣泛。但是，目前國內(nèi)外對于大黃浸膏的研究較少，中國藥典對大黃浸膏的收載項目也較少，主要為含量測定和鑒別檢查，沒有完善的質(zhì)量標準。中藥指紋圖譜作為中藥應(yīng)用較為廣泛的質(zhì)量評價模式之一，因其能夠體現(xiàn)中藥成分的整體性，所以在評價中藥材的質(zhì)量時應(yīng)用廣泛［11-15］。為了完善對大黃浸膏的研究，本實驗采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）測定大黃浸膏指紋圖譜，結(jié)合相似度評價、聚類分析、主成分分析等方法進行分析［16］，并采用外標法測定其主要活性成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚）含量，為大黃浸膏的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，Waters 2998PDA 紫外檢測器，Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ-500E 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FR224CN型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 材料和試劑

色譜純甲醇為安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰井a(chǎn)品；分析純甲醇為天津市凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品；冰醋酸為天津市凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品；娃哈哈飲用純凈水為杭州娃哈哈集團有限公司產(chǎn)品。蘆薈大黃素（批號：T28D6F8264，純度：≥97%）、大黃素甲醚（批號：TAO421FA14，純度：≥98%）對照品（上海源葉生物科技有限公司）；大黃酸（批號：0757-200206）、大黃素（批號：110756-200110）對照品（中國藥品生物制品檢定所）；大黃酚（批號：09T18，純度：≥98%）對照品（西瑪實驗室）；大黃藥材購自藥店；大黃浸膏為實驗室自提，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo C18（4.9 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動相0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫（0 ~ 90 min，95% ~ 0% A）；流速1 mL/min；進樣量10μL；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 大黃浸膏粉的制備 取大黃，磨粉，取20 g大黃粉浸漬30 min，用75%乙醇回流提取2 次（200 mL，160 mL），每次1 h，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至稠膏狀，干燥，研細。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取大黃浸膏粉0.5 g，加入甲醇25 mL，超聲30 min，1 200 r/min 離心5 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素，大黃酚，蘆薈大黃素，大黃素甲醚，大黃酸適量于10 mL 量瓶中，配置成濃度分別為280，180，200，180，180μg/mL的對照品儲備液，4 ℃下保存。

2.3 指紋圖譜研究及方法學考察

2.3.1 精密度實驗 取S1號樣品，按“2.3”項下制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5 次，記錄色譜圖，以大黃酚為參考峰，計算共有峰相對保留時間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值均小于0.33%，相對峰面積的RSD值均小于4.6%，表明儀器的精密度良好。2.3.2 重復(fù)性實驗 取S1號樣品供試品溶液5份，進樣分析，記錄色譜圖，以大黃酚為參考峰，計算共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.45%，相對峰面積的RSD值均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取S1 號樣品的供試品溶液，按色譜條件，分別在0，3，6，9，24 h 進樣，記錄色譜圖，以大黃酚為參考峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD 值均小于2%，相對峰面積的RSD 值均小于4.6%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜的分析 分別精密稱取不同來源的大黃樣品各0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定其指紋圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入2009 版中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，經(jīng)多點校正后生成大黃浸膏指紋圖譜共有模式及對照指紋圖譜，見圖1 和圖2。其中10 批大黃浸膏有16 個共有峰。通過比較共有峰紫外吸收光譜和對比對照品保留時間的方法（圖3），確認1號峰為蘆薈大黃素，2號峰為大黃酸，3號峰為大黃素，4號峰為大黃酚，5號峰為大黃素甲醚。其中4號峰大黃酚的峰面積較大且較穩(wěn)定，故將其作為內(nèi)參比峰。10批大黃浸膏以4號峰作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果表明各批次樣品的相對保留時間RSD均小于1.3%，但相對峰面積RSD 21.10% ~ 221.67%范圍內(nèi)波動較大，表明不同批次間大黃浸膏的指紋圖譜相似度具有差異性。

圖1 10批大黃浸膏指紋圖譜共有模式

圖2 大黃浸膏的對照指紋圖譜

1. 蘆薈大黃素（aloe emodin）；2. 大黃酸（rhein）；3. 大黃素（emodin）；4. 大黃酚（chrysophanol）；5. 大黃素甲醚（physcion）

2.4 指紋圖譜評價

2.4.1 相似度評價 以對照指紋圖譜為參照，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2009版）軟件計算10批樣品的相似度（表2），將10批大黃浸膏指紋圖譜與對照圖譜進行相似度評價，結(jié)果顯示10批大黃浸膏指紋圖譜的相似度在0.691~0.984。

表2 10批大黃浸膏樣品相似度

2.4.2 聚類分析 將10批大黃浸膏指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25.0 軟件進行聚類分析得到樹狀圖，結(jié)果見圖4。由圖4 可見，10 批大黃浸膏大致可以劃分為兩類：S1，S2，S4，S5，S6，S7，S8，S9 為一類，S3，S10為一類。

圖4 10批大黃浸膏的聚類分析樹狀圖

2.4.3 主成分分析 以指紋圖譜共有峰面積為變量，運用SPSS 25.0 軟件對10 批大黃浸膏樣品進行主成分分析。結(jié)果表明主成分有2 個，其中第一主成分特征值為7.293，方差貢獻率為72.925%；第二主成分特征值為1.165，方差貢獻率為11.646%，方差累計貢獻率為84.571%。

2.5 外標法測定10批大黃浸膏指標成分含量

將10 批大黃浸膏樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密稱取適量對照品儲備液，制備混合對照品溶液，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液10 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣，采用外標法對供試品中5 種指標成分進行含量測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定（mg/g）

3 討 論

本實驗考察了甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸水，甲醇-0.2%磷酸水，甲醇-0.4%冰醋酸水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸等作為流動相進行梯度洗脫時的色譜圖，結(jié)果表明當甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時可以達到基線平穩(wěn)，分離度好且峰型良好，無拖尾。同時考察了相同洗脫條件下柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃下的色譜圖，結(jié)果表明30 ℃時色譜峰的峰型較好。同時比較了相同條件下254、280、329 nm 的色譜圖，結(jié)果表明檢測波長為280 nm 時色譜峰數(shù)量較多且分離度較好，最終確定本實驗所用色譜條件為甲醇-0.1%磷酸水，柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm。

本研究采用HPLC 法建立了10 批大黃浸膏的指紋圖譜，通過指紋圖譜相似度軟件共標定了16個共有峰，并且指認了其中5種主要活性成分，并結(jié)合相似度分析、聚類分析、主成分分析等方法更為準確和全面的對不同批次的大黃浸膏指紋圖譜進行了深入分析，通過外標法測定了大黃浸膏中5 種活性成分的含量，結(jié)果表明不同批次間大黃浸膏的成分存在一定的差異。通過分析可知，不同批次的大黃浸膏的提取手段是一致的，產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于大黃的產(chǎn)地或者栽培方式不同造成的，游離蒽醌成分是大黃清熱解毒、抑菌消炎的主要成分，因此通過指紋圖譜結(jié)合質(zhì)量分析可以選擇出不同蒽醌含量的藥材，對大黃浸膏的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，評價了藥材的批間差異，為不同批次大黃浸膏的質(zhì)量評價提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突