葉用萵苣LsMYB44基因的克隆及表達(dá)分析

趙盈盈，秦曉曉，韓瑩琰，郝敬虹，劉超杰，范雙喜

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

葉用萵苣富含礦質(zhì)元素、纖維素和生物活性物質(zhì)，如葉酸(維生素 B9)、β-胡蘿卜素、葉黃素和抗氧化物[1]，已成為最受歡迎的蔬菜之一，可用作沙拉配料或新鮮食用[2]。與綠葉生菜相比，紫葉生菜色澤鮮艷，花青素含量較高，具有抗氧化、抗心血管病、抗癌等保健功能，越來越受到市場(chǎng)青睞[3-5]。

光質(zhì)對(duì)植物的次生代謝物的生物合成和積累影響較大[6]，花色苷作為重要的次生代謝物，對(duì)人體具有保健功能。研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子參與黃酮類代謝途徑，影響植物色素的合成。在MYB家族中，R2R3MYB是最重要也是成員數(shù)最多，對(duì)黃酮類化合物合成影響最大的亞家族。近年來研究表明R2R3MYB的調(diào)控受外界因子，比如光的影響，來參與植物生長發(fā)育、代謝過程，響應(yīng)生物和非生物脅迫，并參與植物激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。例如，Hartmann[8]等發(fā)現(xiàn)CHS存在光響應(yīng)元件(Light regulatory unit,LRU),同時(shí)也在LRU序列中發(fā)現(xiàn)了MYB識(shí)別元件(MYB recognition element,MRE)，而R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠與包含MRE元件的結(jié)構(gòu)基因相互作用，這表明R2R3MYB參與了光介導(dǎo)的黃酮類物質(zhì)的合成，但具體作用尚不明確。調(diào)控花色苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子在果樹中研究較多,如草莓、蘋果、葡萄等[9-11]，但在蔬菜尤其是紫葉生菜中的功能機(jī)制仍不清楚。

前期課題組對(duì)白光、紅光和藍(lán)光處理下的北紫生4號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出30個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出在藍(lán)光處理下差異表達(dá)基因LsMYB44，克隆其全長，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量PCR，對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行分析，本研究為進(jìn)一步解析紫葉生菜在不同光質(zhì)下黃酮類化合物的合成機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

選用自主選育的品種北紫生4號(hào)(BZ-4)為試驗(yàn)材料。將種子催芽12 h后播種于穴盤中，放置于人工氣候室內(nèi)，白天溫度為22 ℃，晚上溫度為17 ℃，設(shè)定光強(qiáng)為270 μmol/m2/s,光照時(shí)間為14 h/d，相對(duì)濕度為70 %，長到3葉1心的時(shí)候定植。緩苗后放到HP600GS-3LED三色光植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行光質(zhì)處理，其中以白光為對(duì)照，分別給予紅光、藍(lán)光、以及在白光基礎(chǔ)上添加紅藍(lán)光比例為2∶1、1∶1、1∶2的處理，處理30 d后取樣，-80 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 使用北京華越洋生物科技有限公司RNA提取試劑盒提取葉用萵苣總RNA，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.2 葉用萵苣LsMYB44基因克隆以及qRT-PCR 以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的LsMYB44序列為模板，使用Primer5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物和克隆引物，選用葉用萵苣18s作為內(nèi)參基因(表1)。以葉用萵苣葉片cDNA為模板，對(duì)LsMYB44基因進(jìn)行克隆。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s；58 ℃ 15 s；72 ℃ 24 s;72 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，連接到北京全式金生物技術(shù)有限公司的Peasy?-Blunt Zero Cloning Vector載體上，并將其導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖菌液后進(jìn)行測(cè)序。以不同光質(zhì)處理的葉用萵苣葉片cDNA為模板，在Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量方法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS20進(jìn)行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 葉用萵苣LsMYB44序列的生物信息學(xué)分析 使用Prot Param分析LsMYB44蛋白質(zhì)的各項(xiàng)參數(shù)；通過NCBI CD-Search分析LsMYB44蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；使用軟件MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運(yùn)用SignalP 5.0進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；運(yùn)用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；利用Plant CARE軟件對(duì)LsMYB44基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用萵苣LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子克隆

利用RT-PCR方法，克隆了北紫生4號(hào)中MYB44轉(zhuǎn)錄因子的編碼區(qū)(圖1)，特異性擴(kuò)增片段顯示在750～1 000 bp之間，片段大小符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果與已知參考基因組MYB44基因的序列一致性為100%,此基因的編碼區(qū)長為807 bp。運(yùn)用NCBI ORFfinder 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該閱讀框編碼268個(gè)氨基酸，將該基因命名為LsMYB44。

注：1、2、3、4、5分別為紅光，藍(lán)光，在白光基礎(chǔ)上添加比例為2∶1，1∶1和1∶2的處理Note: 1,2,3,4,5 refer to red light,blue light and white light with the addition ratio of 2∶1,1∶1 and 1∶2 respectively圖1 葉用萵苣LsMYB44基因的克隆Fig.1 Cloning ofLsMYB44 gene

2.2 葉用萵苣LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

2.2.1LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析 通過NCBI在線工具Conservation Domain程序?qū)D(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生菜MYB44除了具有1個(gè)典型的MYB保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有2個(gè)SANT、1個(gè)PLN03212和REB1結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB家族成員(圖2)。

圖2 LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conserved domain of LsMYB44 TF

2.2.2LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白理化性質(zhì) 運(yùn)用ProtParam軟件對(duì)LsMYB44所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明LsMYB44蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為29 341.14 Da，理論等電點(diǎn)為8.37。所編碼的氨基酸中，絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸和谷氨酸的含量較多，分別為13.1%、 10.4%、7.8%、7.1%、7.1%，色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的含量較少，分別為1.9%、1.5%和0.7%，帶負(fù)電的殘基總數(shù)(Asp+Glu)26個(gè)，帶正電的殘基總數(shù)(Arg+Lys)28個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為60.19，為不穩(wěn)定蛋白。親水性平均值為-0.512，預(yù)測(cè)為親水性蛋白(圖3)。

圖3 LsMYB44蛋白的理化性質(zhì)Fig.3 Physical and chemical properties of LsMYB44 protein

2.2.3LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白信號(hào)肽分析、跨膜預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位 經(jīng)SignalP 5.0分析，該蛋白無信號(hào)肽。所編碼的氨基酸也不在跨膜區(qū)，說明LsMYB44蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于分泌蛋白(圖4)。使用Psort軟件預(yù)測(cè)LsMYB44蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞核。

圖4 LsMYB44蛋白的信號(hào)肽分析及跨膜預(yù)測(cè)Fig.4 Signal peptide analysis and transmembrane prediction of LsMYB44 protein

2.2.4LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示LsMYB44主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，含少量的β折疊。其中無規(guī)則卷曲有170個(gè)氨基酸，占63.43%；有69個(gè)氨基酸組成α螺旋，占25.75%；延伸鏈有23個(gè)氨基酸，占8.58%；β折疊有6個(gè)氨基酸，占2.24%。同時(shí)利用Swiss Model 軟件對(duì)LsMYB44進(jìn)行同源建模，推測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 LsMYB44蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of LsMYB44 protein

2.3 葉用萵苣LsMYBB44轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到的LsMYB44的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與洋薊(XM_025121970 )、向日葵(XM_022159869)、薇甘菊( KAD0377770.1)等植物中的MYB44具有同源性。利用MEGA

7.0軟件來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)葉用萵苣同洋薊的親緣關(guān)系最近，二者同為菊科屬植物，其次為向日葵。雷蒙德氏棉和木槿花為一類(圖6)。

圖6 LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic analysis of LsMYB44

2.4 葉用萵苣LsMYB44轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用Plant CARE軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的LsMYB44基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件預(yù)測(cè)分析，篩選保留有一定查看目的元件,發(fā)現(xiàn)了參與光反應(yīng)的GT1-motif、I-box元件，參與MeJA反應(yīng)的CGTCA-motif、TGACG-motif元件，參與生長素反應(yīng)的TGA-element、AuxRR-core元件以及參與低溫反應(yīng)的LTR元件等(表2)。結(jié)果表明LsMYB44與光響應(yīng)、逆境脅迫以及激素響應(yīng)等有關(guān)。

表2 LsMYB44基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis acting elements of LsMYB44 gene promoter

2.5 葉用萵苣LsMYB44基因表達(dá)分析

與對(duì)照組白光相比，單色光和復(fù)色光處理下LsMYB44基因的表達(dá)量均有所下降，但在藍(lán)光處理?xiàng)l件下下調(diào)了將近3倍(圖7)，而前期研究表明在藍(lán)光處理下花色苷化合物是明顯增加的，這表明不同光質(zhì)處理對(duì)LsMYB44基因的表達(dá)有影響，從而影響花色苷的合成，由此推測(cè)LsMYB44基因在不同光質(zhì)處理下葉用萵苣花色苷合成中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。

注：CK,RL,BL,R2B1L,R1B1L,R1B2L分別表示白光，紅光，藍(lán)光，紅光和藍(lán)光的比分別為2∶1,1∶1,1∶2Note:CK,RL,BL,R2B1L,R1B1L,R1B2L represent white light、red light、blue light、red light and blue：light is 2∶1，1∶1 and 1∶2 respectively圖7 LsMYB44基因在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)量分析Fig.7 Expression analysis of LsMYB44 gene under different light quality treatments

3 結(jié)論和討論

光質(zhì)對(duì)次生代謝物的產(chǎn)生具有重要影響，而次生代謝物的含量影響食物的品質(zhì)特性。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，研究表明MYB轉(zhuǎn)錄因子在苯丙烷類次生代謝過程中發(fā)揮著重要作用[12]。根據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子的MYB-DNA結(jié)合域的特點(diǎn)可分為1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB和4R-MYB四個(gè)亞族，而R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為數(shù)量最多的MYB家族之一，在調(diào)控次生代謝和逆境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[13-14]。MYB44是典型的R2R3-MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，具有保守的結(jié)構(gòu)基因，現(xiàn)研究表明，MYB44廣泛參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑、病蟲害防御、機(jī)械損傷和環(huán)境脅迫的響應(yīng)，具有重要的生物學(xué)意義[15]。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出MYB44基因，克隆得到cDNA序列807bp，編碼268個(gè)氨基酸，命名為LsMYB44。LsMYB44蛋白的相對(duì)分子量為29.341kDa，等電點(diǎn)為8.37，偏堿性。平均親水?dāng)?shù)-0.512，不穩(wěn)定系數(shù)為60.19，屬于不穩(wěn)定蛋白。具有1個(gè)典型的MYB保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有2個(gè)SANT、1個(gè)PLN03212和REB1結(jié)構(gòu)域。將LsMYB44的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與洋薊、向日葵、薇甘菊等植物中的MYB44具有同源性。對(duì)LsMYB44基因啟動(dòng)子上的順式作用元件分析表明與光響應(yīng)、激素和逆境脅迫有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，LsMYB44基因在藍(lán)光處理下明顯下調(diào)，而我們前期的研究表明藍(lán)光處理下紫葉生菜花色苷是明顯增加的。在馬鈴薯中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，高溫通過增強(qiáng)MYB44的表達(dá)顯著降低了塊莖花青素色素含量[16]。表明LsMYB44可能在不同光質(zhì)(包括藍(lán)光)處理下負(fù)調(diào)控紫葉花色苷的生成，但具體作用機(jī)制還有待研究。