人工加速老化法評(píng)價(jià)30份黃瓜種子的活力

王 婷，秦文韜，呂鵬輝，張震東，王 曄，段留生，李潤枝

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

黃瓜(CucumissativusL.)，又稱胡瓜，是葫蘆科一年生園藝蔬菜植物，分布于世界各地，也是中國溫室及大棚園藝蔬菜的主栽品種之一。隨著人們對(duì)黃瓜產(chǎn)量和質(zhì)量的需求逐漸增長，迫切需要能夠保持較高種子活力[1]的黃瓜種子。黃瓜種子隨著貯藏時(shí)間的增加，種子老化劣變的幾率和程度也隨之上升。

種子活力[2]相比其他指標(biāo)，更能準(zhǔn)確反應(yīng)黃瓜種子在實(shí)際應(yīng)用中的出苗情況[3]。種子活力大小影響幼苗的生長以及后期的結(jié)實(shí)率[4]。在加快種子發(fā)展速度的同時(shí)要控制好種子質(zhì)量的監(jiān)測[5]。

黃瓜種子的萌發(fā)喜溫，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致黃瓜種子內(nèi)有毒物質(zhì)積累量增加。黃瓜種子的自然成熟程度達(dá)到頂峰，種子活力也會(huì)出現(xiàn)不同程度、不可逆的自然衰退，導(dǎo)致種子發(fā)芽率下降，抗逆性變差，甚至發(fā)芽能力可能完全喪失。黃瓜種子的自然老化過程時(shí)間較長，且老化過程中環(huán)境影響因素不穩(wěn)定，試驗(yàn)誤差較大，實(shí)踐價(jià)值不高，因此常用人工加速老化法研究種子活力在老化過程中的變化規(guī)律[6]。人工加速老化法是通過研究種子構(gòu)造和生理生化反應(yīng)的變化得到試驗(yàn)結(jié)果[7]，是種子活力的常用檢驗(yàn)方法之一。種子在老化過程中會(huì)發(fā)生種子結(jié)構(gòu)和生理生化特性的改變。

人工加速老化的方法能夠較好與自然老化的結(jié)果相吻合，目前主要應(yīng)用在玉米[8]、水稻[9]、小麥[10]等多種糧食作物上，對(duì)于黃瓜等經(jīng)濟(jì)作物的研究還鮮有報(bào)道。就此對(duì)30份黃瓜品種進(jìn)行人工老化試驗(yàn)，為人工加速老化法檢驗(yàn)黃瓜種子活力的應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為黃瓜耐老化品種的篩選與高活力種子的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料由天津綠豐種業(yè)有限公司提供。人工加速老化條件篩選試驗(yàn)材料為3個(gè)黃瓜種批，編號(hào)為Lot1、Lot2、Lot3；人工加速老化發(fā)芽試驗(yàn)材料為30個(gè)黃瓜品種，其含水量約為8%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 處理時(shí)間的篩選 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)選擇溫度為45 ℃、相對(duì)濕度為75%是黃瓜種子老化處理的適宜條件。在玻璃干燥器內(nèi)加入1 L預(yù)先配制的NaCl飽和鹽溶液，將裝有種子的老化盒置于干燥器的隔板上，在玻璃干燥器的磨口邊緣均勻涂上凡士林，然后放置于烘箱內(nèi)，設(shè)置溫度45 ℃，分別老化2、4、6、8、10、12及14 d，未處理的種子為對(duì)照。處理結(jié)束后，取出種子樣品，薄攤，放在室溫下自然風(fēng)干7 d后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，發(fā)芽條件同發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn) 參照紙上發(fā)芽法。從成熟種子中選取飽滿、大小均一的種子，在1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒30 min，去離子水沖洗2～3次，擦去種子的表面水分，均勻擺放在鋪有2層濕潤濾紙的發(fā)芽盒中(19 cm×13 cm×12 cm)，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中放置50粒，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行25 ℃、24 h全光照培養(yǎng)。種子置床之后每24 h觀察1次，以黃瓜種子胚根突破種皮2 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，記錄發(fā)芽粒數(shù)，并補(bǔ)充適量去離子水以保證濾紙濕潤，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.3 測定項(xiàng)目

發(fā)芽勢GE(%)=第2天發(fā)芽數(shù)/50×100 %；發(fā)芽率GP(%)=7天總發(fā)芽數(shù)/50×100 %；發(fā)芽指數(shù)GI=∑ (Gt/Dt)。

平均發(fā)芽時(shí)間MGT=∑(Gt·Dt)/∑Gt。式中：Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt為與Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)。

萌發(fā)指標(biāo)的相對(duì)值：

相對(duì)發(fā)芽勢RGE=人工加速老化發(fā)芽勢/對(duì)照發(fā)芽勢×100 %；相對(duì)發(fā)芽率RGP=人工加速老化發(fā)芽率/對(duì)照發(fā)芽率×100 %。

相對(duì)發(fā)芽指數(shù)RGI=人工加速老化發(fā)芽指數(shù)/對(duì)照發(fā)芽指數(shù)；相對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間RMGT(倍)=人工加速老化相對(duì)發(fā)芽天數(shù)/對(duì)照種子發(fā)芽天數(shù)。

1.4 模糊隸屬函數(shù)法

根據(jù)《試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析》進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

μ(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)

(1)

μ(Xi)=(Ximax-Xj)/(Ximax-Ximin)

(2)

式中：Xi為各黃瓜品種中相應(yīng)鑒定指標(biāo)(i)的相對(duì)值，μ(Xi)為各品種鑒定指標(biāo)Xi的隸屬函數(shù)值，Ximax，Ximin分別為30個(gè)黃瓜品種中各指標(biāo)相對(duì)值(Xi)的最大值和最小值。正相關(guān)用公式1，負(fù)相關(guān)用公式2。

平均隸屬函數(shù)值：Xi=∑Xij/n

將各隸屬函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，取平均值，按照均值大小排序，對(duì)30個(gè)黃瓜品種的抗老化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；通過SPSS 23.0對(duì)隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜種子人工加速老化時(shí)間的確定

由圖1可知，隨著人工加速老化處理時(shí)間的延長， Lot1、Lot2、Lot3黃瓜種子的發(fā)芽率均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，說明在高溫高濕條件下，黃瓜種子的老化劣變程度會(huì)隨著處理時(shí)間加深。當(dāng)老化時(shí)間到第10 天時(shí)，與未經(jīng)過老化處理的種子相比，其發(fā)芽率分別由100 %、95 %和82 %下降到80%、70 %和40 %，發(fā)芽率的下降幅度在種批之間差異較大。即黃瓜種子在人工加速老化條件為45 ℃、75%RH、10 d時(shí)，可以更好體現(xiàn)出黃瓜種子不同品種間的抗老化能力。

圖1 老化時(shí)間對(duì)黃瓜種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of aging time on germination percentage of cucumber seeds

2.2 老化處理對(duì)30份黃瓜品種種子萌發(fā)的影響

根據(jù)表1可知，30個(gè)黃瓜品種(LF 1-30)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，發(fā)芽率變化范圍在92%～100%，平均發(fā)芽時(shí)間平均在2～3 d，差異幅度較小，無法判斷不同品種黃瓜種子間的活力差異。

由表1可以看出，30個(gè)不同品種黃瓜種子的萌發(fā)明顯受到人工加速老化處理的影響，相對(duì)發(fā)芽率的變化范圍在50～105，平均發(fā)芽時(shí)間相比對(duì)照有明顯延長，方差分析結(jié)果表明經(jīng)過老化處理后，不同品種的黃瓜種子間活力存在顯著差異。因此，通過人工加速老化試驗(yàn)，可以體現(xiàn)出30個(gè)不同品種黃瓜種子的耐老化能力及種子活力的差異性。

表1 30個(gè)黃瓜品種標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)萌發(fā)指標(biāo)和人工老化相對(duì)萌發(fā)指標(biāo)Tab.1 Germination indicators of 30 cucumber varieties in standard germination test and relative germination indicators of artificial aging

2.3 30個(gè)黃瓜品種耐老化能力的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

由表2可得，30個(gè)品種的黃瓜種子D值的范圍為0.114～0.910。其中，相較于其他材料，LF-23的耐老化能力最強(qiáng)，D值為0.910；LF-15的耐老化能力最弱，D值為0.144。

表2 30個(gè)黃瓜品種在人工老化處理下各發(fā)芽指標(biāo)隸屬函數(shù)值Tab.2 Membership function value of each germination indicator of 30 cucumber varieties under artificial aging treatment

2.4 30個(gè)黃瓜品種聚類分析結(jié)果

為了明確30個(gè)不同品種黃瓜種子耐老化能力的高低，將黃瓜種子按照D值降序排序，采用組間連接的方式、以平方Euclidean度量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)黃瓜材料數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。如圖2所示，以6為切割點(diǎn)，將30個(gè)黃瓜材料劃分耐老化品種、中度耐老化品種和老化敏感品種為3類，其中，耐老化品種包括LF-23、LF-30、LF-21、LF-10、LF-3、LF-26、LF-24、LF-22、LF-4、LF-28、LF-29、LF-12、LF-20、LF-27、LF-8、LF-2、LF-5、LF-7，D值在范圍在0.608～0.910，共18個(gè)材料；中度耐老化品種包括LF-9、LF-14、LF-16、LF-25，D值在范圍在0.468～0.556，共4個(gè)材料；老化敏感品種包括F-19、LF-17、LF-18、LF-1、LF-13、LF-11、LF-6、LF-15，D值在范圍在0.114～0.390，共8個(gè)材料。

圖2 30個(gè)黃瓜品種聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 30 cucumber varieties

3 討論和結(jié)論

選用具有明顯生長優(yōu)勢和較大生產(chǎn)潛力的高活力種子是作物種子田間育苗成功的關(guān)鍵。因此在生產(chǎn)之前，是否能夠準(zhǔn)確且迅速地測定種子活力決定了種子在田間種植時(shí)的發(fā)芽率和種苗健壯程度[11]。種子貯藏過程中，由于種子進(jìn)行呼吸作用，其內(nèi)部會(huì)積存熱量和水分，且會(huì)向外界持續(xù)散發(fā)。若貯藏的種子數(shù)量過多，貯藏空間內(nèi)的通風(fēng)條件差，就會(huì)導(dǎo)致種子散發(fā)的熱量和水分無法及時(shí)排出，進(jìn)一步加劇種子熱量的散發(fā)。這樣的環(huán)境會(huì)加速種子老化劣變，對(duì)后續(xù)的生產(chǎn)造成很大影響。人工加速老化法是測定種子活力的有效方法之一，前人在多種作物中的研究表明，種子經(jīng)過高溫高濕條件下的人工加速老化處理后，其活力顯著降低，且隨老化時(shí)間的增加，種子活力逐漸降低甚至失去發(fā)芽能力[12]。鄭單958和先玉335在50 ℃、RH 95%的人工加速老化條件下處理8 d后，發(fā)芽率下降到0[13]；甜玉米甜農(nóng)88和甜農(nóng)99在41 ℃、相對(duì)濕度90%條件下老化處理6 d，發(fā)芽率在80%以上[14]；小麥在高溫高濕的條件下處理9 d后也能保持較高的發(fā)芽率和根系活力[15]。不同的種子由于其原始含水量、相關(guān)作用酶及有關(guān)基因組的不同，在不同的環(huán)境條件下生長、發(fā)育、收獲、貯藏，對(duì)人工加速老化處理的響應(yīng)程度也不同[16]。

前人研究表明[17]，種子一般在老化5～7 d后，發(fā)芽率等萌發(fā)指標(biāo)明顯降低，種子活力降低，在預(yù)試驗(yàn)中，篩選黃瓜種子的適宜老化處理?xiàng)l件時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著老化時(shí)間的延長，種子活力降低程度逐漸增加，老化處理10 d，能夠較好地反映老化處理對(duì)黃瓜種子活力的影響，與前人研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，經(jīng)過人工加速老化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子的發(fā)芽率顯著降低，種子活力降低。此試驗(yàn)為人工加速老化法測定種子活力在黃瓜種子生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

模糊隸屬函數(shù)法反映評(píng)價(jià)指標(biāo)，在評(píng)價(jià)植物抗逆性時(shí)廣泛使用[18]，并且采用隸屬函數(shù)法對(duì)作物進(jìn)行評(píng)價(jià)，優(yōu)于單一指標(biāo)評(píng)價(jià)法，能夠全面反映作物的抗逆能力。本試驗(yàn)通過篩選出的人工加速老化條件，對(duì)30個(gè)黃瓜品種進(jìn)行種子活力測定，并運(yùn)用模糊隸屬函數(shù)法，對(duì)30個(gè)黃瓜品種進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LF-23的隸屬函數(shù)值最大(0.910)，LF-15的隸屬函數(shù)值最小(0.114)。同時(shí)對(duì)30個(gè)黃瓜品種進(jìn)行聚類分析，與蘆露等[19]用聚類分析法篩選出6個(gè)華北型黃瓜強(qiáng)耐冷性品種的方法一致。將供試的黃瓜種子進(jìn)行聚類分析，根據(jù)耐老化程度分為三類，分別為耐老化品種、中度耐老化品種和老化敏感品種。本試驗(yàn)結(jié)果可為黃瓜耐老化品種的篩選與高活力種子的培育選擇提供理論依據(jù)，為利用人工加速老化法檢測黃瓜種子活力的條件和適用性提供參考。

通常，種子加工貯藏過程中，由于貯藏時(shí)間不同，種子會(huì)發(fā)生不同程度的老化劣變。引發(fā)種子發(fā)生老化的原因主要分為兩類，外在因素主要包括環(huán)境溫度、環(huán)境濕度、環(huán)境中的氧氣以及部分微生物，內(nèi)在因素主要包括種子的內(nèi)在生理結(jié)構(gòu)、種子的遺傳物質(zhì)、種子內(nèi)相關(guān)酶的種類和含量。當(dāng)種子的貯藏外界條件一致時(shí)，不同種子生理上的差異和相關(guān)基因的表達(dá)是影響種子的老化程度和造成種子間老化差異的主要原因[20]。目前對(duì)于種子老化的機(jī)理和如何提高老化種子的種子活力等方面還沒有深入研究和討論，需要通過后續(xù)對(duì)于生理生化方面的試驗(yàn)或者進(jìn)行相關(guān)基因調(diào)控的試驗(yàn)，研究種子老化過程中參與代謝的內(nèi)部物質(zhì)、酶的相互轉(zhuǎn)化作用以及基因的調(diào)控，從而培育耐老化能力更強(qiáng)的品種，延長種子貯藏年限，最大程度上保證農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，達(dá)到節(jié)約種質(zhì)資源的目的。