保健品中添加化學降糖藥物的檢測分析

曹揚蘭，林柏林，馮慧萍

(1 湖北省鐘祥市人民醫(yī)院骨科，湖北 鐘祥 431900；2 廣東藥科大學藥學院分析化學教研室，廣東 廣州 510006)

保健食品是適用于特定人群食用，能調節(jié)人體的機能，但不以治療疾病為目的[1]，有些違法商家在保健食品中添加微量的化學合成藥物，但在說明書上并沒有標明所添加化學藥成分的種類、劑量及不良作用，長期服用此類產品會引起嚴重的健康隱患[2]。

保健品中添加化學藥的主要有降壓藥，降糖藥，感冒藥等。常見口服降糖藥有磺酰脲類，二甲雙胍類，α-葡萄糖苷酶抑制劑，胰島素增敏劑，餐時血糖調節(jié)劑，醛糖還原酶抑制藥等。目前保健品中添加的降糖藥物主要是磺酰脲類和雙胍類藥物；這兩類藥物的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜二極管陣列紫外光譜及其光譜純度鑒別法[3-5]和近紅外光譜法[6]等，高效液相色譜-質譜聯用法等[7-12]。舒寧膠囊是市售保健品，本文建立了薄層色譜和高效液相色譜法檢測該保健品中添加的磺酰脲類和雙胍類藥物成分。

1 試劑和方法

1.1 試劑和儀器

GF254硅膠粉末，青島海洋化工廠；羧甲基纖維素鈉粉末，青島海洋化工廠；舒寧膠囊(生產批號：080420)，烏魯木齊康福源生物技術開發(fā)有限公司；格列苯脲對照品(批號：100135-200404)，中國藥品生物制品檢定所；鹽酸二甲雙胍標準對照品(批號：100664-200602)，中國藥品生物制品檢定所；氯仿，環(huán)己烷，乙醇，冰醋酸，碘化鉍鉀，色譜純乙腈，德國默克公司；色譜純甲醇，德國默克公司；乙酸，三水合乙酸鈉，超純水，正丁醇，鐵氰化鈉，亞硝基鐵氰化鉀，氫氧化鈉。

5×15玻璃板，展開缸，紫外燈，遠紅外干燥器，恒溫水浴鍋，日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp溶劑輸送泵、SPD-10Avp紫外檢測器)。

1.2 格列苯脲和二甲雙胍薄層色譜定性分析

(1)精密稱取格列苯脲對照品1 mg和二甲雙胍對照品 1 mg，分別置于1 mL容量瓶中，加入二氯甲烷溶解定容搖勻即得。

(2)取舒寧膠囊10粒內容物，研細，精密稱取粉末1 g置50 mL具塞錐形瓶中，加水20 mL，超聲30 min，過濾，濾液水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解過濾，濾液取濾液0.2 mL甲醇稀釋至2 mL為二甲雙胍定性檢測的樣品溶液1。藥材濾渣加CH2Cl220 mL，超聲30 min，過濾，濾液作為格列苯脲定性檢測的樣品溶液2。

(3)按照膠囊處方各取藥材10 g加水500 mL超聲30 min，取續(xù)濾液10 mL水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解過濾，取濾液0.2 mL甲醇稀釋至2 mL為二甲雙胍定性檢測的陰性對照溶液1。藥材濾渣加CH2Cl220 mL，超聲30 min，過濾，濾液為格列苯脲定性檢測的陰性對照溶液2。

1.3 格列苯脲和二甲雙胍定量分析

1.3.1 高效液相色譜條件

格列苯脲 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相乙腈：0.04 mol/L乙酸乙酸鈉緩沖液=62∶38，流速1 mL/min，檢測波長300 nm，進樣量20 μL。

二甲雙胍 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相甲醇：0.05 mol/L磷酸二氫胺(含0.025%十二烷基磺酸鈉)=50∶50，流速1 mL/min，檢測波長230 nm，進樣量20 μL。

1.3.2 標準溶液和樣品的配制

1.3.2.1 格列苯脲標準品溶液

精密稱量格列苯脲2 mg，于10 mL容量瓶中加入甲醇溶解至刻度，得儲備液。準確量取儲備液2～10 mL容量瓶中用格列苯脲定量分析項下流動相稀釋至刻度，得格列苯脲對照品溶液。

1.3.2.2 二甲雙胍對照品溶液

取二甲雙胍對照品1 mg置于1 mL容量瓶中，加入二甲雙胍定量分析項下流動相稀釋至刻度，得二甲雙胍對照品溶液。

1.3.2.3 樣品溶液制備

取舒寧膠囊10粒，取內容物，研細，準確稱取粉末1 g置50 mL具塞錐形瓶中，加水20 mL，超聲30 min，過濾，濾液水浴蒸干，加入甲醇20 mL溶解，精密量取續(xù)濾液0.5～10 mL容量瓶中，加二甲雙胍定量分析項下流動相定容混勻，再精密量取濾液1～25 mL容量瓶中，加流動相定容混勻，微孔濾膜過濾，制備樣品溶液1。濾渣烘干，粉末加CH2Cl220.00 mL，超聲30 min，過濾，濾液用格列苯脲高效液相色譜流動相稀釋 5倍，微孔濾膜過濾得樣品溶液2。

1.3.2.4 陰性對照溶液

取按照膠囊處方各取藥材10 g加水500 mL超聲30 min，過濾，濾液水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解，過濾，取濾液 0.5～10 mL容量瓶中，加二甲雙胍定量分析項下流動相定容混勻，得陰性樣品1。濾渣烘干加入CH2Cl2200 mL，超聲 30 min過濾，取續(xù)濾液10 mL于水浴鍋上蒸干，加入格列苯脲高效液相色譜流動相10 mL溶解微孔濾膜過濾，得陰性對照液2。

2 結果與討論

2.1 格列苯脲薄層色譜定性分析

分別取陰性對照溶液2、樣品溶液2及格列苯脲對照品溶液10 μL、格列吡嗪對照品溶液10 μL和格列齊特對照品溶液10 μL點于硅膠GF254板上，在展開劑氯仿∶環(huán)己烷∶乙醇∶冰醋酸=4∶12∶1∶1中展開40 min，取出薄層色譜板，晾干，置紫外燈下檢測，格列苯脲對照品及樣品在相同Rf值均呈暗紫色斑點(見圖1a)，陰性對照溶液在相應位置無暗斑。薄層板噴顯色劑碘化鉍鉀冰醋酸溶液顯色，格列苯脲對照品及樣品在相同Rf值均顯橙紅色斑點(見圖2b)，陰性對照溶液在相應位置無斑點。常用磺酰脲類藥物有格列苯脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮等，樣品GF254薄層板紫外燈檢測，有2個暗紫色斑點，但顯色劑顯色只有格列齊特的斑點?？梢?，舒寧膠囊中添加了格列苯脲成分。

圖1 樣品中格列苯脲FLC鑒別圖

2.2 二甲雙胍薄層色譜定性分析

分別取陰性對照品溶液1、樣品溶液1及二甲雙胍對照品10 μL、苯乙雙胍對照品溶液10 μL點樣于硅膠GF254薄層板，在展開劑正丁醇∶冰醋酸∶蒸餾水(5∶1∶1)中展開40 min，取出薄層色譜板，晾干，置紫外燈下檢測，對照品及樣品均顯暗紫色斑點(見圖2a)，陰性對照溶液無斑點。后噴顯色劑10%NaOH：10%鐵氰化鈉：亞硝基鐵氰化鉀=1∶1∶1，對照品及樣品均出現橙紅色斑點(見圖2b)，陰性對照溶液沒有斑點。常用雙胍類藥物有二甲雙胍和苯乙雙胍，樣品GF254薄層板紫外燈檢測有3個暗紫色斑點，但顯色劑顯色只有二甲雙胍的斑點?？梢?，舒寧膠囊中添加了二甲雙胍成分。

圖2 樣品中二甲雙胍薄層色譜鑒別圖

2.3 格列苯脲和二甲雙胍定量分析的方法學驗證

2.3.1 專屬性，精密度考察

取取1.3.2.1項下、1.3.2.3項下和1.3.2.4項下溶液稀釋10倍，進樣，分別得到格列苯脲對照品溶液色譜圖(圖3b)；樣品溶液1色譜圖(圖3a)；陰性對照液1色譜圖(圖3c)。比較色譜圖，tR=8.5 min時，格列苯脲對照品溶液和樣品溶液有色譜峰，陰性對照溶液無?？梢姡松V條件專屬性強。

圖3 格列苯脲(a)對照品，樣品溶液2(b)和陰性對照溶液2(c)的HPLC圖

取1.3.2.2項下二甲雙胍對照品溶液進樣，得色譜圖 (圖4a)；取1.3.3.3項下樣品溶液2進樣，得色譜圖(圖4b)；取1.3.2.4項下陰性對照液2進樣，得色譜圖(圖4c)。比較色譜圖，樣品溶液和二甲雙胍對照品溶液在tR=4.8 min有色譜峰，但陰性對照溶液無，可見此色譜條件專屬性強件專屬性強。

圖4 二甲雙胍對照品(a),樣品溶液2(b)和陰性對照品溶液2(c)的HPLC圖

取上述對照品溶液連續(xù)進樣6針，格列苯脲峰面積RSD值為1%；二甲雙胍峰面積RSD為1.4%；均符合高效液相色譜法方法學精密度要求。

2.3.2 線性關系考察

(1)依照1.3.2項下方法，準確配制4.00，8.00，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0 μg/mL格列苯脲標準溶液，分別進樣，測定峰面積A，以A對C進行線性回歸，格列苯脲線性方程為A=12558C+2793.6，r=0.9999。

(2)依照1.3.2項下方法，準確配制5.00，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0，45.0，50.0 μg/mL二甲雙胍對照品溶液，分別進樣，得到峰面積A，以A對C進行線性回歸，二甲雙胍線性方程為A=94325C+6015.4，r值為0.9999。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取樣品溶液稀釋10倍，于0，2，4，6，8，10小時各進樣1針，計算格列苯脲RSD值為1.3%；二甲雙胍RSD為1.5%。均符合高效液相色譜法方法學穩(wěn)定性要求。

2.3.4 重復性實驗

依照取1.3.2.3項下方法制備樣品溶液1和樣品溶液2各6份，均稀釋10倍，分別進樣，樣品中格列苯脲重復性結果RSD為1.1%；二甲雙胍樣品重復性結果RSD為1.3%。均符合高效液相色譜法重復性驗證要求。

2.3.5 樣品含量測定

取1.3.2.3項下制備樣品溶液1和樣品溶液2，分別進樣，得平均峰面積，代入格列苯脲和二甲雙胍標準曲線中，計算格列苯脲濃度為8.59 μg/mL，樣品中添加的格列苯脲含量為1.80 mg/g。計算二甲雙胍濃度為16.0 μg/mL，樣品中添加二甲雙胍含量為60.0 mg/g。

2.3.6 加樣回收率

分別向已知格列苯脲和二甲雙胍含量的供試品中加入各自含量的80%，100%，120%對照品，進樣，測得峰面積，計算被測成分含量，用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。加樣回收率實驗結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

3 結 論

本文建立了薄層色譜鑒別法與高效液相色譜含量測定法快速有效的檢測保健品舒寧膠囊中違法添加的降糖藥格列苯脲和二甲雙胍，該方法簡便、準確可靠,可為相關部門檢測保健品中非法添加降糖藥物提供技術依據。