規(guī)?；i場3種主要疫病抗體檢測結(jié)果分析

周宏超，賈 佩，連 星，張 琪，郭抗抗，許信剛，吳晨晨

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西正能農(nóng)牧科技有限責任公司，陜西高陵 710201)

國內(nèi)發(fā)生非洲豬瘟(African swine fever，ASF)以來，豬場的生物安全體系不斷改造升級，在實驗室準確檢測的前提下，豬場的生產(chǎn)工作得以正常開展。由于聯(lián)防聯(lián)控等各項政策限制豬只異地調(diào)運，導致豬源緊缺，入群后備母豬來源復(fù)雜，混群后疫病感染壓力大，疫病依然是影響豬場生產(chǎn)成績的主要因素。除非洲豬瘟以外，豬瘟(Classical swine fever,CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)和豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)仍是危害豬的健康、制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病毒性疾病[1-4]。病毒性傳染病要從減少傳染源、切斷傳播途徑及保護易感動物三管齊下來綜合防控。疫苗免疫是保護易感動物最直接有效的手段，而免疫抗體檢測是評價疫苗免疫效果的常用指標[5]。為了解非洲豬瘟背景下，豬群重大疫病的免疫和感染情況，及時發(fā)現(xiàn)疫病防控風險，更好的指導一線養(yǎng)豬生產(chǎn)活動，本文對陜西地區(qū)某公司規(guī)?；i場進行了CSF、PRRS和PR抗體檢測與分析，為豬病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 某進口PRRS-VR2332毒株弱毒苗，PRV(Bartha-61株)基因缺失苗，豬瘟兔化弱毒苗。

1.1.2 主要試劑 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒(99-18070)，豬瘟抗體檢測試劑盒(99-43220)，偽狂犬病抗體檢測試劑盒(99-09836)，北京愛德士元亨生物科技有限公司(IDEXX)產(chǎn)品；所有樣品的檢測試劑為同批次試劑盒。

1.1.3 主要儀器 -25℃冰箱(YCD-265)，澳柯瑪股份有限公司產(chǎn)品；離心機(D3024)，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫箱(DHP-2)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；酶標儀(Multiskan fc)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 豬場免疫 陜西地區(qū)某生豬養(yǎng)殖公司，存欄1 000頭基礎(chǔ)母豬，單點式飼養(yǎng)管理模式，全進全出，仔豬3周齡斷奶，斷奶當天轉(zhuǎn)入保育舍，保育4周后直接銷售。豬場生產(chǎn)成績理想，2年內(nèi)未暴發(fā)過烈性傳染性疾病。

豬場免疫程序如下：

疫苗選擇：某進口PRRS-VR2332毒株弱毒苗，PRV(Bartha-61株)基因缺失苗，豬瘟兔化弱毒苗。

CSF免疫程序：基礎(chǔ)母豬群普免2次/年，哺乳母豬跟胎免疫，后備母豬入群前免疫2次，免疫劑量均為1頭份/次。

PRRS免疫程序：基礎(chǔ)母豬群普免3次/年，后備母豬入群前免疫1次，14日齡仔豬免疫1次，免疫劑量均為1頭份/次。

PR免疫程序：基礎(chǔ)母豬群普免4次/年，后備母豬入群前免疫2次，免疫劑量均為1頭份/次。

1.2.2 血樣采集 隨機采集不同階段豬只血液，每階段豬只(20周齡后備母豬、22周齡后備母豬、入群前后備母豬、妊娠48 d母豬、妊娠60 d母豬、妊娠75 d母豬、分娩母豬、12日齡仔豬、32日齡保育豬及44日齡保育豬)采血25份,采集各階段豬群血清共計250份,3 500 r/min 離心10min 分離血清,剔除溶血血清(溶血血清樣本做補采),做好血清樣本標記,置-25 ℃ 冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測

1.2.3.1 豬瘟抗體檢測 參照愛德士豬瘟檢測試劑盒說明書，操作程序為：樣品稀釋(2倍稀釋)—孵育(2 h)—洗板—酶標二抗孵育(30 min)—洗板—顯色(10 min)—終止—讀數(shù)。

試驗結(jié)果計算：在450 nm處讀取陰陽性對照和每個樣品的OD值，在試驗成立的情況下(陰性對照OD值>0.5且陰性對照阻斷率%>50)，計算每個樣本的阻斷率，若阻斷率%≤30為陰性，30<阻斷率%<40為可疑，阻斷率%≥40為陽性。對于試驗不成立的試驗樣本和成立試驗的可疑樣本需重新進行試驗。

1.2.3.2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測 參照愛德士藍耳病抗體檢測試劑盒說明書，操作程序為：樣品稀釋(40倍稀釋)—孵育(30 min)—洗板—酶標二抗孵育(30 min)—洗板—顯色(15 min)—終止—讀數(shù)。

試驗結(jié)果計算：在650 nm處讀取陰陽性對照和每個樣品的OD值，在試驗成立的情況下(陽性對照OD值-陰性對照OD值≥0.15且陰性對照OD值≤0.15)，計算每個樣本的S/P值，若S/P值<0.4為陰性，若S/P值≥0.4為陽性。對于試驗不成立的試驗樣本需重新進行實驗。

1.2.3.3 偽狂犬抗體檢測 參照IDEXX偽狂犬抗體檢測試劑盒說明書，操作程序為：樣品稀釋(2倍稀釋)—孵育(1 h)—洗板—酶標二抗孵育(20 min)—洗板—顯色(15 min)—終止—讀數(shù)。

試驗結(jié)果計算：在650 nm處讀取陰、陽性對照和每個樣品的OD值，在試驗成立的情況下(陰性對照OD值-陽性對照OD值≥0.3)，計算每個樣本的S/N值，若S/N>0.7為陰性，0.6

2 結(jié)果

2.1 CSF抗體檢測結(jié)果及分析

CSF抗體檢測結(jié)果見圖1和圖2，結(jié)合圖1和圖2結(jié)果分析如下。

后備母豬群的CSF抗體陽性率為66%，20周齡后備母豬豬瘟阻斷率在30%～40%之間的占比為1%，在40%～50%之間的占比5%，豬瘟阻斷率>50%占比75%；22周齡后備豬豬瘟阻斷率在30%～40%之間的占比為5%，在40%～50%之間的占比為10%，豬瘟阻斷率>50%占比為20%；入群前后備豬豬瘟阻斷率在30%～40%之間的占比為3%，在40%～50%之間的占比為9%，豬瘟阻斷率>50%占比80%。

基礎(chǔ)母豬的妊娠分娩階段的豬瘟抗體陽性率高，為93%，離散度較小(10%-19%)。妊娠48 d母豬豬瘟阻斷率在30%-<40%之間的占比為2%，在40%～50%之間的占比為2%，豬瘟阻斷率>50%占比92%；妊娠60天母豬豬瘟阻斷率在30%～40%之間的占比為0%，在40%～50%占比0%，豬瘟阻斷率>50%占比96%；妊娠75天母豬豬瘟阻斷率在30%～40%占比0%，在40%～50%占比0%，豬瘟阻斷率>50%占比95%；哺乳母豬豬瘟阻斷率在30%～40%占比3%，在40%～50%占比0%，豬瘟阻斷率>50%占比96%。

A.20周齡后備豬;B.22周齡后備豬;C.入群前后備豬;D.妊娠48 d母豬;E.妊娠60 d母豬;F.妊娠75 d母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖1 各階段豬只豬瘟抗體陽性率、平均值及離散度Fig.1 The positive rate,average and dispersion of classical swine fever antibodies in each stage of pigs

A.20周齡后備母豬;B.22周齡后備母豬;C.入群前后備母豬;D.妊娠48 d母豬;E.妊娠60 d母豬;F.妊娠75 d母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖2 豬瘟抗體阻斷率分布Fig.2 Distribution of the blocking rate of classical swine fever antibodies

仔豬(12日齡)及保育豬(32日齡，44日齡)CSF的抗體陽性率為69%，離散度偏大(15%～45%)，阻斷率平均值為58%。12日齡仔豬豬瘟阻斷率在30%～40%的占比為2%，在40%～50%的占比為11%，豬瘟阻斷率>50%占比67%；32日齡仔豬豬瘟阻斷率在30%～40%占比為8%，在40%～50%占比為0%，豬瘟阻斷率>0.5%占比69%；44日齡保育豬豬瘟阻斷率在30%～40%之間占比為9%，在40%～50%之間占比14%，豬瘟阻斷率>50%占比45%。

2.2 PRRS抗體檢測結(jié)果及分析

PRRS抗體檢測結(jié)果見圖3和圖4，結(jié)合圖3和圖4結(jié)果分析如下。

后備母豬群的PRRS抗體陽性率為89%，離散度較小(18%～23%)，S/P平均值為1.73。該階段豬群整體免疫狀態(tài)良好。22周齡后備母豬的PRRS S/P平均值為2.0，高于20周齡后備母豬(1.5)和入群前后備(1.7)。20周齡后備母豬S/P<0.4占比2.5%，0.4≤S/P≤2.5占比97.5%，S/P>2.5占比0%；22周齡后備母豬S/P<0.4占比0%，0.4≤S/P≤2.5占比100%，S/P>2.5占比0%；入群前后備豬S/P<0.4占比5%，0.4≤S/P≤2.5占比95%，S/P>2.5占比0%。

基礎(chǔ)母豬的妊娠分娩階段PRRS抗體陽性率為90%,離散度較小(17%～40%)，S/P平均值為1.23。妊娠48 d母豬的PRRS S/P<0.4占比2%，0.4≤S/P≤2.5占比98%，S/P>2.5占比0%；妊娠60天母豬的PRRS S/P<0.4占比14.8%，0.4≤S/P≤2.5占比85.7%，S/P>2.5占比0%；妊娠75天母豬的PRRS S/P<0.4占比0%，0.4≤S/P≤2.5占比95%，S/P>2.5占比5%；哺乳母豬的PRRS S/P<0.4占比14.8%，0.4≤S/P≤2.5占比85.2%，S/P>2.5占比0%。

A.20周齡后備母豬;B.22周齡后備母豬;C.入群前后備母豬;D.妊娠48 d母豬;E.妊娠60 d母豬;F.妊娠75 d母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖3 各階段豬只PRRS抗體陽性率、平均值及離散度Fig.3 The positive rate,average and dispersion of PRRS antibodies in each stage of pigs

A.20周齡后備豬;B.22周齡后備豬;C.入群前后備豬;D.妊娠48 d母豬;E.妊娠60 d母豬;F.妊娠75 d母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖4 PRRS抗體S/P值分布Fig.4 Distribution of the S/P value of PRRS antibodies

仔豬(12日齡)及保育豬(32日齡，44日齡)PRRS的抗體陽性率為62%，豬群離散度偏大(55%～64%)，S/P平均值為1.1。12日齡仔豬的PRRS S/P<0.4占比44%，0.4≤S/P≤2.5占比56%，S/P>2.5占比0%；32日齡仔豬的PRRS S/P<0.4占比33%，0.4≤S/P≤2.5占比67%，S/P>2.5占比0%；44日齡保育豬的PRRS S/P<0.4占比36%，0.4≤S/P≤2.5占比64%，S/P>2.5占比0%。

2.3 偽狂犬病抗體檢測結(jié)果及分析

偽狂犬病抗體檢測結(jié)果見圖5和圖6，結(jié)合圖5和圖6分析如下。

A.20周齡后備母豬;B.22周齡后備母豬;C.入群前后備母豬;D.妊娠48 d母豬;E.妊娠60 d母豬;F.妊娠75 d母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖5 各階段豬只偽狂犬抗體陽性率、平均值及離散度Fig.5 The positive rate,average and dispersion of PR antibodies in each stage of pigs

后備母豬群的PR抗體陽性率為74%，離散度大(74%)，S/N平均值為0.4。該階段豬群整體免疫狀態(tài)良好。22周齡后備母豬群的陽性率最低(55%)，離散度最小(55%)，S/N平均值最高。

基礎(chǔ)母豬在妊娠和分娩階段的PR抗體陽性率均為100%,離散度較小(2%～25%)，S/N平均值為0.1。豬群免疫狀況良好。

仔豬(12日齡)及保育豬(32日齡，44日齡)PR的抗體陽性率均為100%，豬群離散度偏小(4%～36%)，S/N平均值為0。豬群免疫狀況良好。

3 討論

3.1 豬瘟抗體檢測結(jié)果分析

豬瘟是由豬瘟病毒引起的烈性傳染性疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特征，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染性疾病[6]。近年來，隨著豬瘟病毒耐受性及基因重組的發(fā)生，該病流行特點趨于散發(fā)和周期性流行，臨床表現(xiàn)溫和型、非典型型及無名高熱綜合征[7-9]。我國主要采用豬瘟兔化弱毒疫苗(C株、HCLV)進行免疫，歐盟使用豬瘟病毒E2蛋白亞單位和活載體疫苗[10-11]。眾所周知，抗體的中和效價能直接反映疫苗的保護效果，有學者通過評估中和抗體及ELISA檢測相關(guān)性以期用ELISA檢測替代中和抗體檢測[12]。IDEXX豬瘟ELISA檢測試劑盒與中和抗體效價相關(guān)性為0.863，說明該試劑盒一定程度上能反映豬群免疫后的抗體水平[13]。

A.20周齡后備母豬;B.22周齡后備母豬;C.入群前后備母豬;D.妊娠48天母豬;E.妊娠60天母豬;F.妊娠75天母豬;G.分娩母豬;H.12日齡仔豬;I.32日齡保育豬;J.44日齡保育豬。A.Reserve pigs at 20 weeks of age;B.Reserve pigs at 22 weeks of age;C.Reserve pigs before and after entering the group;D.48 days gestation sows;E.60 days gestation sows;F.75 days gestation sows;G.Farrowing sows;H.12-day-old piglets;I.32-day-old nursery pigs;J.44-day-old nursery pigs.圖6 偽狂犬抗體S/N值分布Fig.6 Distribution of the S/N value of PR antibodies

本文研究發(fā)現(xiàn)該豬場各階段豬群CSF免疫效果參差不齊，22周齡后備母豬的陽性率只有30%，是導致后備母豬群CSF抗體陽性率整體偏低的主要原因。CSF抗體陽性率從80%(20周齡后備母豬)下降到30%(22周齡后備母豬)的原因可能與20周齡后備母豬阻斷率均值低(64.6%)、采樣誤差、不同階段豬群健康度的差異、疫苗免疫操作水平及豬群感染CSF的壓力等都有關(guān)系，總之，22周齡后備母豬CSF抗體水平需持續(xù)關(guān)注。入群前后備母豬CSF抗體水平有所回升，與前期的豬瘟免疫有關(guān)?；A(chǔ)母豬群CSF免疫狀況良好，抗體陽性率為95%，離散度為10%～19%，CSF抗體陽性率符合我國農(nóng)業(yè)部動物疾病強制免疫計劃中種豬群抗體陽性率 90.0% 的合格率要求[14]。有人摸索了仔豬母源CSF抗體的衰減規(guī)律，發(fā)現(xiàn)3周齡～8周齡仔豬母源CSF抗體隨周齡的增加而不斷衰減[15]，與本研究結(jié)果一致。有報道稱，離散度小(≤40%)說明豬場散發(fā)豬瘟的危險性小[16]，而該場44日齡保育豬CSF抗體陽性率為50%，離散度45%，提示母豬場下游端豬群的豬瘟免疫工作應(yīng)及時開展。

3.2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結(jié)果分析討論

豬繁殖與呼吸綜合征由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以母豬繁殖障礙和保育豬、育肥豬呼吸道疾病為特征的傳染病[17]，疫苗免疫是預(yù)防和控制豬繁殖與呼吸綜合征的有效方法之一[18]。對該豬場免疫效果檢測評估發(fā)現(xiàn)：后備母豬群豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽性率98%，基礎(chǔ)母豬群抗體陽性率92%，12日齡仔豬到保育階段豬群抗體陽性率62%，整體豬群免疫狀況良好。妊娠60 d母豬和哺乳母豬S/P<0.4占比分別為14.3%和14.8%。妊娠75 d母豬豬繁殖與呼吸綜合征S/P>2.5占比5%，說明基礎(chǔ)母豬群存在野毒感染風險，抗體陰性豬最易引起野毒感染[19]，是重點關(guān)注對象。該豬場應(yīng)根據(jù)檢測結(jié)果優(yōu)化基礎(chǔ)母豬群免疫程序，由于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的變異重組能降低不同疫苗毒株的交叉保護效果[20-21]，在制定免疫程序時應(yīng)明確場內(nèi)流行毒株，選擇適用疫苗，提高免疫保護效果[22]。仔豬到保育44日齡的豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽性率低，與母源抗體干擾14日齡仔豬的豬藍耳病疫苗免疫，仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善及個體免疫記憶功能尚未形成等因素有關(guān)。

3.3 偽狂犬病抗體檢測結(jié)果分析

國內(nèi)暴發(fā)偽狂犬病以來，一直威脅豬群健康，該病常用基因缺失活疫苗和滅活苗[23]免疫進行防控。豬偽狂犬病病毒一旦感染將會終生帶毒[24],雖偽狂犬病疫苗免疫未能有效阻止臨床感染的發(fā)生，但高水平的疫苗抗體陽性率能降低豬群的感染率。分析檢測結(jié)果可見，該豬場后備母豬群是高風險群體(偽狂犬病抗體陽性率70%)，抗體陽性率低與免疫程序的合理性、疫苗選擇、免疫操作水平、豬群的免疫抑制疾病的發(fā)生史等都有關(guān)系。

4 結(jié)論

雖然該豬場的生產(chǎn)成績較理想，疫病發(fā)生少，但抗體分析結(jié)果顯示該豬場的免疫程序有進一步的提升空間。關(guān)于免疫程序的制定有幾點建議如下：保育豬階段的豬瘟免疫日期應(yīng)結(jié)合檢測結(jié)果適當后延，保育豬完整的免疫系統(tǒng)是產(chǎn)生高水平抗體的前提；該場有豬藍耳病高水平抗體與野毒感染壓力共存的現(xiàn)象，應(yīng)明確該豬場流行毒株，選擇適用疫苗，提高免疫保護力；后備母豬群的偽狂犬病疫苗免疫密度應(yīng)適當增加。