2型糖尿病及并發(fā)腎病模型大鼠腸道菌群多樣性分析

殷瑞霞，皇甫建，肖 瑞，斯 琴，張傳領(lǐng)，李 戀，任向宇*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；2.呼和浩特市第二醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；4.北京物資學(xué)院，北京 101100；5.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于機(jī)體內(nèi)的胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足，引起糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝發(fā)生紊亂，以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病的發(fā)生與遺傳、環(huán)境和自身免疫等因素有關(guān)[2]，但具體病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今仍尚未完全闡明。糖尿病患者中約90%為2型糖尿病患者(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)2019年發(fā)布數(shù)據(jù)，我國有1.164億糖尿病患者，是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國家，其中近一半患者合并糖尿病腎病[3]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎病的最常見原因，是糖尿病死亡率增加的主要原因之一[4]。由于對(duì)早期DN的診斷手段有限，大部分新診斷患者腎功損害已進(jìn)展為Ⅲ或Ⅳ期，不可逆轉(zhuǎn)。目前，2型糖尿病及其并發(fā)腎病的患病率、致殘率逐年上升以及隨之增加的早死風(fēng)險(xiǎn)，給社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來研究表明腸道微生態(tài)尤其是腸道菌群在肥胖、糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[5-6]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，研究人員稱其為“腸-腎軸”理論，被認(rèn)為是糖尿病腎病新的致病機(jī)理，但具體機(jī)制尚不明確[7]。本研究通過分析T2DM和DN大鼠模型的腸道菌群失衡模式以及代謝、炎癥指標(biāo)與菌群的相關(guān)性，探討腸道菌群在T2DM及其并發(fā)DN中可能存在的作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠18只，7周齡～8周齡，體重180 g～200 g，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(蒙)2020-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃左右，濕度恒定，光照節(jié)律12L∶12D。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定，通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)文號(hào)YKD202002059)。

1.1.2 主要試劑 普通基礎(chǔ)飼料(成分：碳水化合物62%，蛋白質(zhì)26%，脂肪12%)，內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心產(chǎn)品；高糖高脂飼料(成分：基礎(chǔ)飼料42.4%，蔗糖15%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽酸鹽0.1%，雞蛋10%，麻油20%)，北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；鏈脲佐菌素和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，美國Sigma公司產(chǎn)品；脂多糖、腫瘤壞死因子-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1測(cè)定ELISA試劑盒，泉州睿信生物科技有限公司產(chǎn)品；CTAB，北京NobleRyder公司產(chǎn)品；Lysozyme溶菌酶溶液、RNA消化酶和Universal DNA純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、Phusion? High-Fidelity DNA polymerase，New England Biolabs公司產(chǎn)品；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns文庫構(gòu)建試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 -80℃超低溫冰箱(MDF-328E)，日本SANYO公司產(chǎn)品；電泳儀(DDY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；梯度PCR 儀(T100)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Lab Chip GX Touch平臺(tái)(LabChip GX Touch HT Nucleic Acid Analyzer)，美國PerkinElmer公司產(chǎn)品；高通量測(cè)序分析儀(IonS5TMXL Ion 530 Chip)，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；酶標(biāo)分析儀(RT-6100),美國Rayto公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模過程 SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為健康對(duì)照組(R1)6只，以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；造模組12只，包括2型糖尿病組(R2)和糖尿病腎病組(R3)各6只，均以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。禁食12 h后，給予50 g/L水合氯醛0.01 mL/g腹腔注射麻醉R3組大鼠，手術(shù)移除左腎，全程采取無菌操作。喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水12 h后稱重，R2和R3組大鼠連續(xù)3天給予10 g/L 鏈脲佐菌素溶液30 mg/kg腹腔注射，R1組大鼠給予相同量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后檢測(cè)大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及空腹胰島素(fasting insulin,FIns)水平，計(jì)算內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型[7]評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)。經(jīng)檢測(cè)，兩疾病模型大鼠非空腹血糖>16.7 mmol/L且HOMA-IR≥2.69，即2型糖尿病造模成功[9-10]。繼續(xù)喂養(yǎng)8周，以非空腹血糖>16.7 mmol/L、尿量>原尿量150%、24 h尿蛋白(24-hour urine protein，24 h UP)定量>30 mg作為糖尿病腎病成模標(biāo)準(zhǔn)[11]。在造模過程中，兩疾病模型組各有2只大鼠死亡，最終每組選擇3只狀態(tài)穩(wěn)定的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成模后留取3個(gè)組大鼠24 h尿液，檢測(cè)24 h UP；經(jīng)頸靜脈放血處死動(dòng)物，分離血清檢測(cè)FBG、FIns、血肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)等指標(biāo)；分離結(jié)腸內(nèi)容物于-80℃保存?zhèn)錂z。ELISA法檢測(cè)血清脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein,MCP-1)水平，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 腸道菌群16S rDNA -V4區(qū)測(cè)序 (1)糞便基因組DNA提取：稱取200 mg糞便樣品，采用CTAB法提取糞便DNA。(2)16S rDNA V4區(qū)PCR擴(kuò)增：上游引物為5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′,下游引物序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；反應(yīng)體系：上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板10 μL、Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和Phusion? High-Fidelity DNA polymerase 25 μL、雙蒸水13 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃擴(kuò)展延伸10 min,16℃保持5 min。(3)PCR產(chǎn)物回收和純化：根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混合，充分混勻后使用1×TAE濃度20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，用Universal DNA純化回收試劑盒對(duì)目標(biāo)條帶割膠回收。(4)16S rDNA 文庫構(gòu)建與高通量測(cè)序：使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)定量及庫檢合格，使用高通量測(cè)序分析儀上機(jī)測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)對(duì)序列分析，把相似性≥97%的序列分配到相同的OTUs?；贠TUs，用QIIME 軟件計(jì)算α-多樣性并對(duì)物種注釋結(jié)果進(jìn)行可視化展示。結(jié)合OTUs豐度信息計(jì)算得到Weighted Unifrac距離，用來衡量組間的相異系數(shù)，分析組間群落結(jié)構(gòu)差異程度。為找出對(duì)組間差異產(chǎn)生顯著性影響的群落或物種，進(jìn)行物種LEfSe差異分析，LDA閾值為4.0。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0和R-2.15.3進(jìn)行整理分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3個(gè)組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。對(duì)于非正態(tài)計(jì)量資料，兩兩比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，3個(gè)組比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。非正態(tài)分布雙變量相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)組大鼠生化指標(biāo)比較

與對(duì)照R1組相比，R2和R3組FBG、HOMA-IR、24 h UP水平顯著升高(P<0.05)；與R2組相比，R3組中FBG、SCr、BUN顯著上升(P<0.01，P<0.05，P<0.05)(表1)。以上結(jié)果提示兩模型組明顯發(fā)生胰島素抵抗和糖代謝異常，DN組更顯著且合并有腎功能損害，T2DM和DN模型構(gòu)建成功。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum biochemical indices of rats

2.2 3個(gè)組大鼠血清炎癥指標(biāo)的比較

與對(duì)照R1組相比，R2組大鼠血清LPS、TNF-α、MCP-1水平有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；R3組大鼠血清LPS、TNF-α、MCP-1水平均顯著升高 (P<0.05，P<0.01，P<0.01)。與R2組相比，R3組大鼠TNF-α水平顯著升高(P<0.01)，LPS和MCP-1水平亦有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清炎癥指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of serum inflammatory indices of rats

2.3 組間物種α-多樣性分析

與對(duì)照R1組相比，兩疾病模型組Shannon和Simpson指數(shù)顯著增大 (P<0.01)(圖1 A和B)；但ACE和Chao1指數(shù)與對(duì)照組相比則無顯著性差異 (P>0.05)(圖 1 C和D)，說明兩模型組大鼠腸道菌群的物種多樣性較對(duì)照組均有所上升，但物種豐富度在三組大鼠之間的差異并不顯著。

與R1組比，**表示P<0.01** means P<0.01 versus the group R1圖1 各組大鼠α-多樣性指數(shù)箱型圖Fig.1 Alpha-diversity index box plot among groups

2.4 3個(gè)組大鼠腸道菌群群落構(gòu)成及比較

2.4.1 3個(gè)組大鼠腸道菌群在門和屬水平上的構(gòu)成 門水平上，3個(gè)組大鼠腸道中占主導(dǎo)地位的微生物主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，其中Firmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢(shì)門類。與對(duì)照組相比，T2DM組和DN組腸道菌群中Firmicutes相對(duì)豐度依次下降，Bacteroidetes和Proteobacteria相對(duì)豐度逐漸升高(圖2A)。屬水平上，R2和R3組大鼠腸道中Romboutsia、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度較對(duì)照組下降，埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、Ruminococcus相對(duì)豐度較對(duì)照組增高(圖2B)。

A.門水平；B.屬水平A.Phylum level;B.Genus level圖2 門和屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.2 The relative abundance histogram at the phylum and genus level

2.4.2 β-多樣性組間比較 如圖3，3個(gè)組大鼠中兩兩組間的相異系數(shù)均大于0，說明各組大鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)存在差異?；赪eighted Unifrac 距離，即考慮物種豐度信息，R2與R3組兩組間的相異系數(shù)較R1組分別與R2和R3組間的相異系數(shù)小，表明T2DM和DN組大鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)差異程度較其余組間低，物種組成具有一定相似性。

圖中同一方格上下兩個(gè)值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離，數(shù)字是兩兩之間的相異系數(shù)，相異系數(shù)越小則物種結(jié)構(gòu)的差異越小。In the same box,the upper value means the Weighted Unifrac distance,and the lower value means the Unweighted Unifrac distance.A smaller number indicates a smaller structural difference between the two groups.圖3 β-多樣性指數(shù)熱圖Fig.3 Beta-diversity heatmap

2.4.3 LEfSe多級(jí)物種差異判別分析 LEfSe結(jié)果顯示，R1和R2兩組間統(tǒng)計(jì)到有10個(gè)差異物種，o-Lachnospirales及其下的毛螺菌科(f-Lachnospiraceae)、o-Oscillospirales 及其下的瘤胃球菌科(f-Ruminococcaceae)與g-CAG-352在R2組富集，桿菌綱(c-Bacilli)、o-Peptostreptococcales-Tissierellales的消化鏈球菌科(f-Peptostreptococcaceae)及其下的g-Romboutsia的s-Romboutsia-ilealis在R1組富集(圖4 A)。共有19個(gè)物種豐度在R1和R3兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中在R1組富集的差異菌群與在R1和R2兩組間統(tǒng)計(jì)到的物種完全相同。變形菌門(p-Proteobacteria)、γ-變形菌綱(c-Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(o-Enterobacteriales)、腸桿菌科(f-Enterobacteriaceae)的埃希氏-志賀氏菌屬(g-Escherichia-Shigella)、擬桿菌門(p-Bacteroidetes)、擬桿菌綱(c-Bacteroidia)、擬桿菌目(o-Bacteroidales)、o-Oscillospirales其下的瘤胃球菌科(f-Ruminococcaceae)的g-Ruminococcus、o-Lachnospirales其下的毛螺菌科(f-Lachnospiraceae)在R3組富集(圖4 B)。此外，R2組與R3組之間有顯著差異的物種分別是厚壁菌門下的g-Ruminococcus和g-Faecalibaculum于R3組富集，g-CAG-352、o-Clostridia-UCG-014在R2組富集(圖4C)。

圖4 多級(jí)物種差異判別結(jié)果Fig.4 Species identification at multilevel among groups

2.5 腸道菌群與代謝及炎癥指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

如圖5，Spearman相關(guān)性分析顯示，Romboutsia與各代謝及炎癥指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，Ruminococcus和Escherichia-Shigella與各指標(biāo)呈正相關(guān)。其中Romboutsia與FBG、FIns、UP24h、BUN、HOMA-IR、LPS、MCP-1，Ruminococcus與FBG、UP24h、SCr、BUN、HOMA-IR、LPS、TNF-α、MCP-1，Escherichia-Shigella與FBG、UP24h、SCr、BUN、LPS、TNF-α、MCP-1，它們各自之間的相關(guān)系數(shù)高且差異顯著(P<0.05)。

圖5 屬水平大鼠腸道菌群與代謝指標(biāo)、炎癥指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.5 The analysis of correlation between gut microbiota and blood parameters on the genus level

3 討論

腸道菌群是棲息在腸道內(nèi)的微生物集合，其作為機(jī)體的“第二大基因組”密切地影響著宿主健康。腸道內(nèi)的復(fù)雜組成參與了機(jī)體多種生理代謝過程，如營養(yǎng)吸收和能量代謝，產(chǎn)生維生素和激素，參與免疫、代謝功能以及神經(jīng)行為特征調(diào)節(jié)等[2]。隨著生活條件的改善，現(xiàn)代人以高脂、高蛋白為主的飲食習(xí)慣使腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)異常和菌群多樣性發(fā)生改變，包括機(jī)會(huì)性病原體增加和/或有益微生物的減少，即腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)又進(jìn)一步影響著人類的健康[12]。腸道菌群的組成和某些細(xì)菌豐度變化都是調(diào)控糖尿病發(fā)展的重要因素[13]。本研究α-多樣性分析顯示兩疾病模型組和健康對(duì)照組菌群豐度沒有顯著差異，而多樣性達(dá)到差異顯著，表明在在3個(gè)組處理中腸道菌群總體數(shù)量沒有太多變化，而菌群分布卻有明顯改變。所有樣本優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。健康對(duì)照組中大部分優(yōu)勢(shì)菌屬來自厚壁菌門和擬桿菌門。T2DM組和DN組腸道菌群中厚壁菌門比例下降，擬桿菌門和變形菌門的比例明顯上升。既往研究[14]中無論在造模第4周還是第12周，糖尿病大鼠與健康組相比后厚壁菌門與擬桿菌門比值一直呈下降趨勢(shì)。在人類研究中也有類似結(jié)果[15]。厚壁菌門與擬桿菌門在體內(nèi)對(duì)糖代謝有重要作用，二者共同促進(jìn)宿主能量代謝，二者相對(duì)豐度的比值(F/B)可能與血糖水平成負(fù)相關(guān)。因此，伴隨高血糖、胰島素抵抗等代謝紊亂發(fā)生和腎功損害進(jìn)展，T2DM和DN大鼠的腸道菌群發(fā)生紊亂，且變化趨勢(shì)具有一定一致性。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，已知腸道細(xì)菌產(chǎn)LPS增加是導(dǎo)致“代謝性內(nèi)毒素血癥”的重要原因[16]。LPS能誘發(fā)腸道黏膜炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致腸道黏膜緊密性降低而大量入血產(chǎn)生系統(tǒng)炎癥，其可用于評(píng)價(jià)腸道免疫屏障功能[17]。TNF-α是炎癥早期表達(dá)較高的細(xì)胞因子，當(dāng)濃度較高時(shí)可直接導(dǎo)致患者內(nèi)分泌失調(diào)，引發(fā)免疫損傷，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[18]。MCP-1是一種被廣泛研究的CC亞族趨化因子，對(duì)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞都有炎癥趨化作用[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示以上三者在兩疾病狀態(tài)下均升高，表明兩疾病模型組大鼠體內(nèi)炎癥機(jī)制被激活，尤其DN組大鼠血清LPS、TNF-α、MCP-1水平顯著高于正常對(duì)照組，且TNF-α水平顯著高于T2DM組，提示在T2DM向DN進(jìn)展過程中，“內(nèi)毒素血癥”程度和炎癥反應(yīng)隨之增強(qiáng)，并且TNF-α相關(guān)的炎癥信號(hào)通路上調(diào)可能與糖尿病腎損傷有關(guān)[20]。

LEfSe分析顯示，T2DM和DN組大鼠腸道中瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)豐度較對(duì)照組顯著上升，同時(shí)DN組較對(duì)照組腸桿菌科(Enterobacteriaceae)下的埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)豐度也顯著上升。有研究顯示，Lachnospiraceae在 T2DM 肥胖小鼠中豐度增加[21]；在DDE誘導(dǎo)的肥胖小鼠糞便中同樣有上升趨勢(shì)[22]；Lachnospiraceae和肥胖發(fā)生呈正相關(guān)，并且是發(fā)生肥胖的相關(guān)生理標(biāo)記[23]。與肥胖組小鼠相比，菊粉飼喂小鼠糞便中Lachnospiraceae和Ruminococcaceae豐度也下降[24]。在早期腎臟病患者腸道菌群中也發(fā)現(xiàn)了類似的變化[25]。Enterobacteriaceae能引起人類和動(dòng)物腸道疾病，尤其Escherichia-Shigella是細(xì)菌性痢疾病原菌之一。在2型糖尿病小鼠中變形菌門豐度一部分來源于腸桿菌科的埃希菌屬細(xì)菌增加[26-27]。在人類研究中糖尿病患者腸道中也出現(xiàn)腸桿菌科等有害菌的數(shù)量增加的現(xiàn)象[5]。這些結(jié)果與Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Escherichia-Shigella在本研究兩疾病模型中變化趨勢(shì)相一致。因此，本研究中糖尿病及其并發(fā)腎病組大鼠發(fā)病過程可能與高豐度的Lachnospiraceae、尤其是Ruminococcus及Escherichia-Shigella所參與的腸道內(nèi)代謝異常、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，進(jìn)而參與兩種疾病的發(fā)生和進(jìn)展。

Faecalibaculum是鼠的內(nèi)源性菌屬，屬于Erysipelotrichaceae[28]。研究發(fā)現(xiàn)在肥胖模型動(dòng)物和肥胖人群腸道中均具有較高水平的Erysipelotrichaceae。高膽固醇血癥模型倉鼠經(jīng)降膽固醇治療后，Erysipelotrichaceae豐度下降到1/4。此外，Erysipelotrichaceae相對(duì)豐度與TNF-α水平成正相關(guān)，可能與宿主炎癥有關(guān)[29]。本研究中，與T2DM組相比Faecalibaculum在DN組大鼠腸道內(nèi)富集，提示Erysipelotrichace的存在可能參與糖尿病腎病進(jìn)展。

Romboutsia屬消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)，專性厭氧菌，于2014年被正式命名[30]，是人體口腔、上呼吸道、腸道及女性生殖道的正常菌群。曾有研究表明T2DM大鼠腸道內(nèi)Romboutsia豐度明顯下降，且和血糖呈負(fù)相關(guān)[31]。營養(yǎng)性肥胖抵抗的大鼠回腸中Romboutsia豐度降低，推測(cè)Romboutsia可能是參與肥胖發(fā)生的關(guān)鍵回腸菌群[32]。肥胖小鼠攝入富含抗性淀粉飲食后Romboutsia在糞便中豐度會(huì)上升[33]。本研究兩疾病模型中Romboutsia含量均顯著減少，且與FBG、FIns、24h UP、BUN、HOMA-IR、LPS、MCP-1各指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。Romboutsiailealis是大鼠小腸的天然居民和關(guān)鍵角色，其合成氨基酸和維生素能力有限，但有多種多樣途徑可利用相對(duì)簡單的碳水化合物，如在降解葡萄糖、巖藻糖和低聚果糖過程中起到關(guān)鍵作用。腸道菌群和黏液屏障之間的功能交互作用是預(yù)防腸道病原的主要防御手段，Romboutsiailealis具有與黏液降解微生物競爭的潛在機(jī)制[34]。因此，推測(cè)本研究大鼠模型由于長期高脂飲食使得腸道菌群組成發(fā)生改變，導(dǎo)致腸道正常菌屬Romboutsia減少，與黏液降解微生物競爭能力減弱，使得其他有害菌機(jī)會(huì)性增加，加重了腸屏障功能障礙，導(dǎo)致LPS釋放入血增加，從而誘發(fā)MCP-1相關(guān)的低度炎癥反應(yīng)，參與T2DM及DN的發(fā)生。

綜上所述，T2DM組與DN組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)具有一定相似性，且都向有害菌偏移。結(jié)合現(xiàn)有研究，腸道菌群失調(diào)可能通過導(dǎo)致腸道屏障被破壞、免疫代謝功能異常，促使慢性低度炎癥反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致胰島素抵抗和T2DM的發(fā)生發(fā)展。隨T2DM代謝紊亂加重，持續(xù)的高糖刺激和氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，DN組較T2DM組大鼠腸道菌群發(fā)生了更具致病性的改變，腸道菌群進(jìn)一步參與了DN的進(jìn)展。

近年來對(duì)于糖尿病而言，不乏人群樣本腸道菌群研究，但臨床上DN相關(guān)研究往往受制于其確診方式的局限性。本研究同時(shí)在T2DM和DN大鼠的模型中探討了腸道菌群變化，為后續(xù)尋找在T2DM及DN診斷和治療中具有特征性意義的菌種相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。但腸道菌群具有個(gè)體差異，細(xì)菌不同菌株之間也存在差異。因此，本研究在科和屬水平的研究尚不能完全闡述這些變化帶來的病理意義，后續(xù)研究盡可能地集中于菌種水平上的變化。