誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞CD163受體表達(dá)的細(xì)胞因子篩選

劉 源，馬卓媛，樊 港，楚電峰，張仕強(qiáng)*，王 妍*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000)

巨噬細(xì)胞最初是在19世紀(jì)由Metchnikoff E根據(jù)它們的吞噬活性而定義[1]。巨噬細(xì)胞廣泛分布于淋巴器官、肝、肺、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、漿液腔、骨、滑膜和皮膚等幾乎所有組織器官中，表現(xiàn)出巨大的結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性[2]。這些不同組織中的巨噬細(xì)胞在許多生物學(xué)過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，如器官穩(wěn)態(tài)功能的維持、組織發(fā)育和組織修復(fù)，還參與了對(duì)病原體、慢性炎癥、纖維化和癌癥的防御等[3]。

CD163是一種富含B族半胱氨酸的清道夫受體，表達(dá)于外周血單核細(xì)胞和大多數(shù)組織巨噬細(xì)胞中。該受體的上調(diào)表達(dá)是炎癥中巨噬細(xì)胞向替代活化表型(alternatively activated macrophages,簡(jiǎn)稱M2)轉(zhuǎn)變的主要變化之一[4]。CD163能夠介導(dǎo)血紅蛋白(haemoglobin，Hb)和觸珠蛋白(haptoglobin,Hp)復(fù)合物的內(nèi)吞作用[5]。CD163的天然功能是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，因此它是病原體進(jìn)入細(xì)胞的靶標(biāo)[6]。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是危害生豬養(yǎng)殖的一種重要疾病[7]，其病原體PRRSV主要侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞，PRRSV侵染宿主細(xì)胞的機(jī)理已被充分研究。其中CD163已被確定為介導(dǎo)病毒附著和內(nèi)化的主要受體[8]。

本研究通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞起源和豬肺泡巨噬細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境的分析，檢索到一系列促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)育成熟以及M2型轉(zhuǎn)變的因子，包括M-CSF、GM-CSF、TGFβ1、IL-10、IL-3和dexamethasone。相關(guān)細(xì)胞因子和小分子篩選主要有3個(gè)依據(jù)。其一，該因子在巨噬細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用。M-CSF對(duì)于巨噬細(xì)胞的分化和自我更新極其重要[9]，同時(shí)功能性的M-CSF的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠出生后發(fā)育過(guò)程中肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量非常少[10-11]。IL-3對(duì)于造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)維持具有重要意義[12]。其二，該因子在肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)育成熟和維持過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。GM-CSF是出生后不久肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)育和一生中維持肺泡巨噬細(xì)胞功能所必需的[13-14]。TGF-β可以通過(guò)自分泌的方式維持肺泡巨噬細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)[15]。其三，該因子能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型轉(zhuǎn)變，如dexamethasone和IL-10能夠促進(jìn)PAM的M2型極化，進(jìn)而促進(jìn)CD163的表達(dá)[16]。對(duì)上述因子進(jìn)行測(cè)試，篩選促進(jìn)PAM中CD163受體表達(dá)的因子及其組合，有助于人們對(duì)于CD163表達(dá)調(diào)控的理解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAM)由動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青島易邦生物工程有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(100-21)，重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(300-25)，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(300-03)，重組人白介素10(200-10)，重組人白介素3(200-03)，PEPROTACH公司產(chǎn)品；地塞米松磷酸鈉(S4028)，Selleck公司產(chǎn)品；CD163抗體(MCA2311F)，BioRad公司產(chǎn)品；Alexa Fluor? 488山羊抗鼠IgG (H+L)抗體(A0428)，碧云天公司產(chǎn)品；總RNA試劑盒(DP431)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106)、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green)(FP215)，天根公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基(61870127)，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(CFX96)，美國(guó)Bio-Red公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡(EVOS f1)，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；高速分選型流式細(xì)胞儀(0314131322)，美國(guó)BD Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原代PAM分離 取60日齡～65日齡的健康仔豬安樂(lè)死，通過(guò)前腔靜脈完全釋放循環(huán)血液。用750 mL/L酒精消毒胸腹部，沿縱膈打開(kāi)胸腔，使肺臟完全暴露。用消毒棉線結(jié)扎連接肺部的靜脈血管和氣管遠(yuǎn)端，剪斷遠(yuǎn)離肺臟的另一端結(jié)扎線，取出整個(gè)肺臟。用PBS(添加雙抗)將肺臟表面清洗3次～4次。通過(guò)氣管將PBS注入肺臟，使PBS充滿整個(gè)肺臟，然后收集灌注液，重復(fù)此步驟6次～7次。將灌注液室溫1 500 r/min離心10 min，棄掉上清，取部分細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，剩余按照2×107個(gè)/支的細(xì)胞密度進(jìn)行凍存。

1.2.2 免疫熒光染色 按照1×104個(gè)/孔密度將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后棄掉培養(yǎng)基，用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。棄掉固定液，PBS漂洗3次，每次5 min。再用1 g/L BSA在室溫條件下封閉細(xì)胞1 h。棄掉封閉液，加入稀釋好的CD163一抗(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜?；厥找豢筆BS漂洗3次，每次5 min，再加入稀釋好的山羊抗小鼠熒光二抗(1∶200)，室溫避光孵育1 h。棄掉二抗，PBS漂洗3次，每次5 min，加入DAPI染核2 min，用熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果，每種培養(yǎng)條件隨機(jī)采集5張照片。

1.2.3 流式分選 將PAM細(xì)胞用胰酶消化計(jì)數(shù)，取1×107個(gè)PAM進(jìn)行流式分選。用1 g/L BSA在室溫條件下封閉細(xì)胞1 h。棄掉封閉液，加入稀釋好的CD163一抗(1∶100)，4℃孵育1 h?；厥找豢筆BS漂洗3次，每次5 min，再加入稀釋好的二抗(1∶100)，室溫避光孵育1 h。棄掉二抗，PBS漂洗3次，2 mL PBS重懸細(xì)胞。用高速分選型流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)PAM進(jìn)行分選。

1.2.4 熒光定量PCR(RT-qPCR) 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞特異性基因的表達(dá)情況。RT-qPCR反應(yīng)體系(15 μL)如下：2×SYBR Mix 7.5 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板0.6 μL，ddH2O 5.9 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。在72℃采集熒光信號(hào)。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 The sequences of primers used for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 單因子對(duì)CD163受體表達(dá)的影響

如圖1所示，所有6個(gè)因子都能促進(jìn)CD163受體的表達(dá)。其作用效果最為明顯的是dexamethasone，在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h的變化倍數(shù)分別為34.5倍和41.8倍)的檢測(cè)中dexamethasone能夠顯著促進(jìn)CD163受體的表達(dá)(P<0.001)。其他因子在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)CD163受體的促進(jìn)倍數(shù)均低于20倍。除了dexamethasone在48 h對(duì)CD163受體的促進(jìn)倍數(shù)為41.8倍外，其他因子在48 h對(duì)CD163受體的促進(jìn)作用倍數(shù)均低于10倍。其中GM-CSF在24 h對(duì)于CD163受體的促進(jìn)作用不顯著，在48 h才出現(xiàn)促進(jìn)作用?？傊?，本研究篩選的6個(gè)因子對(duì)于PAM中CD163受體的表達(dá)均有促進(jìn)作用。

1.對(duì)照；2.巨噬細(xì)胞集落刺激因子；3.粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞聚落刺激因子；4.白介素10；5.白介素3；6.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；7.地塞米松。**.P<0.01;***.P<0.001;ns.無(wú)顯著差異。A.RT-qPCR檢測(cè)單因子在24 h對(duì)于PAM中CD163表達(dá)的促進(jìn)作用；B.RT-qPCR檢測(cè)單因子在48 h對(duì)于PAM中CD163表達(dá)的促進(jìn)作用。1.Control;2.M-CSF;3.GM-CSF;4.IL-10;5.IL-3;6.TGF-β1;7.Dexamethasone.**.P<0.01;***.P<0.001;ns.No significant difference.A.RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by single factor at 24 h;B.RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by single factor at 48 h.圖1 RT-qPCR檢測(cè)單因子在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)于PAM中CD163表達(dá)的促進(jìn)作用Fig.1 RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by single factor at different time

2.2 不同因子組合對(duì)CD163受體表達(dá)的促進(jìn)作用

本研究篩選到的6個(gè)因子對(duì)PAM中CD163受體的表達(dá)都沒(méi)有負(fù)效應(yīng)，因此通過(guò)對(duì)6個(gè)因子進(jìn)行組合是否能夠在單因子基礎(chǔ)上得到更好的效果。于是將6個(gè)因子(6F)放在一起進(jìn)行測(cè)試，如圖2A和2B所示，6F在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)都能促進(jìn)CD163受體的表達(dá)，但是6F在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的促進(jìn)作用都低于10倍，遠(yuǎn)低于單因子dexamethasone的作用，猜測(cè)6F中存在互相拮抗的因子，于是在6F的基礎(chǔ)上減去單個(gè)因子，來(lái)排除6F組中相互拮抗的因子。如圖2A和2B所示，6F中分別減去M-CSF和GM-CSF相對(duì)于6F組中CD163受體的表達(dá)發(fā)生了顯著上調(diào)。相反，6F中減去dexamethasone后CD163受體的表達(dá)發(fā)生了顯著下調(diào)，甚至低于對(duì)照組。

1.對(duì)照；2.6F(6個(gè)因子的組合)；3.6F-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；4.6F-粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞聚落刺激因子；5.6F-白介素10；6.6F-白介素3；7.6F-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；8.6F-地塞米松;9.對(duì)照；10.地塞米松；11.地塞米松+巨噬細(xì)胞集落刺激因子；12.地塞米松+粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞聚落刺激因子；13.地塞米松+白介素10；14.地塞米松+白介素3；15.地塞米松+轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1。*.P<0.05;***.P<0.001;ns.無(wú)顯著差異。A.C.RT-qPCR檢測(cè)不同因子組合在24 h對(duì)于PAM中CD163表達(dá)的促進(jìn)作用；B.D.RT-qPCR檢測(cè)不同因子組合在48 h對(duì)于PAM中CD163表達(dá)的促進(jìn)作用。1.Control;2.6F(the combination of six factors);3.6F-M-CSF;4.6F-GM-CSF;5.6F-IL-10;6.6F-IL-3;7.6F-TGF-β1;8.6F-Dexamethasone;9.Control;10.Dexamethasone;11.Dexamethasone+M-CSF;12.Dexamethasone+GM-CSF;13.Dexamethasone+IL-10;14.Dexamethasone+IL-3;15.Dexamethasone+TGF-β1.*.P<0.05;***.P<0.001;ns.No significant difference.A.RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by different factor combinations at 24 h.B.RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by different factor combinations at 48 h.圖2 RT-qPCR檢測(cè)不同因子組在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)于PAM中CD163受體表達(dá)的促進(jìn)作用Fig.2 RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of PAM stimulated by different combination of factors at different time

通過(guò)減因子試驗(yàn)確定了6F中對(duì)CD163受體的促進(jìn)作用主要來(lái)源于dexamethasone，同時(shí)M-CSF和GM-CSF在6F中起到抑制作用。為了進(jìn)一步明確促進(jìn)CD163受體表達(dá)的最優(yōu)的因子組合，在dexamethasone基礎(chǔ)上進(jìn)行了添加單因子試驗(yàn)，如圖2C和2D所示，在dexamethasone基礎(chǔ)上添加IL-10、IL-3和TGFβ1與單獨(dú)dexamethasone的促進(jìn)作用一致，相反在dexamethasone基礎(chǔ)上添加M-CSF和GM-CSF相比于dexamethasone單因子，CD163受體顯著下調(diào)表達(dá)。

2.3 Dexamethasone協(xié)同IL-10顯著促進(jìn)PAM中CD163的表達(dá)

如圖3A所示，免疫熒光染色時(shí)，原代PAM中CD163表達(dá)具有明顯異質(zhì)性，根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可以將PAM分為CD163受體表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(CD163high)細(xì)胞，CD163受體表達(dá)弱陽(yáng)性(CD163low)細(xì)胞，CD163受體表達(dá)陰性(CD163null)細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分選，獲得3種細(xì)胞類群。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在3種細(xì)胞類群中CD163受體表達(dá)水平具有顯著差異(圖4A)。隨后對(duì)巨噬細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子PU.1在3種細(xì)胞群體中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CD163low和CD163null細(xì)胞群體中PU.1的表達(dá)水平與未分選的細(xì)胞基本一致(圖4B)，這就排除了原代分離的PAM中存在其他類型細(xì)胞干擾的可能。而在CD163high細(xì)胞群體中PU.1的表達(dá)略高于未分選細(xì)胞。

原代PAM免疫熒光染色，DAPI染核(藍(lán)色)，標(biāo)尺為100 μm。Immunofluorescence staining of CD163 protein expression levels of primary PAM cells.Nucleus was stained with DAPI (blue).Scale bar,100 μm.圖3 免疫熒光檢測(cè)原代PAM異質(zhì)性Fig.3 The heterogeneity of primary PAM was detected by immunofluorescence

1.未分選細(xì)胞對(duì)照；2.CD163陰性細(xì)胞；3.CD163弱陽(yáng)性細(xì)胞；4.CD163強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞。*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；ns.無(wú)顯著差異。A.RT-qPCR檢測(cè)分選后的CD163強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，CD163弱陽(yáng)性細(xì)胞，CD163陰性細(xì)胞中CD163的表達(dá)情況，對(duì)照為未分選的PAM。B.RT-qPCR檢測(cè)分選后的CD163強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，CD163弱陽(yáng)性細(xì)胞，CD163陰性細(xì)胞中PU.1的表達(dá)情況，對(duì)照為未分選的PAM。1.PAM without sorting;2.CD163null cells;3.CD163low cells;4.CD163high cells.*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;ns.No significant difference.A.RT-qPCR analysis of CD163 expression levels of CD163high cells,CD163low cells and CD163null cells.The control group was PAM without sorting.B.RT-qPCR analysis of PU.1 expression levels of CD163high cells,CD163low cells and CD163null cells.B.The control group was PAM without sorting.圖4 熒光定量PCR檢測(cè)原代PAM異質(zhì)性Fig.4 The heterogeneity of primary PAM was detected by RT-qPCR

鑒于原代PAM表達(dá)CD163的異質(zhì)性，本研究對(duì)于試驗(yàn)組的細(xì)胞添加單因子以及dexamethasone+IL-10進(jìn)行異質(zhì)性評(píng)價(jià)。免疫熒光染色結(jié)果與定量檢測(cè)結(jié)果一致，6個(gè)因子都能在一定范圍內(nèi)促進(jìn)CD163的表達(dá)。其中單因子中dexamethasone對(duì)CD163的促進(jìn)作用最為顯著；因子組合中，dexamethasone+IL-10對(duì)CD163的表達(dá)促進(jìn)作用最為顯著。dexamethasone+IL-10對(duì)于CD163的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)為CD163high和CD163low細(xì)胞數(shù)量的增多，同時(shí)CD163null細(xì)胞數(shù)量的減少(圖5)。

1.對(duì)照；2.巨噬細(xì)胞集落刺激因子；3.粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；4.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；5.白介素10；6.白介素3；7.地塞米松；8.地塞米松+白介素10。a.CD163陰性細(xì)胞；b.CD163弱陽(yáng)性細(xì)胞；c.CD163強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞。1.Control;2.M-CSF;3.GM-CSF;4.TGF-β1;5.IL-10;6.IL-3;7.Dexamethasone;8.Dexamethasone+IL-10.a.CD163null cells;b.CD163low cells;c.CD163high cells.圖5 不同誘導(dǎo)條件下PAM免疫熒光染色中不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of the number of cells with different fluorescence intensity in PAM immunofluorescence staining under different induction conditions

3 討論

CD163受體作為巨噬細(xì)胞中特異性受體蛋白，在正常生理?xiàng)l件下，主要參與到血紅蛋白的代謝，從而防止游離血紅蛋白的毒性和氧化作用[5]。表達(dá)CD163受體的巨噬細(xì)胞具有抗炎功能，常出現(xiàn)在炎癥部位，因此可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[17]。同時(shí)PAM中的CD163作為重要的病毒受體蛋白能夠介導(dǎo)PRRSV和ASFV入侵宿主的靶細(xì)胞。目前對(duì)豬CD163的表達(dá)調(diào)控的研究還很少。本研究篩選到一系列可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中CD163受體表達(dá)的因子，在原代PAM中進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)單因子的篩選發(fā)現(xiàn)PAM中CD163受體表達(dá)的最強(qiáng)誘導(dǎo)因子是dexamethasone，在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的促進(jìn)倍數(shù)都大于30倍，遠(yuǎn)高于其他因子。dexamethasone是一種人工合成的糖皮質(zhì)類固醇，是一種有效的類固醇類抗炎藥物，主要通過(guò)結(jié)合CD163啟動(dòng)子區(qū)的3個(gè)糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而促進(jìn)CD163受體的表達(dá)[18]。因子組合測(cè)試結(jié)果顯示，在mRNA水平，dexamethasone以及在dexamethasone基礎(chǔ)上添加IL-10、IL-3和TFG-β1對(duì)于CD163的促進(jìn)作用基本一致。在蛋白質(zhì)水平，免疫熒光染色結(jié)果顯示，dexamethasone+IL-10對(duì)于CD163的促進(jìn)作用最為顯著，IL-10是一種抗炎性的細(xì)胞因子。有研究表明IL-10也能促進(jìn)CD163的表達(dá)[16]，圖1的單因子測(cè)試也證明了這一點(diǎn)。相同的結(jié)論在單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中已經(jīng)被證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在dexamethasone+IL-10能夠提升單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中CD163的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PRRSV-1的感染和病毒復(fù)制[20]。

原代PAM屬于終末分化細(xì)胞，具有明顯的異質(zhì)性和可塑性[19]，因此原代分離的PAM由于不同的分離程序，不同豬的年齡而造成批次與批次之間變異性較大，對(duì)于相關(guān)試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性造成很大影響。在dexamethasone+IL-10組合下，PAM群體中CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，達(dá)到92.4%。而CD163陰性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，降低為8.6%，顯著降低了PAM表達(dá)CD163的異質(zhì)性?？傊琩examethasone+IL-10組合不僅能夠顯著促進(jìn)PAM中CD163受體的表達(dá)水平，而且能夠降低原代PAM中CD163表達(dá)的異質(zhì)性，為進(jìn)一步研究CD163的表達(dá)調(diào)控提供基礎(chǔ)。