惡性胸水細(xì)胞蠟塊在肺癌診斷及治療中的應(yīng)用研究

郭業(yè)兵，王木森，高菲

（東阿縣人民醫(yī)院，山東 聊城 252200）

漿膜腔積液是惡性腫瘤（尤其是惡性間皮瘤、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤）常見的臨床癥狀[1]。近年來，漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)涂片結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)已在臨床中廣泛應(yīng)用于判斷病變性質(zhì)、鑒別腫瘤來源及應(yīng)用于腫瘤的分期、分級。大多數(shù)惡性腫瘤可發(fā)生胸水轉(zhuǎn)移，與肺轉(zhuǎn)移或胸膜侵犯有關(guān)，尤其以肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌最為常見。據(jù)報(bào)道惡性胸水中大約48.6%是由肺癌引起[2]，肺癌患者約17%首診時(shí)伴有胸水[3]，而一旦出現(xiàn)胸水往往提示病情已處于晚期，絕大部分已失去手術(shù)機(jī)會。目前，EGFR/ALK/ROS1靶基因狀態(tài)及PD-L1的表達(dá)情況已成為晚期肺癌個(gè)體化治療及評估預(yù)后的重要參考指標(biāo)。本研究對惡性胸水細(xì)胞蠟塊行免疫組化檢測進(jìn)行組織學(xué)分型，并對確診的肺腺癌的細(xì)胞蠟塊檢測EGFR/ROS1/ALK等靶基因狀態(tài)及檢測PD-L1表達(dá)狀態(tài)，評估在臨床靶向治療、免疫治療的應(yīng)用前景及價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 搜集2014年4月—2021年8月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬東阿醫(yī)院存檔的胸水細(xì)胞蠟塊429例，其中男272例，女157例，男女比例為1.73：1.0，年齡41～91歲。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞蠟塊的制備 胸水標(biāo)本離體后盡快送至病理科（最長不超過2 h）,靜置15～30 min后，取底部液體50～100 mL，3000 r/min離心5 min，提取沉淀物進(jìn)行細(xì)胞學(xué)涂片，然后棄凈上清液，加入3.7%中性緩沖福爾馬林固定15 min，再2500～3000 r/min離心2 min，將沉降物轉(zhuǎn)移到專用濾紙上，最后常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、制片，HE染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 免疫組化在Roche BenchMarK GX 全自動免疫組化機(jī)上進(jìn)行，選取CK7、CK20、Villin、TTF-1、NapsinA、CDX2、p40、P63、GATA3、GFDP-15、PAX-8、WT-1、CR、D2-40、CD68、ER、PR、CK19、PDL1等不同的抗體組合進(jìn)行免疫組化檢測。VENTANA PD-L1（SP263）asssy購自羅氏公司，其余抗體購自福建邁新生物技術(shù)有限公司，均常規(guī)設(shè)置陰、陽性對照。

1.2.3 細(xì)胞蠟塊DNA、RNA的提取 對于部分確診肺腺癌患者的細(xì)胞蠟塊，常規(guī)脫蠟，提取脫氧核糖核酸或核糖核酸用于基因檢測。使用廈門艾德核酸提取試劑盒提取核酸，美國Q5000超微量分光光度計(jì)測定DNA、RNA濃度及OD260/280比值。

1.2.4 EGFR、ROS1、ALK基因檢測 融合類檢測通過在融合位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并結(jié)合一步法RT-PCR方法對樣本中ALK和ROS1融合基因進(jìn)行檢測。突變類檢測是通過ADx-ARMS技術(shù)檢測樣本DNA中的EGFR基因。共檢測25個(gè)突變位點(diǎn)和21種融合類型。試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。EGFR、ROS1、ALK基因檢測均在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國賽默飛公司）中進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織學(xué)類型 429例胸水細(xì)胞蠟塊中惡性胸水138例，常規(guī)富集細(xì)胞、甲醛固定、脫水、透明，石蠟包埋、HE染色，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)保持完好（圖1、圖2）。結(jié)合138例惡性胸水患者的病史及細(xì)胞學(xué)涂片，選取不同的抗體組合，進(jìn)行組織學(xué)分型。對于不明來源的腺癌，常規(guī)采用TTF-1（圖3）、NapsinA、CK7、CK20、Villin進(jìn)行初篩，酌情聯(lián)合應(yīng)用CDX2、GATA-3、PAX-8、CA125、WT-1、GCDFP-15、Tg、P504S、PSA等對大部分腺癌能做到準(zhǔn)確組織學(xué)分型。CD56、CgA、SyN、KI-67組合能鑒別出小細(xì)胞癌。P40、p63、CK5/6、CK19、p16能篩出鱗癌，但原發(fā)部位要結(jié)合臨床。138例病例的組織學(xué)類型：肺腺癌97例，小細(xì)胞癌10例，鱗狀細(xì)胞癌3例，乳腺癌6例，胃癌5例，卵巢癌3例，子宮漿液性癌1例，子宮癌肉瘤1例，骨髓瘤1例，膽管癌1例，未知來源10例。

圖1 血性背景中癌細(xì)胞呈腺樣、乳頭狀分布（×20）

圖2 癌細(xì)胞乳頭狀排列，異型顯著（×40）

圖3 EnVision法顯示癌細(xì)胞彌漫核表達(dá)TTF-1（×20）

2.2 基因檢測結(jié)果 對確診的84例肺腺癌行ARMS熒光PCR檢測，其中57例檢測到突變基因：53例EGFR突變（突變率63.1%）、1例ROS1融合突變（突變率1.19%）、3例ALK融合突變（突變率3.57%）。具體突變類型：EGFR 20號外顯子插入突變3例（見圖4），T790M突變1例，19del突變16例，L858R 突變32例，G719X突變1例，其中有2例雙突變（G719X+ S768 I和 L858R+T790M ）。ROS1 融 合 (SLC34A2-ROS1/CD74-ROS1/EZR-ROS1) 1例，ALK融 合（EML4-ALK）3例。陰性 27例。PDL1 共檢測5例，陽性表達(dá)率 40%（2/5例），1例TC值 40%，1例 TC 值5%。

圖4 ARMS-PCR檢測： EGFR突變陽性擴(kuò)增

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者出現(xiàn)惡性胸水時(shí)，大多提示已處于腫瘤晚期，常常無法通過手術(shù)獲取組織標(biāo)本，不能明確病理診斷，導(dǎo)致后續(xù)的治療難以繼續(xù)。脫落細(xì)胞學(xué)是胸水檢查的一種臨床應(yīng)用多年的成熟技術(shù)，具有方便、快捷、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)檢查等優(yōu)點(diǎn)，但受細(xì)胞數(shù)量、制片技術(shù)及背景干擾等影響，通常影響診斷及后續(xù)檢測，難以滿足臨床的需求。

近年來胸水沉渣包埋并結(jié)合免疫組化在臨床中得到廣泛的應(yīng)用，不僅能更好的富集細(xì)胞并且可以多次取材，細(xì)胞沉淀過程中能保持良好的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，常規(guī)染色細(xì)胞無皺縮及變性，可進(jìn)行免疫組化標(biāo)記，結(jié)合細(xì)胞涂片及臨床信息確定腫瘤來源及組織學(xué)分型。本研究對138例惡性胸水患者，結(jié)合病史及細(xì)胞學(xué)涂片，選取不同的抗體組合，進(jìn)行組織學(xué)分型，大多數(shù)都能獲得準(zhǔn)確的組織學(xué)類型。當(dāng)然，免疫組化也是有局限性的，本組病例中仍有10例未能明確來源。

多年來肺癌一直居腫瘤死亡率的首位。其靶向藥的研發(fā)及上市一直是所有癌種中最多、最快的。2021年《第5版非小細(xì)胞肺癌NCCN指南》推薦肺癌患者應(yīng)監(jiān)測包括EGFR/ROS1/ALK/PD-L1在內(nèi)的十大靶點(diǎn)。目前FDA批準(zhǔn)的用于非小細(xì)胞肺癌的靶向和免疫藥物共有29款，尤其在2021年5月21號FDA批準(zhǔn)Rybrevant（代號JNJ6372）應(yīng)用于EGFR 20號外顯子插入突變的肺腺癌，是對這部分患者研發(fā)的首款靶向療法，具有里程碑式的意義。肺癌中80%～85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其EGFR基因的突變率為10%～35%，ALK、ROS1融合發(fā)生率分別為3%～7%、2%[4]。EGFR突變狀態(tài)可以指導(dǎo)EGFR-TKI的用藥。而ALK和ROS1基因融合突變患者也可從ALK/ROS1抑制劑中明顯獲益。近幾年腫瘤免疫治療發(fā)展迅猛，PD-L1、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）等指標(biāo)對治療反應(yīng)具有較高的預(yù)測意義，尤其PD-L1是目前免疫治療應(yīng)用最廣泛的標(biāo)志物[5-6]。目前國內(nèi)已有批準(zhǔn)多種PD-1/PD-L1抑制劑用于一、二線或以上治療[7]，PD-L1免疫組化檢測可作為指導(dǎo)晚期非小細(xì)胞肺癌患者接受帕博利珠單抗單藥或聯(lián)合治療的伴隨診斷。《2019版中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）原發(fā)性肺癌診療指南》和《中國非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療專家共識（2019版）》一致推薦將EGFR、ROS1、ALK等基因檢測與PD-L1檢測列入同等重要地位。目前多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，與組織學(xué)樣本相比較，用細(xì)胞蠟塊檢測腫瘤細(xì)胞 PD-L1表達(dá)，結(jié)果具有很高的一致性[8-11]，可以作為無法取得組織學(xué)標(biāo)本患者的很好的替代品。在實(shí)際臨床工作中很多晚期患者，由于體質(zhì)差、腫瘤分期晚，喪失了手術(shù)機(jī)會，甚至不能耐受支氣管鏡和穿刺活檢，無法獲取滿意的病理標(biāo)本，阻礙了下一步治療。而胸水細(xì)胞蠟塊可以很好的填補(bǔ)這一空白。EGFR與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)有差距，其原因可能與樣本量較少和異質(zhì)性有關(guān)。PD-L1 共檢測5例，1例TC值40%，1例TC值5%,可作為免疫治療的輔助診斷加以參考。

胸水細(xì)胞蠟塊在實(shí)際操作中也存在一些缺點(diǎn)，臨床如果能通過手術(shù)切除、CT引導(dǎo)下穿刺等手段獲取組織學(xué)標(biāo)本，則優(yōu)先采用組織學(xué)樣本進(jìn)行檢測，但對于大部分難以獲取組織學(xué)標(biāo)本或不能耐受手術(shù)的晚期患者來說，細(xì)胞蠟塊是一種可靠有效的替代方案，值得在臨床工作中推廣。