亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體礦質(zhì)元素的影響

周連玉， 焦 璐， 巨家升， 蔣 霞， 羅巧玉，2，4， 馬學蘭

(1.青海師范大學 生命科學學院，青海 西寧 810008;2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008；3.青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室，青海 西寧 810008;4.高原科學與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海 西寧 810008)

Epichlo?屬(其無性系以前稱為Neotyphodium屬)屬于禾草內(nèi)生真菌，在植株體內(nèi)系活體營養(yǎng)，其與宿主植物形成一種互利共生的關系，可為宿主帶來多種有益性能[1]；而在體外培養(yǎng)時菌絲生長比較緩慢[2]，不同菌株生物學特性具有一定差異[3-4]。中華羊茅 (Festucasinensis) 隸屬早熟禾族(Poeae)羊茅屬(Festuca)，是一種內(nèi)生真菌侵染率高的多年生草本植物，從植株不同組織中分離出多種內(nèi)生真菌菌株，對菌株的生物學與生理學特性、生物活性、形態(tài)多樣性及分類學地位進行了研究[5-8]。礦質(zhì)元素是生物生長代謝相關酶的重要成分之一，一些研究已證實礦質(zhì)元素影響著真菌菌體生長以及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9-10]，而合適的礦質(zhì)元素種類以及濃度梯度能促進菌絲體生長、提高一些礦質(zhì)元素或其他成分的含量[11-12]。硒是人體和動物必需礦質(zhì)元素之一，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等多種功能[13]。許多真菌能富集硒并將無機態(tài)硒轉(zhuǎn)化為菌體中有機態(tài)硒[14-16]。硒對真菌的研究主要集中在生長特性、形態(tài)變化、抗氧化活性、硒代謝以及化學組分等方面[14-20]。當培養(yǎng)液中添加不同濃度硒化合物時，真菌在生長過程中菌絲體或發(fā)酵液的營養(yǎng)成分會發(fā)生一系列的變化[21-24]，而適宜的硒濃度能明顯提高某一特定的營養(yǎng)物質(zhì)含量。廖日權(quán)等[25]以富硒總量為指標，對內(nèi)生真菌富硒培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。有關內(nèi)生真菌體外培養(yǎng)菌絲體積累其他礦質(zhì)元素的研究目前報道還較少。本研究基于前期對中華羊茅內(nèi)生真菌菌株Epichlo? sp.生物活性的研究，通過液體培養(yǎng)中華羊茅內(nèi)生真菌，初步探討在不同亞硒酸鈉濃度條件下，菌絲體生長和礦質(zhì)營養(yǎng)吸收的動態(tài)變化，旨在為理解內(nèi)生真菌富硒特性，進而為進一步開發(fā)利用植物富硒內(nèi)生真菌資源，利用內(nèi)生真菌改良牧草品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 中華羊茅內(nèi)生真菌菌株保存于青海師范大學微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基；②液體菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然；③發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 30.0 g，酵母膏 2.5 g，蛋白胨 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸和硝酸為優(yōu)級純，氫氧化鉀、硼氫化鉀、鐵氰化鉀、過氧化氫、鹽酸羥胺等試劑為分析純。立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-35HD，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(250B，金壇市富華儀器有限公司)；超凈工作臺(CJ-1S，天津市泰斯特儀器有限公司)；可見分光光度儀(V-5100，金壇市富華儀器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-C，金壇市天竟實驗儀器廠)；離心機(TD5A，湖南赫西儀器裝備有限公司)；微波消解儀(MD8H，奧譜勒儀器有限公司)；原子熒光光度儀(AFS-933，北京吉天儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備液體菌種 250 mL三角瓶中裝入100 mL液體菌種培養(yǎng)基，接入直徑4 mm中華羊茅內(nèi)生真菌菌塊3塊，25 ℃，130 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，所得發(fā)酵液即為液體菌種。

1.2.2 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)的影響 分別配制含0(CK)、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L亞硒酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基，并將95 mL培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶，接種5 mL液體菌種，25 ℃培養(yǎng)，分別于4、5、6、7、8周收集發(fā)酵液，4 000 r/min離心收集菌絲體和上清液，菌絲體經(jīng)蒸餾水洗滌3次，60 ℃烘干后稱干質(zhì)量。

1.2.3 測定指標 菌絲體樣品中加入消解液，經(jīng)微波消解后的消化液采用鉬藍比色法[26]、四苯硼鈉法[27]、偶氮氯膦III法[28]、鄰菲啰啉比色法[26]，分別測定磷、鉀、鈣、鐵的含量，采用GB5009.93-2017(第一法氫化物原子熒光光譜法)測定硒含量[29]。

1.2.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標準誤表示，各項指標釆用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。采用Spearman雙側(cè)檢驗礦質(zhì)元素之間的相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體干質(zhì)量的影響

由表1可知，培養(yǎng)時間和亞硒酸鈉濃度顯著或極顯著影響著中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲體干物質(zhì)。當培養(yǎng)時間相同時，對照組菌絲體干物質(zhì)顯著高于加亞硒酸鈉組(P<0.05)，且隨著亞硒酸鈉濃度的增加菌絲體干物質(zhì)逐漸減少(表2)。當培養(yǎng)4～8周時，不加亞硒酸鈉或亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L條件下，一般5～6周時菌絲體干物質(zhì)達到最大值，隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長菌絲體干物質(zhì)出現(xiàn)減少趨勢。

表1 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體干物質(zhì)和礦質(zhì)元素影響的方差分析

表2 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體干物質(zhì)的影響

2.2 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體磷含量的影響

亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲體磷含量的影響達到顯著(P<0.05)或高度顯著水平(P<0.001)(表1)。表3結(jié)果表明：當亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2、0.4 mmol/L時，菌絲體磷含量均于第6周達到最大值，其含量顯著高于其他培養(yǎng)時間(P<0.05)。當亞硒酸鈉濃度為0.3 mmol/L時，培養(yǎng)第4周的菌絲體磷含量明顯低于其他培養(yǎng)時間(P<0.05)。但不加亞硒酸鈉時，菌絲體磷含量于第4周、第5周達到最高值。當培養(yǎng)4～8周時，添加亞硒酸鈉組菌絲體磷含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體磷含量的影響

2.3 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鉀含量的影響

不添加亞硒酸鈉時，菌絲體鉀含量在不同培養(yǎng)時間差異不顯著；而在其他情況下差異顯著(P<0.05)，或高度顯著性差異(P<0.001)(表1)。當亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2、0.4 mmol/L時，培養(yǎng)第6周的菌絲體鉀含量顯著高于培養(yǎng)時間為4周、5周、7周和8周(P<0.05)(表4)。當亞硒酸鈉濃度為0.3 mmol/L時，培養(yǎng)第5周的菌絲體鉀含量達到最大值；而不加亞硒酸鈉時，培養(yǎng)4周的菌絲體鉀含量最低。當培養(yǎng)4～8周時，添加亞硒酸鈉組菌絲體鉀含量均顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鉀含量的影響

2.4 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鈣含量的影響

培養(yǎng)時間和亞硒酸鈉濃度對菌絲體鈣含量的影響達到高度顯著水平(P<0.001)(表1)。除添加亞硒酸鈉濃度0.3 mmol/L的菌絲體于第7周鈣含量為最高值外，亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2、0.4 mmol/L培養(yǎng)至第6周的菌絲體鈣含量顯著高于其他培養(yǎng)時間(P<0.05)(表5)。當培養(yǎng)時間為4周時，添加亞硒酸鈉濃度0.3、0.4 mmol/L，菌絲體鈣含量明顯高于亞硒酸鈉濃度為0、0.1、0.2 mmol/L的菌絲體(P<0.05)。

2.5 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鐵含量的影響

亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲體鐵含量的影響見表1和表6。當不添加亞硒酸鈉時，菌絲體鐵含量在不同培養(yǎng)時間條件下不存在顯著差異；而在其他情況下均存在差異顯著或高度顯著性差異(P<0.05，P<0.001)(表1)。除了添加亞硒酸鈉濃度0.3 mmol/L的菌絲體于第4周鐵含量達到最高值外，添加亞硒酸鈉濃度為0.1、0.2、0.4 mmol/L的菌絲體均于培養(yǎng)第6周鐵含量顯著高于其他培養(yǎng)時間(P<0.05)(表6)。當培養(yǎng)液不添加亞硒酸鈉時，菌絲體鐵含量在不同培養(yǎng)時間不存在差異性。當培養(yǎng)4～8周時，對照組鐵含量均顯著低于添加亞硒酸鈉組(P<0.05)。

表5 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鈣含量的影響

表6 亞硒酸鈉濃度或培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體鐵含量的影響

2.6 亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體硒含量的影響

培養(yǎng)時間和亞硒酸鈉濃度對菌絲體硒含量的影響達到高度顯著水平(P<0.001)。當培養(yǎng)時間相同時，對照組發(fā)酵液中硒含量顯著低于添加亞硒酸鈉組(P<0.05)。在亞硒酸鈉濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長菌絲體硒含量呈先升后降趨勢(表7)。

表7 亞硒酸鈉濃度或培養(yǎng)時間對中華羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)菌絲體硒含量的影響

2.7 礦質(zhì)元素各組分之間的相關性分析

表8為菌絲體干物質(zhì)、磷、鉀、鈣、鐵和硒含量組分之間的相關性分析結(jié)果。除添加亞硒酸鈉組磷含量和硒含量存在較強的相關性，達到顯著水平(P<0.05)；磷、鉀、鈣、鐵、硒含量兩兩之間均存在極顯著的相關性(P<0.01)。對照組磷含量與硒含量之間的相關系數(shù)為0.932，達到極顯著水平(P<0.01)。

表8 中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲體干物質(zhì)和礦質(zhì)元素之間的相關性分析

3 討 論

不同營養(yǎng)成分以及不同濃度對真菌生長及礦質(zhì)營養(yǎng)吸收作用有差異[30,18]，培養(yǎng)液中添加磷酸二氫鉀明顯地影響松乳菇菌絲體干物質(zhì)以及磷、鉀、鎂、錳和鋅的吸收，而對鈣和鐵的吸收無作用；0.5 g/L的磷酸二氫鉀更能促進菌絲體生長和磷、鉀、鎂和鋅的吸收[18]。王關林等[31]發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體富硒后，礦物質(zhì)除鉻外，鈉、鈣、鐵、鋅、硒和鉬等11種元素均增加。與普通靈芝菌絲體相比，250 μg/mL亞硒酸鈉增加靈芝菌絲體鋁、鎘、鋇含量，降低鉀、銅含量，而對鐵、鈣、硼、鈉基本無影響[32]。亞硒酸鈉對雅致放射毛霉液體培養(yǎng)菌絲體中常量元素、微量元素以及有毒元素的作用各異，2 μg/mL亞硒酸鈉增加菌絲體鈉、鉀、鈣、鋅、硒、鎘含量，降低菌絲體鎂、錳、銅、鋇、鉛和銻的含量[33]。本研究發(fā)現(xiàn)添加0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L亞硒酸鈉抑制中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲體的生長，而有利于菌絲體吸收礦質(zhì)營養(yǎng)磷、鉀、鈣、鐵和硒；當培養(yǎng)5～6周時,菌絲體干物質(zhì)和礦質(zhì)元素含量達到最大值(表2、3、4、5、6、7)，這表明菌絲生長旺盛時,從培養(yǎng)體系中吸收礦質(zhì)元素的能力增強；在不同的亞硒酸鈉濃度條件下，菌絲體干物質(zhì)和礦質(zhì)元素的減少或增加幅度不同，說明物質(zhì)濃度對菌絲生長代謝有不同程度的影響；添加亞硒酸鈉的菌絲體磷、鉀、鈣、鐵、硒之間存在顯著或極顯著的正相關性(P<0.05，P<0.01)(表8)，這表明硒能促進中華羊茅內(nèi)生真菌菌絲吸收磷、鉀、鈣、鐵、硒等礦質(zhì)元素。上述研究證實了不同菌株在不同亞硒酸鈉濃度條件下菌絲體礦質(zhì)元素變化不一致，礦質(zhì)元素的吸收還與菌絲體生長狀況有關。因此，在培養(yǎng)基中添加適宜及適量的礦質(zhì)元素以提高菌絲體在生長過程富集一些有益的常量元素或微量元素，或者阻斷菌體對一些有毒金屬的富集。今后將進一步研究中華羊茅內(nèi)生真菌富硒液體培養(yǎng)菌體形成的有機硒種類以及含量。

目前，為了充分發(fā)揮內(nèi)生真菌的有益作用，構(gòu)建植物-內(nèi)生真菌共生體，林晗等[34]對千年桐幼苗接入不同內(nèi)生真菌菌株，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌菌株能提高植株地上部分磷和根系含量，接種盾殼霉屬菌株、鏈格孢屬菌株和木霉屬菌株表現(xiàn)得更加明顯；而鐮刀菌屬和生赤殼屬菌株處理的植株根系鉀含量高于葉片。中華羊茅內(nèi)生真菌共生體對礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的影響亟待進一步的研究。