基于免疫細(xì)胞探討針刺對缺血性中風(fēng)大鼠免疫調(diào)控的機(jī)制研究※

張忠平,馬政濤,張海月,叢 宇

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036）

缺血性中風(fēng)是一種臨床高發(fā)疾病,康復(fù)時(shí)間窗較長,治療有限。中風(fēng)后體內(nèi)免疫炎癥變化是影響中風(fēng)后康復(fù)轉(zhuǎn)歸的重要因素[1]。免疫細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞（Th17）分泌促炎因子白細(xì)胞介素（IL）-17,參與早期炎性反應(yīng)；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則分泌抗炎因子IL-10等,減輕外周和腦組織的促炎因子,發(fā)揮抑制炎癥的作用[2]。相關(guān)研究表明,中風(fēng)大鼠腦組織Th17細(xì)胞增多,Treg細(xì)胞減少,表明腦梗死后大鼠腦組織中Th17/Treg的平衡被破壞,免疫炎性反應(yīng)被激活[3]。Fox P3是調(diào)控Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,表達(dá)部位主要為受損的病灶及周邊區(qū)域,研究表明大鼠腦組織受損部位Fox P3的表達(dá)與腦組織受損的形成密切相關(guān)[4]。缺血性中風(fēng)后腸固有層和上皮細(xì)胞的T細(xì)胞和腸道菌群可促使腸道免疫系統(tǒng)通過釋放活性氧、氮及外肽酶等神經(jīng)毒性因子,促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性變,在中風(fēng)的病理生理中起至關(guān)重要的作用[5]。為闡明腸道免疫微生態(tài)在大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型大鼠治療中的保護(hù)機(jī)制,本研究觀察針灸干預(yù)對腦腸組織中的Fox P3和IL-17的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物專業(yè)委員會(huì)批準(zhǔn)（H20201001）。SPF級雄性Wistar大鼠50只,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號:SCXK（黑）2019-001]。8周齡,平均體質(zhì)量280 g。動(dòng)物飼養(yǎng)于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證編號:SYXK（黑）2016-008。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 激光多普勒血流儀（瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)公司,型號PeriFlux 5000）；增強(qiáng)型小動(dòng)物麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技公司,型號R540）；華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司,型號SDZ-V）；一次性無菌針灸針（0.25 mm×25 mm,貴州安迪藥械有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 所有大鼠耳部標(biāo)號,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為手法組、針刺組、電針組、空白組、手術(shù)組,每組10只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟均按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方案進(jìn)行。

2.2 MCAO模型制備 用異氟烷麻醉針刺組、手法組、電針組、手術(shù)組大鼠,在其中線頸部切開1個(gè)切口,分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈和左頸外動(dòng)脈,將1條2 mm長的魚線插入左頸內(nèi)動(dòng)脈,并通過激光多普勒血流信號確認(rèn)大腦中動(dòng)脈閉塞,2 h后拔魚線恢復(fù)灌注?？瞻捉M不執(zhí)行任何操作。

2.3 干預(yù)方案

（1）針刺組 固定MCAO模型大鼠,選取百會(huì)、膈俞、脾俞、腎俞、后三里,穴位和針刺方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]。75%酒精棉球常規(guī)消毒,術(shù)者右手持針灸針,常規(guī)針刺,行捻轉(zhuǎn)手法1 min,針下有緊滯感后,不做任何操作,留針15 min。每日1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

（2）手法組 固定MCAO模型大鼠,選穴和消毒手法同針刺組。針刺后行捻轉(zhuǎn)手法1 min,得氣后,行搓針手法,至氣滿針搖為宜,留針15 min。每日1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

（3）電針組 固定MCAO模型大鼠,選穴和消毒手法同針刺組。術(shù)者右手持針灸針,針刺后行捻轉(zhuǎn)手法1 min,針下有緊滯感后,于同側(cè)膈俞、腎俞接電針治療儀,膈俞接正極,腎俞接負(fù)極,給予斷續(xù)波,頻率2/10 Hz,時(shí)間15 min。每日1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

（4）手術(shù)組、空白組 每日固定大鼠,不做任何治療,每次15 min。每日1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

2.4 標(biāo)本采集

（1）腦組織勻漿標(biāo)本 干預(yù)14 d后,用小型動(dòng)物麻醉機(jī)吸入異氟醚麻醉各組大鼠。在顱頸交界處用組織剪刀固定并切斷大鼠顱骨,然后用剪刀將顱骨從枕孔處剪開至兩側(cè)眼眶,用彎鉗夾起顱骨,將腦組織輕輕取出,剪斷神經(jīng)及附屬組織,完整取出大腦組織。用冷鹽水沖洗、濾紙擦拭、稱重,取腦組織塊50 mg,按質(zhì)量、體積比1∶9的比例加入無菌磷酸鹽緩沖（PBS）溶液,以15 000 r/min在組織破碎機(jī)上粉碎為10%的組織勻漿,然后以3 000 rpm離心15 min,取上清液,分開包裝,－80℃保存。

（2）腸組織勻漿標(biāo)本 切斷大鼠顱骨后,立即解剖腹腔,剪取腸組織,用PBS緩沖液將糞便、血液等沖洗干凈后,剪取1.5 cm腸組織,按腦組織勻漿標(biāo)本的提取方法提取腸組織勻漿上清液,在－80℃條件下冷凍保存。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 取適量上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腸組織、腦組織中FoxP3、IL-17含量。詳細(xì)步驟按照試劑盒使用說明書。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,采用方差分析；方差不齊或不符合正態(tài)分布時(shí),以中位數(shù)（四分位間距）[M（Q）]表示,采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果 干預(yù)后,手術(shù)組腸腦組織Fox P3、IL-17含量均高于空白組（P＜0.05）,針刺組、手法組、電針組FoxP3含量高于手術(shù)組（P＜0.05）,IL-17含量低于手術(shù)組（P＜0.05）,且手法組優(yōu)于針刺組、電針組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠缺血區(qū)腦組織、腦組織FoxP3、白細(xì)胞介素-17含量比較[%,M(Q)]

4 討論

中風(fēng)常因情志失調(diào)、飲食不節(jié)導(dǎo)致臟腑陰陽失調(diào)、氣血逆犯于腦,造成腦脈阻塞而致,臨床表現(xiàn)為突然昏仆、偏癱、舌斜或失語、局部麻木等[7]。中風(fēng)相當(dāng)于西醫(yī)的缺血性腦卒中,是由各種原因引起的腦供血障礙,可對局部腦組織造成不可逆轉(zhuǎn)的損害,引起腦缺血和缺氧性壞死,從而導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[8]。目前臨床治療缺血性腦卒中采用溶栓、抗凝、降纖、降脂、神經(jīng)保護(hù)、改善循環(huán)等[9],近年來腸道免疫調(diào)節(jié)也逐漸應(yīng)用于臨床[10]。腸道免疫狀態(tài)失調(diào)是缺血性腦卒中的常見情況,目前臨床尚無特異性治療方法。近年來,中醫(yī)藥應(yīng)用于中風(fēng)后的康復(fù)治療,特別是針灸普遍應(yīng)用于臨床,療效顯著。臨床研究顯示,針刺能促進(jìn)缺血性腦卒中患者肢體功能恢復(fù),縮短康復(fù)時(shí)間,提高生活質(zhì)量[11]。

本課題組以經(jīng)絡(luò)學(xué)說為基礎(chǔ),以針刺手法為主,穴位配伍為輔,探究針刺對MCAO模型大鼠免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)按照疏通經(jīng)絡(luò)氣機(jī)、調(diào)和陰陽的治療原則選取穴位。百會(huì)通達(dá)諸經(jīng),調(diào)節(jié)百脈氣血,為治療中風(fēng)病要穴；脾俞、腎俞為脾腎的背俞穴,可調(diào)補(bǔ)先后天之本；膈俞、后三里調(diào)補(bǔ)脾胃氣血,可使氣血生化之源健旺。針刺后,應(yīng)用針刺手法保持足夠的刺激。各穴相配,手法相應(yīng),可使氣至病所,調(diào)節(jié)胃腸免疫。

腸道微生物是人體最豐富的菌群共生區(qū)室,已成為淋巴細(xì)胞種群的有效調(diào)節(jié)劑,包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞,這兩種細(xì)胞均參與腦缺血性損傷,研究表明針灸可有效調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞[12]。輔助性T細(xì)胞位于腸上皮細(xì)胞表面,具有天然免疫特性,可通過分泌IL-17,向中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等外周粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化信號,從而加重缺血性腦損傷[13]。研究表明,T細(xì)胞參與缺血性腦卒中的病理過程,但其在神經(jīng)保護(hù)過程中并不是直接作用于腦缺血組織,而是通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答系統(tǒng)發(fā)揮作用[14]。FoxP3為T細(xì)胞重要的表達(dá)物質(zhì),具有較強(qiáng)的血管調(diào)節(jié)作用,當(dāng)FoxP3表達(dá)減少,會(huì)使FoxP3介導(dǎo)的血管收縮,引起血小板聚集和釋放,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)微循環(huán)出現(xiàn)障礙,從而使腦組織血流量進(jìn)一步降低[4]。本研究結(jié)果顯示,針刺、手法可通過下調(diào)炎癥因子IL-17、上調(diào)FoxP3細(xì)胞的含量,激活免疫系統(tǒng),發(fā)揮腦保護(hù)作用,從而改善腦缺血大鼠腦組織功能,起到雙向調(diào)節(jié)腸腦的作用（P＜0.05）,其中手法組作用較為顯著。

綜上所述,針刺通過調(diào)節(jié)IL-17、Fox P3發(fā)揮對MCAO模型大鼠的腦保護(hù)作用,但還需進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步驗(yàn)證其作用；同時(shí)可進(jìn)行臨床試驗(yàn),檢測患者腸道菌群,以更加客觀地分析菌群與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)變化情況,以期為針灸從調(diào)控免疫機(jī)制方面治療腦卒中提供新思路。